糖基转移酶和糖苷酶.pptx

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1、第1页/共110页第2页/共110页一、糖基转移酶的命名与分类一、糖基转移酶的命名与分类l糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移的单糖类型进行分类的。的单糖类型进行分类的。l如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。l另外一种方法是根据序列的同源性、底物另外一种方法是根据序列的同源性、底物/产物立体化学异构性以及供体糖进行分类。产物立体化学异构性以及供体糖进行分类。l这种分类法糖基转移酶被分为这种分类法糖基转移酶被分为6666个家族及一个家族及一个未分类族。个未分类族。l所有家族只采用两种折叠方式，形成了两个所有家族只采用两种折叠方式

2、，形成了两个超家族，分别为超家族，分别为GT-A和和GT-B超家族。超家族。第3页/共110页 糖基转移酶的命名糖基转移酶的命名lGlcNAc T-I的全称为：的全称为：lUDP-N-乙酰葡糖胺乙酰葡糖胺:-3-甘露糖基甘露糖基-1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。乙酰葡糖胺转移酶。lGlcNAc T-II的全称为：的全称为：lUDP-N-乙酰乙酰葡糖胺葡糖胺:-6-甘露甘露糖基糖基-1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。乙酰葡糖胺转移酶。第4页/共110页 -1,4-Galactosyltransferase Family第5页/共110页 Fucosyltransferase Family 第6页/共110

3、页 All members of the sialyltransferase genes cloned第7页/共110页The Evolutionary History of Glycosyltransferase Genes后生动物后生动物后口动物后口动物脊椎动物脊椎动物哺乳动物哺乳动物原始昆虫原始昆虫无脊椎动物无脊椎动物非哺乳动物非哺乳动物第8页/共110页二、糖基转移酶特性二、糖基转移酶特性l一个基一个基因因 一种转移一种转移酶酶 一种连接键一种连接键l糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编码的糖基转移酶糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编码的糖基转移酶通过糖基化作用，将糖

4、基由其供体转移到受体上完成的。通过糖基化作用，将糖基由其供体转移到受体上完成的。l每个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，这就保证了在每个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，这就保证了在没有模板的情况下合成特异性的糖。没有模板的情况下合成特异性的糖。l糖链可以认为是基因的次级产物糖链可以认为是基因的次级产物,一个基因编码一个糖基转移酶一个基因编码一个糖基转移酶,一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成，一条糖链的合成就一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成，一条糖链的合成就需要一个多酶系统需要一个多酶系统,也就对应了一个基因组。也就对应了一个基因组。第9页/共110页糖基转移酶特

5、性糖基转移酶特性l糖基转移酶绝大部分是糖基转移酶绝大部分是II型膜结合蛋白，即型膜结合蛋白，即较短的较短的N-端在胞浆，有一穿膜部分通过内质端在胞浆，有一穿膜部分通过内质网或高尔基体膜，长的网或高尔基体膜，长的C-端在内质网或高尔端在内质网或高尔基体的管腔内。基体的管腔内。l有少数糖基转移酶是有少数糖基转移酶是I型膜结合蛋白，其较型膜结合蛋白，其较短的短的N-端在内质网腔，而很长的端在内质网腔，而很长的C-端则定端则定位于胞浆。位于胞浆。第10页/共110页Biological Functions of a Soluble Form of N-acetylglucosaminyltransfe

6、rase V(GnT-V)第11页/共110页Regulation of High Branching in N-linked Oligosaccharides第12页/共110页第13页/共110页大鼠不同组织中三种大鼠不同组织中三种-乙酰葡糖胺基转移酶乙酰葡糖胺基转移酶(GlcNAc T)组织组织活力活力(pmolmg蛋白蛋白h)GlcNAc T-IIGlcNAc T-IVGlcNAc T-V肾肾1840 3301.9 1.630 6脑脑660 488.7 0.738 1胃胃500 1508.2 0.725 1小肠小肠280 9917 1.568 11肺肺104 4.62.6 0.738

7、4脾脾100 2.520 821 2睾丸睾丸52 2.98.2 0.837 4心心11 1.19.4 1.410 1肝肝81 0.92.8 0.78.2 0.8第14页/共110页 三、糖基转移酶的结构域三、糖基转移酶的结构域l属于属于II-型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四个型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四个结构域。结构域。l氨基端的胞浆域，氨基端的胞浆域，一般少于一般少于2525个个(最少最少4 4个个)氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；l穿膜域，穿膜域，有少量氨基酸残基，富含疏水氨基有少量氨基酸残基，富含疏水氨基酸；酸；l颈区域，颈区域，位于内质网或高尔基体管

8、腔内，含位于内质网或高尔基体管腔内，含甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有N-糖链。糖链。第15页/共110页 糖基转移酶的结构域糖基转移酶的结构域l催化域，催化域，为管腔中的最大结构域，呈球状，为管腔中的最大结构域，呈球状，约含约含310-430310-430个个(最长可达最长可达720720个左右个左右)氨基酸氨基酸残基，为糖基转移酶最重要的催化区域。残基，为糖基转移酶最重要的催化区域。第16页/共110页克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域第17页/共110页 四、糖基转移酶的催化特性与功能四、糖基转移酶的催化特性与功能(1)(1)底物专一

9、性底物专一性l糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基转糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基转移酶的底物专一性和催化特性来决定的。移酶的底物专一性和催化特性来决定的。l对对底物专一底物专一性，性，一个酶的产物常作为下一个一个酶的产物常作为下一个酶的底物，这样就保证了糖链中糖基的特定酶的底物，这样就保证了糖链中糖基的特定顺序。顺序。l因合成的产物结构不同或合成的部位不同，因合成的产物结构不同或合成的部位不同，所用的供体和受体也不同。所用的供体和受体也不同。第18页/共110页 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性l合成糖原时，葡萄糖的供体是合成糖原时，葡萄糖的供体是UDP-Glc，合合成淀粉时，

10、则是成淀粉时，则是ADP-Glc，合成纤维素时是合成纤维素时是GDP-Glc。l对对受受体体的的专专一一性性，在在糖糖蛋蛋白白的的N-糖糖苷苷键键连连接接的的糖糖链链的的外外周周有有6 6种种不不同同的的方方式式连连接接的的N-乙乙酰酰葡葡糖糖胺胺(GIcNAc),GIcNAc),它它们们连连接接在在不不同同甘甘露露糖糖基基(Man)Man)的的不不同同糖糖基基上上，分分别别有有6 6个个不不同同的的糖糖基基转转移移酶酶负负责责它它们们的的转转移移，每每个个酶酶又又对对应应不不同的受体同的受体。第19页/共110页不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同

11、第20页/共110页人人B B血型的血型的 1-3半乳糖基转移酶对受体底物的专一性半乳糖基转移酶对受体底物的专一性第21页/共110页 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性l唾液酸化唾液酸化Lewis X四糖抗原合成时，四糖抗原合成时，一般先生成唾液酸化的一般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺，乙酰乳糖胺，再由再由-1,3Fuc T在在G1cNAc上加入上加入Fuc，而不能先合成岩藻糖化的而不能先合成岩藻糖化的N-乙乙酰乳糖胺后再加上酰乳糖胺后再加上NeuAc。因。因-2,3 NeuAc T不能以不能以-1,3岩藻糖化糖链岩藻糖化糖链为底物。为底物。第22页/共110页 糖基转移酶的催化特性糖

12、基转移酶的催化特性l糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与糖糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与糖蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除去蛋蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除去蛋白质而还原末端标记白质而还原末端标记(荧光和放射性核素荧光和放射性核素)的的底物。底物。l不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉及不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉及受体底物中接受糖基邻近的少数糖基，故一受体底物中接受糖基邻近的少数糖基，故一些人工合成的寡糖衍生物也可作为这些酶的些人工合成的寡糖衍生物也可作为这些酶的底物。底物。第23页/共110页 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性(2)(2)二价金属离子的需求二价金

13、属离子的需求l大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作为大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作为辅助因子，缺乏二价金属离子时辅助因子，缺乏二价金属离子时(如在如在EDTA存在下存在下)酶活力很低或丧失。酶活力很低或丧失。l二价金属离子中二价金属离子中Mn2+的激活作用最强，其的激活作用最强，其次是次是Co2+,Mg2+,Ni 2+。l糖基转移酶糖基转移酶 T-V不需要二价金属离子。不需要二价金属离子。第24页/共110页 五、糖基转移酶同源性和抗原性五、糖基转移酶同源性和抗原性l糖基转移酶在结构上的最大特点是不糖基转移酶在结构上的最大特点是不同糖基转移酶一级结构之间的同源性同糖基转移酶一级结构之间的

14、同源性很少，即使转移相同糖基的糖基转移很少，即使转移相同糖基的糖基转移酶也很少有同源性。酶也很少有同源性。l血型血型A抗原的抗原的GalNAc T和血型和血型B抗原抗原的的Gal T同源性达同源性达9999，在，在353353个氨基个氨基酸残基中只有酸残基中只有4 4个不同。个不同。第25页/共110页 糖基转移酶同源性和抗原性糖基转移酶同源性和抗原性l不同种属中同一糖基转移酶的同源性不同种属中同一糖基转移酶的同源性极大，其催化结构域的同源性一般均极大，其催化结构域的同源性一般均在在8080以上。以上。l如人、小鼠和兔中如人、小鼠和兔中-1,2GlcNAc T-I四个结构域的同源性分别为四个结

15、构域的同源性分别为100%100%、90%90%、80%80%和和95%95%。第26页/共110页六、糖基转移酶和疾病六、糖基转移酶和疾病l-1,3 T的活性在人体内的重现会引发自身的活性在人体内的重现会引发自身免疫反应。相反，如果人体内免疫反应。相反，如果人体内-1,4半乳糖半乳糖基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白白G(IgG)分子中的糖链半乳糖含量降低。分子中的糖链半乳糖含量降低。l它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免疫，它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免疫，其症状是类风湿。其症状是类风湿。第27页/共110页糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病

16、l细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变，如糖如糖链分支末端出现重复链分支末端出现重复N-乙酰半乳糖胺结构、乙酰半乳糖胺结构、唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化在临床唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化在临床上常用作肿瘤标记物。上常用作肿瘤标记物。l糖基转移酶就是通过影响糖链的改变糖基转移酶就是通过影响糖链的改变，而间而间接关系到癌瘤发生和发展。接关系到癌瘤发生和发展。第28页/共110页糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。l在细胞分化阶段在细胞分化阶段，如果糖基转移酶在成熟细如果糖基转移酶在成熟细胞中活

17、性很高胞中活性很高，就会产生癌变就会产生癌变，同时出现早同时出现早期的分化抗原。期的分化抗原。l多聚多聚N-乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿瘤乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重要标志。的重要标志。l这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，有这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，有利于癌细胞的进一步侵入。利于癌细胞的进一步侵入。第29页/共110页糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l与肝癌发生有关的糖基转移酶与肝癌发生有关的糖基转移酶l糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如GnT-、GnT-和和-1,6岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶。lGnT-和和GnT-能将一个能将一

18、个N-乙酰葡糖胺转乙酰葡糖胺转移至移至N-糖链五糖核心糖链五糖核心1,3和和1,6臂甘露糖上臂甘露糖上,分别形成分别形成-1,4和和1,6键，使键，使N-糖链天线数增糖链天线数增多，多，-1,6 FucT则将岩藻糖转移至糖链最则将岩藻糖转移至糖链最内侧内侧(与天冬酰胺相邻与天冬酰胺相邻)的的N-乙酰葡糖胺上形乙酰葡糖胺上形成核心岩藻糖。成核心岩藻糖。第30页/共110页糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖蛋这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖蛋白上白上，使肿瘤细胞表面性质变化使肿瘤细胞表面性质变化，导致细胞导致细胞粘附、侵袭和迁移能力改变粘附、侵袭和迁移能力改

19、变，是造成肿瘤细是造成肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重要原因。胞具有侵袭性和转移能力的一个重要原因。第31页/共110页七、糖基转移酶的应用七、糖基转移酶的应用l糖基转移酶在肝癌研究中的应用糖基转移酶在肝癌研究中的应用l恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所致恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所致肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的诊断、肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的诊断、预防预防方面有重要意义方面有重要意义。l将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞，过表达过表达的糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖基化的糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖基化,产生不同糖型产生不同糖型，通

20、过双向电泳和凝集素免通过双向电泳和凝集素免疫印迹相结合疫印迹相结合，比较转染组和非转染组糖蛋比较转染组和非转染组糖蛋白改变白改变，从而确定蛋白质和糖基化的功能关从而确定蛋白质和糖基化的功能关系系,研究研究为糖基化改变在肝癌发生中的作用为糖基化改变在肝癌发生中的作用研究奠定了基础。研究奠定了基础。第32页/共110页糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用l采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关的采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关的糖基化改变糖基化改变，并从结构上描述糖链并从结构上描述糖链，旨在将旨在将其作为乳腺癌和其他实体肿瘤诊断工具和免其作为乳腺癌和其他实体肿瘤诊断工具和免疫治疗靶点疫治疗靶点。第3

21、3页/共110页l糖基转移酶在糖基转移酶在糖糖类合成中的应用类合成中的应用l糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面都有其独特的功效。毒等方面都有其独特的功效。l现在普遍使用的糖类合成方法有两种现在普遍使用的糖类合成方法有两种：化学合成和酶促合成化学合成和酶促合成l化学合成近年来取得一些进展化学合成近年来取得一些进展，提出了一种提出了一种全自动寡全自动寡糖糖合成法合成法，但在天然复合产物中以但在天然复合产物中以一种糖代替另一种糖仍然困难。一种糖代替另一种糖仍然困难。l酶促合成酶促合成的的产量高、产物产量高、产物具有具有特异立体化学特异立体化学异构性。

22、异构性。糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用第34页/共110页糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用l糖基转移酶可作为研究糖复合物工具糖基转移酶可作为研究糖复合物工具l如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以及如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以及细胞表面糖基化修饰等。细胞表面糖基化修饰等。第35页/共110页八、八、O-GlcNAc 糖基转移酶在原核糖基转移酶在原核和真核细胞中的表达和提纯和真核细胞中的表达和提纯l南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研究所神经生化系南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研究所神经生化系合作。合作。lO-GlcNAc 糖基化修饰起到调节蛋白质的活性糖基化修饰起到

23、调节蛋白质的活性，在生命过程的许多在生命过程的许多方面起作用方面起作用(如核运输如核运输，基因转录及翻译过程基因转录及翻译过程)。lOGT 基因敲除实验表明蛋白质基因敲除实验表明蛋白质O-GlcNAc 糖基化修饰是胚胎干细胞糖基化修饰是胚胎干细胞存活和个体发育所必需的。存活和个体发育所必需的。l蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc 糖基化修饰还调节蛋白质磷酸化，蛋白质的糖基化修饰还调节蛋白质磷酸化，蛋白质的O-GlcNAc 糖基化与磷酸化修饰间存在相互竞争、相互补充的关系。糖基化与磷酸化修饰间存在相互竞争、相互补充的关系。第36页/共110页l细胞质和细胞核内的蛋白质细胞质和细胞核内的蛋白质O-G

24、lcNAc糖基糖基化和去糖基化分别由化和去糖基化分别由O-GlcNAc糖基转移酶糖基转移酶(OGT)和和O-GlcNAc 糖苷酶催化。糖苷酶催化。l蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰及其生物学糖基化修饰及其生物学意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热门意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热门的课题之一。的课题之一。l其研究目的：其研究目的：l用原核和真核细胞表达用原核和真核细胞表达OGT，并用不同的并用不同的方法从这两个系统提纯重组方法从这两个系统提纯重组OGT，获得制获得制备有活性的备有活性的OGT，用于进行用于进行O-GlcNAc糖基糖基酶功能方面的研究。酶功能方面的研究。第37页/共

25、110页研究结果研究结果l用大肠杆菌和用大肠杆菌和Hi5 昆虫细胞表达并纯化具有昆虫细胞表达并纯化具有活性的重组活性的重组OGT。l携带人携带人OGTcDNA的的PET 32a 质粒在大肠杆质粒在大肠杆菌中表达出带有菌中表达出带有1个个S-Tag 的重组人的重组人OGT 融融合蛋白，然后用与合蛋白，然后用与S-蛋白质偶联的琼脂糖凝蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得到胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得到OGT 融合蛋白。融合蛋白。l其纯化的其纯化的OGT在电泳中显现单一条带并具在电泳中显现单一条带并具有生物活性有生物活性，但其活性在洗脱后丧失。但其活性在洗脱后丧失。第38页/

26、共110页IPTG 诱导重组诱导重组OGT 在在BL 21 大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达第39页/共110页大肠杆菌中表达的重组大肠杆菌中表达的重组OGT 经经S-蛋白质凝胶纯化蛋白质凝胶纯化第40页/共110页研究结果研究结果l在在Hi5 昆虫细胞中表达的鼠肝昆虫细胞中表达的鼠肝OGT，经镍离子螯合柱纯化后经镍离子螯合柱纯化后,其比其比活性达到活性达到0.88 nmolmin-1mg-1OGT。Hi5 细胞中表达的重组细胞中表达的重组OGT 的纯化的纯化第41页/共110页甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析l利用与植物次生代谢产物糖基化相关的利用与植物次

27、生代谢产物糖基化相关的UDPG糖基转移酶的特征性保守区域糖基转移酶的特征性保守区域，设计设计了同源引物了同源引物。l以甜菊基因组以甜菊基因组DNA 为模板，为模板，PCR 扩增获得扩增获得甜菊糖基转移酶基因片段甜菊糖基转移酶基因片段。l根据获得的基因片段设计引物根据获得的基因片段设计引物GSTr 和和GSTf，分别与分别与cDNA文库的文库的T3 和和T7 通用引物扩通用引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基因。因。第42页/共110页第43页/共110页The level of expression of plant glycosyltransfe

28、rases第44页/共110页Transgenic pigs with GnT-III第45页/共110页Recombinant plant glycosyltransferases reported recently(20012004)第46页/共110页葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l葡糖基转移酶葡糖基转移酶是致是致龋龋菌的重要致病因素之一菌的重要致病因素之一，具有利用具有利用蔗糖蔗糖合成细胞外葡聚合成细胞外葡聚糖糖的催化活性的催化活性和和结合结合葡聚糖的活性葡聚糖的活性，在细菌附着和菌斑形在细菌附着和菌斑形成的过程中起着重要作用成的过程

29、中起着重要作用。l抑制抑制GTF活性活性，减少葡聚糖的产生是控制菌减少葡聚糖的产生是控制菌震斑预防震斑预防龋龋病的重要手段之一病的重要手段之一。l目的：目的：动物体内研究葡糖基转移酶多肽疫苗动物体内研究葡糖基转移酶多肽疫苗HDS 免疫原性和防龋效果。免疫原性和防龋效果。第47页/共110页葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l方法：方法：构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原HDS-KLH，多肽抗原多肽抗原HDS，葡糖基转移酶葡糖基转移酶(GTF)免疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大鼠免疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大鼠血清和唾

30、液中抗血清和唾液中抗HDS、GTF抗体；体视显抗体；体视显微镜下观察各组大鼠磨牙龋坏情况，并用微镜下观察各组大鼠磨牙龋坏情况，并用Keyes计分法计分。计分法计分。第48页/共110页葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l结果：结果：lHDS-KLH免疫组大鼠唾液、血清中抗免疫组大鼠唾液、血清中抗HDS IgG和和IgA 水平均高于对照组水平均高于对照组(P 0.05)；HDS-KLH，HDS，GTF免疫组大鼠龋免疫组大鼠龋Keyes 计分均低于对照组计分均低于对照组(P 0101)，光光滑面防龋效果最为显著。滑面防龋效果最为显著。l结论：结论：l

31、人工抗原人工抗原 HDS-KLH 能刺激机体产生针对能刺激机体产生针对GTF 的保护性免疫的保护性免疫，并减少实验大鼠龋齿并减少实验大鼠龋齿发生。发生。第49页/共110页葡糖基转移酶抗体的制备与研究葡糖基转移酶抗体的制备与研究l以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。l应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免疫应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免疫球蛋白的活性。球蛋白的活性。l经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的蛋经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的蛋黄抗体，其抗远援链球菌的效价约为一般黄抗体，其抗远援链球菌的效价约为一般IgY的的1616倍。倍。l体外模拟实验表明经远援链球菌免

32、疫的蛋黄体外模拟实验表明经远援链球菌免疫的蛋黄抗体确实有抗牙菌斑形成的能力，从而具备抗体确实有抗牙菌斑形成的能力，从而具备防龋齿的功效。防龋齿的功效。第50页/共110页第二节第二节 糖苷酶糖苷酶l糖糖苷苷酶酶(G1ycosidase)是一大类催化糖是一大类催化糖苷苷键键水水解解的酶的酶类。类。l其主要分布在动物、植物、微生物体内，其主要分布在动物、植物、微生物体内，担担负着水解各种负着水解各种糖糖苷苷、寡、寡糖糖、多、多糖糖、复杂多糖、复杂多糖以供机体以供机体利利用的生物学功能用的生物学功能。l大多数糖苷酶水解典型大多数糖苷酶水解典型O-糖苷键糖苷键，也有部，也有部分水解分水解N-糖苷键糖苷

33、键，有一些糖苷酶水解，有一些糖苷酶水解S-糖苷糖苷键键。第51页/共110页一、一、糖苷酶的分类糖苷酶的分类l按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶分按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶分为两大类：为两大类：l外切糖苷酶类（外切糖苷酶类（Exoglycosidases)：它们的作用方式是从糖链的非还原端开始，它们的作用方式是从糖链的非还原端开始，逐步将糖苷键切断，所得到的水解产物为单逐步将糖苷键切断，所得到的水解产物为单糖或双糖；糖或双糖；l内切糖苷酶类（内切糖苷酶类（Endoglycosidases)：它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物为分子量小于原来底物

34、的寡糖。为分子量小于原来底物的寡糖。第52页/共110页Exo-1-4-Beta-D-Glycanase第53页/共110页第54页/共110页二、二、糖苷酶的分布糖苷酶的分布l糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动物、糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动物、植物和微生物体内都能找到糖苷键。植物和微生物体内都能找到糖苷键。l在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各种在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各种组织器官中都有存在。组织器官中都有存在。l许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。l植物种子里有丰富的糖苷酶。植物种子里有丰富的糖苷酶。l一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相

35、当的一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相当的研究报道。研究报道。第55页/共110页三、三、糖苷酶的命名糖苷酶的命名l糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关。糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关。l底物专一性包含：底物专一性包含：l糖基一侧的专一性；糖基一侧的专一性；l糖苷键的糖苷键的-异头专一性；异头专一性；l糖苷配基一侧的专一性。糖苷配基一侧的专一性。l糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和糖糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和糖苷键的苷键的-异头专一性来命名的。异头专一性来命名的。l-葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、-葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、-半乳糖半乳糖苷酶、苷酶、-甘露甘露糖苷酶等。糖苷酶等。第5

36、6页/共110页(1)(1)糖基一侧的专一性糖基一侧的专一性(2)(2)糖苷键的糖苷键的-异头专一性异头专一性(3)(3)糖基配基一侧的专一性糖基配基一侧的专一性第57页/共110页四、四、糖苷酶的生物学功能糖苷酶的生物学功能(1)(1)分泌到细胞外的糖苷酶，参与营养物质的分泌到细胞外的糖苷酶，参与营养物质的胞外消化吸收过程。胞外消化吸收过程。(2)(2)细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体中有一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞内中有一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞内的糖复合物。的糖复合物。(3)(3)参与糖链的合成，如在糖蛋白生物合成过参与糖链的合成，如在糖

37、蛋白生物合成过程中，参加程中，参加N-型糖链的型糖链的“剪枝剪枝”，“修剪修剪”成较短分支成较短分支(Man3GlcNAc-Asn)结构，然结构，然后再由糖基转移酶加上新的糖基，形成不同后再由糖基转移酶加上新的糖基，形成不同结构的糖链。结构的糖链。第58页/共110页第59页/共110页第60页/共110页第61页/共110页Biological Roles of N-glycanase in Cells第62页/共110页第63页/共110页第64页/共110页五、一些常见的五、一些常见的糖苷酶糖苷酶l-D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶l-D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶l-D-木糖苷酶木糖苷酶l,-鼠李糖

38、苷酶鼠李糖苷酶l -D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶l-D-葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、淀粉麦芽糖酶。酶、淀粉麦芽糖酶。l唾液酸酶唾液酸酶(神经氨酸酶类神经氨酸酶类)。第65页/共110页一些常见的一些常见的糖苷酶糖苷酶l-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l-D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 l -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶l-D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶l -L-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶第66页/共110页水解不同类型糖苷键的

39、糖苷酶水解不同类型糖苷键的糖苷酶第67页/共110页六、六、糖苷酶的制备方法糖苷酶的制备方法l黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选l将筛选用将筛选用菌株菌株Absida sp.A9r、A84r、A9r、A8r、A38r、Arr进行培养制备酶进行培养制备酶液液 以黄芪总皂苷为底物进行诱导以黄芪总皂苷为底物进行诱导 薄薄层层析法层层析法检测水解结果检测水解结果。l结果：结果：A bsida sp.A3r 菌所产酶液能较好菌所产酶液能较好的水解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷的水解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷，进进而生成糖基较少的皂苷。而生成糖基较少的皂苷。第68页/共110页l绿色木霉产生

40、的外切绿色木霉产生的外切-葡聚糖苷酶葡聚糖苷酶l从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本 加适量的无菌水温和搅拌加适量的无菌水温和搅拌取取1 ml 悬浊液悬浊液,分别涂于含有滤纸的固体筛选培养基上分别涂于含有滤纸的固体筛选培养基上待长出若干菌落后，对生长良好的菌种进待长出若干菌落后，对生长良好的菌种进行分离行分离以以羧甲基纤维素钠为底物分别测羧甲基纤维素钠为底物分别测定其所产酶活性。定其所产酶活性。l菌培养液菌培养液过滤过滤上清液上清液硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀Sephadex 柱层析柱层析DEAE2纤维素纤维素52 阴阴离子交换柱层析离子交换柱层析收集洗脱纯酶液。收集洗

41、脱纯酶液。第69页/共110页l一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离l采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖苷酶的菌株苷酶的菌株YW2112，该酶能特异性水解该酶能特异性水解神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间的糖苷键，是研究神经节苷脂结构与功能的糖苷键，是研究神经节苷脂结构与功能的重要工具酶。的重要工具酶。第70页/共110页l人参糖苷酶提取人参糖苷酶提取l目的目的：用于对人参皂苷进行改造的糖苷酶。用于对人参皂苷进行

42、改造的糖苷酶。l方法：方法：从鲜人参根中提取人参皂苷酶从鲜人参根中提取人参皂苷酶，乙醇沉淀乙醇沉淀，离子交换层析纯化离子交换层析纯化，凝胶电泳分析凝胶电泳分析，薄层薄层色谱法测酶活力。色谱法测酶活力。l结果：结果：经离子交换层析得到人参皂苷经离子交换层析得到人参皂苷-葡糖苷酶。葡糖苷酶。第71页/共110页七、七、糖苷酶的分离、纯化和测定糖苷酶的分离、纯化和测定l糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上和一般的蛋白质或酶的分离纯化没有区别。和一般的蛋白质或酶的分离纯化没有区别。l常用的方法：常用的方法：盐析盐析(硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀)、柱层析、柱层析(离子交换、

43、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、吸附凝胶过滤、亲和层析、吸附)，电泳等。电泳等。第72页/共110页一些糖苷酶的分离纯化方法一些糖苷酶的分离纯化方法来来 源源酶的名称酶的名称方方 法法刀豆粉刀豆粉-甘露糖苷酶甘露糖苷酶乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶柱层析柱层析-半乳糖苷酶半乳糖苷酶无花果无花果-半乳糖苷酶半乳糖苷酶丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换柱层析、等电聚胶柱层析、等电聚胶产气夹膜梭菌产气夹膜梭菌-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交硫酸

44、铵沉淀、凝胶过滤、离子交换柱层析、制备电泳换柱层析、制备电泳猪肾猪肾-甘露糖苷酶甘露糖苷酶硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、热处理硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、热处理(60C，15分钟分钟)、吸附、吸附柱层析、凝柱层析、凝胶过滤、制备电泳胶过滤、制备电泳第73页/共110页亲和层析法分离纯化糖苷酶亲和层析法分离纯化糖苷酶酶的名称酶的名称所用的吸附剂所用的吸附剂-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶Sepharose-ConA(刀豆凝集素刀豆凝集素)-甘露糖苷酶甘露糖苷酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶Sepharose-氨基乙酰甘露糖胺氨基乙酰甘露糖胺Sepharose-6-氨基乙

45、基氨基乙基-1-硫硫-D-吡喃半乳糖苷吡喃半乳糖苷聚丙聚丙酰胺酰胺-对氨基苯基对氨基苯基-硫代硫代半乳糖苷半乳糖苷琼脂糖琼脂糖-第74页/共110页糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定l糖苷酶活性测定：糖苷酶活性测定：(1)(1)最常用的方法是以合成的对硝基苯酚糖苷化合物作为底物，在酶作最常用的方法是以合成的对硝基苯酚糖苷化合物作为底物，在酶作用下释放出的对硝基苯酚，在碱性条件下呈黄色，可用分光光度计用下释放出的对硝基苯酚，在碱性条件下呈黄色，可用分光光度计法定量测定。法定量测定。(2)(2)把伞形酮类萤光化合物把伞形酮类萤光化合物(4-(4-Methyumbelliferone)结合到神经氨酸的结合

46、到神经氨酸的半缩醛羟基上，生成半缩醛羟基上，生成4-4-甲基伞形酮基甲基伞形酮基N-N-乙酰神经氨酸苷，用做神经乙酰神经氨酸苷，用做神经氨酸苷酸的底物。在酶作用下，释放出发萤光的氨酸苷酸的底物。在酶作用下，释放出发萤光的4-4-甲基伞形酮，用甲基伞形酮，用360360nmnm波长光作激发光，在波长光作激发光，在440440nmnm波长处测发射光，可定量地测定释波长处测发射光，可定量地测定释放的放的4-4-甲基伞形圈。甲基伞形圈。第75页/共110页糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定(3)(3)需要以合成的或天然的双糖需要以合成的或天然的双糖、寡糖、糖肽寡糖、糖肽甚至糖脂作为底物的方法。甚至糖脂作为底

47、物的方法。l有两种情况：有两种情况：l一是测定糖苷酶作用下从非还原端释放的单一是测定糖苷酶作用下从非还原端释放的单糖。用双糖糖。用双糖-O-2-L-O-2-L-吡喃岩藻糖基吡喃岩藻糖基-D-半乳半乳糖为底物。释放出来的岩藻糖，可以转变为糖为底物。释放出来的岩藻糖，可以转变为三甲基硅醚衍生物，气相色谱上测定。三甲基硅醚衍生物，气相色谱上测定。第76页/共110页糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定l二是在酶作用下，非还原端的糖基释放后，二是在酶作用下，非还原端的糖基释放后，测定其余下的部分。测定其余下的部分。l采用萤光化合物采用萤光化合物(-氨基吡啶氨基吡啶,5-,5-二甲氨基二甲氨基萘磺酰基等萘磺酰基

48、等)标记在底物糖链的还原末端，标记在底物糖链的还原末端，结合使用高效液相色谱分离，用萤光分光光结合使用高效液相色谱分离，用萤光分光光度计检测酶活性。度计检测酶活性。第77页/共110页八、八、糖苷酶的应用糖苷酶的应用l在糖链结构研究中的应用在糖链结构研究中的应用l作为工具酶的糖苷酶作为工具酶的糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l-D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 l -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶l-D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶l -L-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶第78页/共110页1 1、作为工具酶的糖苷酶作为工

49、具酶的糖苷酶l糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖复合物在生物糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖复合物在生物体内，尤其是在细胞表面携带着生物的信息，体内，尤其是在细胞表面携带着生物的信息，在分子识别过程中起着重要作用。在分子识别过程中起着重要作用。l研究其功能，首先要研究其结构。研究其功能，首先要研究其结构。l阐明一种糖复合物的糖链结构往往需要综合阐明一种糖复合物的糖链结构往往需要综合运用多种技术方法包括过碘酸氧化、甲基化运用多种技术方法包括过碘酸氧化、甲基化反应、红外光谱、核磁共振以及糖苷酶作用反应、红外光谱、核磁共振以及糖苷酶作用等。等。l糖苷酶的使用在糖链结构研究主要体现在以糖苷酶的使用在糖链结构研究主要

50、体现在以下几个方面：下几个方面：第79页/共110页(1)(1)外切糖苷酶的作用特点和底物专一性外切糖苷酶的作用特点和底物专一性l通过糖苷酶水解，能切下非还原末端的一个通过糖苷酶水解，能切下非还原末端的一个单糖，同时提供关于糖基的组成、排列顺序单糖，同时提供关于糖基的组成、排列顺序以及糖苷键的以及糖苷键的-或或-异头构型的信息。异头构型的信息。l糖基组成，用糖链完全酸水解，加上纸色谱糖基组成，用糖链完全酸水解，加上纸色谱或气相色谱分析得到的结果，可以和应用糖或气相色谱分析得到的结果，可以和应用糖苷酶所得到的结果相印证。苷酶所得到的结果相印证。第80页/共110页外切糖苷酶的作用特点和底物专一性