糖的组织化学.pptx

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1、糖 的 组 织 化 学第1页/共55页糖的分类1.单糖和双糖2.多糖：淀粉、纤维素、糖原3.粘液物质（粘多糖）中性粘多糖 酸性粘多糖4.糖蛋白 粘蛋白 氨基己糖4%糖蛋白 氨基己糖4%5.糖脂 含有半乳糖,脂肪酸,神经氨基醇第2页/共55页糖糖 原原第3页/共55页一.糖原的概念 由多糖衍化而来，是天然存在于动物组织内的多糖 分布：胞浆内 肝、心肌、骨骼肌 同种葡萄糖的聚合物 作为糖原染色的切片，必须冰冻或经特殊固定液固定后进行切片第4页/共55页二.固定剂的选用1.Carnoy（冷4）无水乙醇 60ml 防止糖原溶于水 氯 仿 30ml 增加渗透力 冰 醋 酸 10ml 抵消乙醇对组织的 收

2、缩、硬脆作用 *优点：固定迅速，保存肝糖原 第5页/共55页2.Gendre（冷4）苦味酸无水乙醇饱和液 80ml 甲醛 15ml 冰醋酸 5ml临用前混合配制第6页/共55页3.Lillie固定液（AAF）无水乙醇 85ml 冰醋酸 5ml 甲醛 10ml 固定液预冷4，固定24h后，95%乙醇脱水，包埋第7页/共55页三.固定中注意事项1.尽可能取小块新鲜组织及时固定，不用水溶性固定液2.应用含酒精的溶液作为固定液，但最好不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂的混合固定液固定为佳3.固定原理：使糖原与固定液之间相结合的蛋白质凝固，糖原被周围凝固的蛋白质膜保护起来，第8页/共55页四.显示糖原的方

3、法 1.碘染色 2.胭脂红染色*3.过碘酸-Schiff 反应 4.银浸染法第9页/共55页过碘酸-Schiff 反应Periodicacid-Schiff,PAS第10页/共55页(一）染色原理过碘酸是一种强氧化剂，能氧化糖分子，使相邻二个碳原子上的羟基（-OH）变为醛基（-COOH）第11页/共55页Schiff氏试剂是付品红（碱性品红）经SO2作用后，形成的无色溶液付品红Schiff试剂第12页/共55页当Schiff氏试剂与醛基作用后，形成含有发色基团的化合物，呈现紫红色沉淀第13页/共55页*PAS反应的基本原理 1.通过过碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基 2.醛基与

4、Schiff试剂反应显出红色沉淀第14页/共55页(二)染色步骤1.切片脱蜡至水2.1%过碘酸溶液内氧化5-10min3.流水洗5min,再用蒸馏水洗4.用Schiff试剂处理10-20min5.流水洗10min6.复染(可用Mayer明矾苏木素或甲基绿衬染细胞核)7.脱水、透明、封片第15页/共55页切片经二甲苯和各级酒精复水后，入0.5%的过碘酸溶液中作用15分钟，取出后水洗。第16页/共55页切片充分洗净后入Schiffs试剂中进行显色。作用15分钟左右，将切片取出水洗，为洗去非特异性着色，将切处理品入三级新配制的亚硫酸中进行冲洗，取出后水洗，镜检。第17页/共55页 肝糖原-PAS染色

5、 X200第18页/共55页 肝糖原-PAS+苏木素复染 X200第19页/共55页【结果】胞浆内PAS阳性物质呈紫红色，颗粒状或均质团块状，胞核呈蓝色或绿色 红色深浅反应含糖原量的多少【对照】采用淀粉酶或唾液酶消化切片 对照片PAS（-），未处理片（+）第20页/共55页PAS反应阳性物质反应阳性物质物质类别物质类别举例举例染色强度染色强度多糖多糖糖原糖原强强中性粘液物质中性粘液物质结肠杯状细胞结肠杯状细胞强强某些酸性粘液物质某些酸性粘液物质酸性非硫酸性含酸性非硫酸性含唾液粘多糖唾液粘多糖中中基底膜基底膜肾小球基底膜肾小球基底膜中中色素色素脂褐素脂褐素中中脂质脂质脑苷脂脑苷脂中中淀粉样物淀粉

6、样物淀粉样物淀粉样物弱弱软骨软骨软骨软骨弱弱真菌真菌曲菌曲菌强强脑垂体脑垂体粘液样细胞粘液样细胞强强第21页/共55页This normal glomerulus is stained with PAS to highlight basement membranes.The capillary loops of the glomerulus are well-defined and thin.第22页/共55页A888 kidney 11-PAS第23页/共55页A888 kidney 14-PAS第24页/共55页（三）PAS反应的应用证明与鉴别细胞内空泡样变性 （水变性、脂肪变性、糖原）心

7、肌病变及其它心血管疾病的诊断和研究糖原累积病的诊断及研究糖尿病的诊断及研究某些肿瘤的诊断与鉴别第25页/共55页肝细胞水变性肝细胞水变性第26页/共55页肝脂肪变性(石蜡切片)第27页/共55页肝脂肪变性(冰冻切片)脂肪特染：苏丹III第28页/共55页糖原累积症第29页/共55页 PAS（+）PAS（-）肝细胞癌 胆管癌 横纹肌瘤 颗粒细胞肌母细胞瘤 Ewing肉瘤 骨的网织细胞肉瘤 第30页/共55页（四）注意事项1.过碘酸溶液与Schiff试剂均可反复使用多次，用后密封放入冰箱4保存2.新鲜配成的溶液与应用过的作用时间不同，刚配成的作用时间短，以后逐渐延长3.过碘酸溶液在作用前应与室温接

8、近，温度太低，造成氧化不全，影响效果4.Schiff试剂如呈淡红色，则应弃去重配第31页/共55页5.Schiff试剂配法很多，区别不大，可以随意选用6.Schiff试剂作用时，染色缸必须加盖，不然Schiff试剂将因SO2消失而失效第32页/共55页Schiff试剂 碱性复红 1g 1N盐酸 20ml 偏重亚硫酸钠 1g 重蒸馏水 200ml第33页/共55页粘粘 液液 物物 质质(粘粘 多多 糖糖)第34页/共55页 人体的各种腺体及其他许多组织、细胞，如结缔组织、纤维母细胞、软骨基质等都能合成和分泌粘液物质，统称为粘多糖 或粘液第35页/共55页分类中性粘多糖酸性粘多糖 1.硫酸化粘液物

9、质 结缔组织 （强）上皮 （弱）2.非硫酸化粘液物质 含己糖醛酸的结缔组织粘液物质 含唾液酸的上皮粘液物质 第36页/共55页粘液物质染色在诊断中的应用1.用于一般粘液性病变的观察2.肿瘤的诊断与研究：用显示粘液的染色方法进行观察和鉴别第37页/共55页胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃肠上皮化生或肠型胃癌细胞分泌酸性粘液 -AB-PAS染色区分中性与酸性粘多糖酸性粘多糖含有硫酸基团和羧基。用阳离子染料与酸性基团结合形成盐键而显色。利用染液不同的PH值及不同的电解质浓度，可以区别酸性粘多糖的二种基团 -HID-AB法第38页/共55页1.不同PH的竞争性抑制 PH2.5时，二种酸性粘多糖均被奥蓝着色

10、 PH1.0时，仅硫酸粘多糖着色第39页/共55页2.电解质浓度与粘液物质着色的关系 MgCl2浓度 显示物 0.06M 羧酸和硫酸化粘液 0.3M 弱和强硫酸化粘液 0.5M 强硫酸化粘液 0.7M 强硫酸化结缔组织粘液 0.9M 硫酸角质第40页/共55页 显示糖分子和酸性基团的 组化方法第41页/共55页1.奥蓝-过碘酸Schiff氏法（AB-PAS）【目的】鉴别胃粘液（中性粘多糖）和肠粘液（酸性粘多糖）；对鉴定肠上皮化生有一定意义第42页/共55页【染色原理】奥蓝是一种水溶性氰化亚钛铜盐，带有阳电荷，与组织中的酸根结合形成盐键。AB-PAS法：首先酸性粘多糖为奥蓝染色，不再与PAS发生

11、反应；仅中性粘多糖为PAS阳性第43页/共55页【染色步骤】1.石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗2.1%奥蓝的醋酸（3%）液染30分钟（PH约2.5）3.蒸馏水洗4.1%过碘酸液氧化5-10min5.蒸馏水洗6.Schiff试剂作用10-30min7.流水洗10min8.脱水，透明，封片第44页/共55页Alcin blue染色液：奥蓝1g，蒸馏水97ml，冰醋酸3ml 临用前过滤使用，调节PH2.5-3之间【结果】中性粘多糖（胃粘液）呈红色，酸性粘多糖（肠粘液）呈蓝色，酸性和中性混合粘液呈紫红色第45页/共55页 AB-PAS X100第46页/共55页AB-PAS X200第47页/共55页2.

12、高铁双胺-奥蓝法（HID-AB）法【目的】主要用于鉴别硫酸化粘多糖和唾液酸粘多糖，对确定肠化生类型有一定价值正常胃粘膜上皮，十二指肠腺中性粘液小肠氮乙酰化唾液酸粘液大肠氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘液第48页/共55页肠型胃癌 唾液酸粘液 硫酸粘液弥漫型胃癌 中性粘液高分化腺癌 硫酸粘液中低分化腺癌 唾液酸粘液大肠型化生 硫酸粘液小肠型化生 不含硫酸粘液第49页/共55页高铁双胺染液 N，N-二甲基-间-苯二胺二盐酸盐 120mg N，N-二甲基-对-苯二胺二盐酸盐 20mg 溶于预热至25的蒸馏水50ml中，再加入60%FeCl3.6H20 1.5ml (PH1.4-1.5)第50页/共55页【

13、染色原理】二胺盐离解后带阳电荷，与硫酸化粘液物质结合成复合物而显色。该反应缓慢，需加入FeCl3作为催化剂 FeCl3的作用 -使二胺盐氧化形成棕黑色阳离子色原，加快染色 -使染色液的PH降至1.4 以后奥蓝（PH2.5）把羧基化的唾液酸粘液染成蓝色 第51页/共55页【染色步骤】1.切片脱蜡至水2.蒸馏水洗3.入双胺溶液 28 18-24小时4.自来水稍洗，蒸馏水洗5.入3%冰醋酸水溶液（PH2.5）3min 6.奥蓝染液30min7.流水洗5min8.蒸馏水洗9.脱水，透明，封片第52页/共55页【结果】硫酸粘液呈棕黑色，含羧基的唾液酸粘液呈蓝色，中性粘液不着色第53页/共55页胃 -Spicer高铁双胺法 X200第54页/共55页感谢您的观看！第55页/共55页