流式细胞分析分选原理.pptx

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1、流式细胞术的原理流式细胞术的原理流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。第1页/共54页流式细胞仪与显微镜流式细胞仪与显微镜光源激光自然光、灯光、氙(汞)灯对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子承载工具载(盖)玻片鞘液及流动室检测信号 光学信号形态及染色放大方式PMT，放大电路目镜X物镜统计人工，200计算机，5000结果简单，单参数多参数，综合分析第2页/共54页 基本原理基本原理流路流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPL

2、E 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路光源检测信号光电倍增管PMT HV电路放大电路HV及GAIN 增益A/D转换统计：计算机第3页/共54页流式细胞仪流式细胞仪光路光路流路流路电子电子软件软件第4页/共54页流路流路光路光路电路电路/电子电子软件软件第5页/共54页 流流流流 路路路路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 m 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦第6页/共54页FLOW CELLInjector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid第7页/共54页流路流路光路光路电路

3、电路/电子电子软件软件第8页/共54页光光 路路光源光源检测信号检测信号 散射光信号散射光信号FS:前向角散射光前向角散射光SS:侧向角散射光侧向角散射光(90度散射光度散射光)荧光信号荧光信号荧光染料荧光染料光学滤片光学滤片 颜色补偿颜色补偿第9页/共54页 光光光光 路路路路光源与通过的细胞聚焦在同一点上 激光 空冷 488nm blue,633nm red,325nm UV,514nm green,水冷Innova300系列Innova70系列固态第10页/共54页检测信号检测信号第11页/共54页 散射光信号散射光信号散射光信号散射光信号前向散射光前向散射光前向散射光前向散射光(FS)

4、FS)FS)FS)FS-Forward(Angel Light)Scatter在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及 optical homogeneity 有关FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小 第12页/共54页前向散射光前向散射光第13页/共54页第14页/共54页 散射光信号散射光信号散射光信号散射光信号 侧向散射光侧向散射光侧向散射光侧向散射光SS-Side(Angel Light)Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器 SS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及 optical homog

5、eneity 有关SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少,核质比 第15页/共54页侧向散射光侧向散射光第16页/共54页第17页/共54页第18页/共54页90 Degree Scatter0 200 400 600 8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSide Scatter ProjectionLight Scatter GatingScale第19页/共54页 光路光路光路光路-荧光信号荧光信号荧光信号荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.

6、利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号第20页/共54页荧光染料的特性荧光染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)第21页/共54页Fluorescence emitted by each fluorochrome is usually detected in a unique fluorescence channel.The specificity of detection is controlled by the wavelength selectivity of optical filters and mirrors.第22页/共54页Absorp

7、tion spectrum:Range over which a fluorescence compound may be excitedEmission spectrum:Range of emitted wavelengths for a particular compound第23页/共54页5 Color Single Laser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7第24页/共54页4 Color Single Laser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5第25页/共54页常用荧光染料的特性常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色

8、FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1)488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色 橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC 633 670第26页/共54页 光路光路光路光路-滤片特性滤片特性滤片特性滤片特性 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroic filter)第27页/共54页标准带通滤片标准带通滤片 band pass 光源光源通过的光

9、谱通过的光谱630/30 nm BP615-645 nm light 第28页/共54页SourcelightPassedlightCertain colorsabsorbedAbsorbancefilter第29页/共54页第30页/共54页488 DL488 BK550 DL525 BP600 DL575 BP640 DL620 BP675 BP第31页/共54页Unique 4-Color Single Laser DesignAir-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForw

10、ard ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1(FITC)575BP FL2(RD1)620BP FL3(ECD)675BP FL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL第32页/共54页PC7Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1(FITC)575BP FL2(RD1)675BP(PC5)750BP FL

11、4(PC7)488DL488BK550DL600DL 700DL第33页/共54页第34页/共54页With Thanks to Dr.Frank SchniedersGentherapie Gruppe Abteilung Molekulare Zellbiologie Institut fr Medizinische Biochemie und MolekularbiologieUniversittsklinikum Hamburg-EppendorfEGFP,EYFP and 7-AADWith EPICS XLTM and EXPO32TM ADC-SoftwareHEK293Huma

12、n EmbryonalKidney Cells 293Filter SetBP 510LAF21BP 550LAF30Dichroic Mirror 525DRLPCell Viability with 7-AADHEK293-cells with EYFP TransfectionHEK293-cells with EGFP TransfectionMixture of EGFP-and EYFP-transfected HEK293-CellsEGFP.Enhanced Green Fluorescent Protein(Ex 488;Em 507 nm)EYFP.Enhanced Yel

13、low Fluorescent Protein(Ex 513;Em 527 nm)7-AAD.7-Aminoactinomycin(Viability Stain;Ex 546;Em 647 nm)第35页/共54页emission intensitywavelengthFLBFLA颜色补偿颜色补偿第36页/共54页减法颜色补偿减法颜色补偿减法补偿去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误 BD FACSCalibur补偿试剂FITCPECorrectCorrectOver-compOver-compFITCPEUnder-compUnder-compFITCPE第37页/共54页全矩

14、阵颜色补偿全矩阵颜色补偿全矩阵在每个PMT上对于每一个荧光计算“叠加荧光素”的比率通过矩阵去除或加上信号EPICS XLCytomics FC500Gallios/NaviosCD45-ECD第38页/共54页流路流路光路光路电路电路/电子电子软件软件第39页/共54页电路及电子系统电路及电子系统电路及电子系统电路及电子系统-光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管Photomultiplier tube(PMT)将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 第40页/共54页不同的脉冲信号被转换成数字通道不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程的过程 第41页/共54页第42页/共5

15、4页单参数直方图单参数直方图第43页/共54页第44页/共54页流路流路光路光路电路电路/电子电子软件软件第45页/共54页软件软件基于Windows 平台软件界面简单，易学易用目前流式获取和分析最友好的软件包，涵盖所有数据和图形处理功能易于与医院内LIS系统相连直观拖拽方式调节电压、补偿，支持时时/自动/脱机补偿支持多文件分析报告，内置FlowPage功能，方便中文临床报告的生成和输出PRISM浓缩柱形图功能便于结果统计，兼容Office，支持PDF内置质控功能第46页/共54页Quickset直观的电压直观的电压调节调节第47页/共54页QuickComp直观的补偿调直观的补偿调节节补偿前

16、补偿前补偿后补偿后第48页/共54页PRISM浓缩柱形图浓缩柱形图 一张图上显示多达1024个表型组合结果（十色分析，210分析组合）将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上 能直接读出各种阴性或阳性组合的结果 清晰直观且便于数据的保存颜色点图组合2122332346245102561526721271045210第49页/共54页直接打印或输出PDF格式FlowPage打印页上的图形和软件工作区中的图形同步，当您拖拽一个新的数据到工作区时，打印页中的图形也会随之自动更新便捷的便捷的FlowPage中文模板报告功能中文模板报告功能第50页/共54页PPTExcelword数据输出方式灵活数据输出方式灵活-兼容兼容Office系统系统强大的数据兼容性，直接输出至Word、Excel、PPT中第51页/共54页强大的兼容性，易于与医院强大的兼容性，易于与医院LIS系统相系统相连连第52页/共54页第53页/共54页感谢您的观看！第54页/共54页