染色体与DNA复制.pptx

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1、第1页/共124页验证半保留复制的实验1958年Meselson-Stahl实验实验第2页/共124页第3页/共124页 复制的起点方向和速度 复制结构复制结构-复制叉复制叉复制子（复制子（replicon)通常把生物体的复制单位称为通常把生物体的复制单位称为-第4页/共124页第5页/共124页复制的方向-单向、双向1、E.coli定点、双向对称复制。定点、双向对称复制。2、T7在近一端的在近一端的17处开始，向两端延伸。处开始，向两端延伸。3、枯草杆菌枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。有固定的起始点，双向不对称复制。4、质粒质粒R6K早期为单向复制，复制了约早期为单向复制，复制了约1

2、/5基因组进行时双向复制。基因组进行时双向复制。5、质粒质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制。有固定起始点，但却为单向复制。6、mtDNA进行进行D（displacedloop）环复制）环复制7、真核真核有多个复制起点（有多个复制起点（i），双向等速复制），双向等速复制。第6页/共124页举例：大肠杆菌复制起始点复制速度第7页/共124页复制的几种主要方式虽然DNA 均以半保留进行复制，但因DNA在细胞内的存在形式不同，复制叉部位复制方式也不同。主要有：1、线性双链DNA2、环状双链DNA第8页/共124页 线性DNA双链的复制线性线性DNADNA的末端序列的合成，可能是完全独立的过程

3、。的末端序列的合成，可能是完全独立的过程。目前有目前有4 4种假设：种假设：1 1、线性、线性DNADNA的转变为的转变为环形环形。2 2、线性、线性DNADNA的末端形成的末端形成发夹结构发夹结构。3 3、末端、末端加头或接尾加头或接尾。4 4、与蛋白质结合、与蛋白质结合引发合成引发合成。第9页/共124页举例：腺病毒DNADNA的复制腺腺病病毒毒DNA全长35937bp线性双链，两端各有反向重复顺序103162bp，两末端各有50bp为复制起点。其复制是以单单链链置置换换（stranddisplacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。第10页/共124页第11页/共124页

4、第12页/共124页腺病毒新DNA链合成-蛋白质引物 第13页/共124页环状DNADNA双链复制依环型DNA的复制过程的复制过程中间物结构中间物结构有有3种：种：1、型复制型复制2、滚环式复制（、滚环式复制（型复制）型复制）3、D型复制型复制第14页/共124页1、型复制模式型复制模式双向复制双向复制 第15页/共124页E.coli3H-T培养物与放射自显影实验培养物与放射自显影实验第16页/共124页2、滚环复制模型1968年Gilbert提出，要点（1）共价延伸；）共价延伸；（2）模板链和新合成的链）模板链和新合成的链分开分开;（3）不需）不需RNA引物，在正引物，在正链链3OH上延上

5、延（4）只有一个复制叉）只有一个复制叉;（5）形成多联（）形成多联（concatemer）;第17页/共124页 滚环复制的电镜照片第18页/共124页。滚环复制模式第19页/共124页3 3、D D环复制模式环复制模式 单向复制一种特殊单向复制一种特殊形式形式第20页/共124页三种DNA复制的特征对比中间物结构中间物结构模板模板方向方向1、型复制型复制型型双链环状分子两条链双链环状分子两条链双向双向2、型复制型复制型型双链环状分子一条链双链环状分子一条链单向单向3、D型复制型复制D型型双链环状分子两条链双链环状分子两条链单向单向第21页/共124页2.42.4 原核生物和真核生物 DNAD

6、NA复制的特点原核生物原核生物DNADNA复制的特点复制的特点 以大肠杆菌基因组以大肠杆菌基因组DNADNA复制为例：复制为例：基因组基因组DNADNA为双链双向为双链双向型等速复制型等速复制第22页/共124页 E.coli双链复制的起始1、主要发生oriC区域。2、在oriC序列上(245bp)进行复制起始，由形成引发复合物开始，需要6种蛋白质装配成复合物，使环状超螺旋摸板转变为双链广泛解旋的形式。反应是在9kb和13kb的重复序列上。3、DnaA首先结合在oriC序列的4个9kb重复序列上。然后 DnaA作用于3个13kb重复序列，使这几个位点的DNA融化解链，形成开放复合物。4、前引发

7、复合物能是DNA oriC区域解链约60bp，在 oriC区域终止，并引发一段RNA引物。第23页/共124页第24页/共124页第25页/共124页复制起始点解链第26页/共124页复制起始区的结构特点（1）富富含含AT，这这可可能能和和双双链链易易于于解解开开起起始始复复制制有关；有关；（2）含有多个）含有多个回文结构回文结构（914个个GATC）8个个GATC较保守较保守,CATC中的中的“A”已甲基化已甲基化;（3）具有）具有4个个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此此顺顺序序的的右右侧侧毗毗邻邻区区域域有有两两个个启启动动子子，其其可可能能的的作作

8、用用是是：转转录录产产生生引引物物；产产生生复复制制必必要要的的蛋蛋白白；产产生生调调节节功功能能的的RNA；起起转转录录激激活活作用。作用。第27页/共124页 DNA双螺旋的解链 复制时，DNA双链解开形成复制叉。此过程有许多蛋白质和酶参与完成。重要的酶和蛋白质有：（1）单链结合蛋白（SSB）（2）DNA解链酶（DNA helicase)（3）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)第28页/共124页单链结合蛋白SSB（single-strandbindingprotein)又称为称为双螺旋去稳定蛋白双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizingprotein）由1

9、77个aa组成，在E.coli 中以四聚存在,分子量为74KDa。在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。第29页/共124页 DNA解螺旋酶解螺旋酶是拓扑异构酶型酶。具有ATPase活性，催化DNA解链，放松负超螺旋。有两类：一是在滞后链解螺旋酶二是在前导链解螺旋酶第30页/共124页第31页/共124页 第32页/共124页 解旋酶(helicase)第33页/共124页复制叉移动带来的拓扑学问题第34页/共124页 旋转酶引入负超螺旋的模型 第35页/共124页复制的引发 引发酶（primase)：一种特殊

10、的RNA聚合酶 引物：RNA片段 引发体：6种蛋白质（n,n,nDnaB,C)和I共同组成 引发过程：前导链引发 后随链引发 第36页/共124页 RNA引物引物酶催化合成RNA引物。不同生物RNA引物长度不同。原核生物：174和 E.coli为2-5b 真核生物：5-10b M13、G4：20-30b第37页/共124页 引物酶与RNA聚合酶引物酶即RNA聚合酶，可从头合成引物。例如：大肠杆菌的引物酶分子量60KD，有染色体基因dnaG编码引物合成长10-60个b.第38页/共124页第39页/共124页 第40页/共124页冈崎片段与半不连续复制 半不连续复制假说 1968年,日本冈崎（O

11、kazaki)Okazaki)利用放射性同位素示踪培养大肠杆菌实验而证实，提出了DNA半不连续复制模型。第41页/共124页半不连续复制要点：1、复制叉的两条摸板链合成新生链的方式不同，即前导链是连续合成的，后随链是不连续合成的；2、前导链的连续合成总是领先于不连续合成的滞后链；第42页/共124页第43页/共124页补充：滞后链复制的回环模型回环模型：DNA双链在复制叉初同时进行复制，在滞后链摸板形成一个环。证据：回环模型解释第44页/共124页第45页/共124页第46页/共124页 复制的终止1、链的终止不需要许多蛋白质的参与。2、当子链延伸达到terminus region（ter，带

12、有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（ter utilization substance）来完成的。Ter-Tus复合物能阻挡复制叉前移，等到相反方向的复制叉到达后，在拓扑异构酶的作用下，使复制叉解体，释放子链。第47页/共124页 复制陷阱第48页/共124页聚合酶 DNA DNA聚合酶的特点和种类聚合酶的特点和种类 DNA聚合酶的共同特点共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外还有其它功能。

13、第49页/共124页 DNA聚合酶的种类DNA聚合酶-校正酶，切除修复酶DNA聚合酶-酶活性低DNA聚合酶-主要复制酶DNA聚合酶-SOS修复酶DNA聚合酶-SOS修复酶第50页/共124页表表 E.coli 中的中的三种三种DNA聚合酶聚合酶 DNApolDNApolDNApol结结构构分子量分子量109KD90KD900KD构成构成单体单体单体单体异多聚体异多聚体分子数分子数/细胞细胞400？10-20酶酶活活性性：53聚合酶聚合酶+35外切酶外切酶+53外切酶外切酶+(可切单链可切单链)突突变变体体突变位点突变位点polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dn

14、aT突变表型突变表型修复有缺陷修复有缺陷能修复能修复阻止复制阻止复制第51页/共124页 DNA聚合酶I的发现和结构是第一个被鉴定出来的DNA聚合酶。是1956年kornberg(昆伯格）从大肠杆菌中分离出来的。又称为kornberg酶分子量109KD的单链-单体酶。有polA基因编码。第52页/共124页 DNA聚合酶I的结构第53页/共124页DNA聚合酶I的主要位点DNADNA聚合酶有聚合酶有6 6个个结合位点：结合位点：(1)(1)模板结合位点；模板结合位点；(2)(2)引物结合位点；引物结合位点；(3)(3)引物引物3 3/OHOH结合位点；结合位点；(4)(4)底物底物dNTPdN

15、TP结合位点；结合位点；(5)5(5)5/33/外切酶结合位点；外切酶结合位点；(6)35(6)35校正位点。校正位点。第54页/共124页 第55页/共124页 DNA聚合酶的功能 1.53聚合功能2.35外切活性外切活性3.53外切活性4.内切酶活性第56页/共124页第57页/共124页第58页/共124页DNA聚合酶与Klenow大片段来源：是DNA聚合酶（Klenow酶）经枯草杆菌蛋白酶水解成2个片段，大片段为7600，小片段为3400。将大片段为7600称谓Klenow大片段功能：具有53聚合功能和35外切活性第59页/共124页 第60页/共124页 DNA聚合酶的结构全酶由多个

16、亚基（10种22个）组成，即222 2 2 2/2 2 2 其中组成核心酶，其余为辅助蛋白。第61页/共124页 DNA聚合酶的亚基组成第62页/共124页 真核生物真核生物DNADNA复制的特点复制的特点特点：1、有多个复制起始点；2、各个起始点上只能复制起始一次；3、复制的起始需要原点识别复合（ORC）；4、复制叉移动速度慢；5、有15种以上DNA聚合酶。第63页/共124页 真核生物DNA的复制真核生物DNA的复制与原核生物的区别：1、多个复制起始位点；2、不同的复制单元不同时启动；3、复制受调控；第64页/共124页真核生物DNA聚合酶哺乳动物有5种（、）主要酶是DNA聚合酶和第65页

17、/共124页第66页/共124页 真核生物端粒DNA 复制1、端粒是染色体末端的一种特殊结构，是染色体头部和尾部重复的DNA。2、端粒的存在是为了维持染色体的稳定，没有端粒,则末端暴露,易被外切酶水解，据报道说端粒与生命长短有关。3、端粒DNADNA是用端粒酶来合成的，端粒酶中含有RNA模板，用来合成端粒.第67页/共124页端粒DNA的序列结构1、端粒DNA的3端是由数百个串联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列。例如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。2、端粒DNA序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排

18、乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。第68页/共124页端粒酶(telomerase)由蛋白质和RNA两部分组成，其中RNA作为合成端粒DNA的模板，端粒酶是目前所知唯一携带RNA模板的逆转录酶，具有种属特异性。例如四膜虫的端粒酶，其RNA部分含159个核苷酸，其中有一段序列为5-CAACCCCAA-3可作为合成端粒DNA3端GT 丰富序列-GGGGTT-模板。人端粒酶的RNA含450个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板。第69页/共124页端粒酶复制是1985年发现的一种核糖核蛋白酶，由三部分组成：端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白和端粒酶逆转录酶。该酶兼有提供RNA

19、模板和催化逆转录的功能，通过一种称为爬行模型的机制维持染色体的完整。端粒酶结合后，依其RNA模板，在端粒单链3-OH为引物基础上，不断反向转录，催化其延长，到一定长度，形成G-G配对的发夹结构，3-OH端回折与互补链方向一致，端粒酶脱落，由DNA聚合酶催化，按新延伸的链为模板合成互补链。DNA末端复制变短和用端粒酶增加其长度，这两个过程处于平衡状态，所以染色体保持大致相同的长度。第70页/共124页小结 端粒酶与端粒复制特点作用：延长端粒 过程：与之互补，反转录，再互补，再转录。一次一个重复序列。分布：生殖细胞和癌细胞 （体细胞无，所以，体细胞继代培养若干代后即停止分裂甚至凋亡。）端粒功能稳定

20、末端结构，辅助末端复制。第71页/共124页 补充：真核生物DNA 复制的代表 病毒SV40 DNA复制病毒SV40 DNA有5243bp.寄生在猴细胞内，形成具有核小体结构的微染色体复制特点：1、有自身编码的T抗原参与复制，其余组分来自寄主细胞。2、T抗原有类似于oriC复制体系中的DnaA的作用第72页/共124页第73页/共124页 SV40DNA的复制起始区域第74页/共124页SV40DNA的复制起始区序列 第75页/共124页SV40DNA的复制过程1、T抗原和RF-A蛋白识别复制起始区，DNA聚合酶、引物酶结合到起始区上，开始合成异端RNA引物；2、RF-C蛋白结合到引物上，促使

21、DNA聚合酶合成前导链的一条片段；随后DNA聚合酶从前导链上解离下来，参与后滞链的合成；DNA聚合酶与RF-C作用结合到前导链的第一段3/-OH末端，继续合成前导链。第76页/共124页小结 细菌和真核复制酶比较 组成 细菌 真核复制酶 聚合酶 聚合酶进行性因子 夹子 PCNA定位因子 复合物 RF-C引物合成酶 引物酶 聚合酶去除引物 聚合酶 RNaseH1/MF-1滞后链修复 聚合酶连接酶 聚合酶连接酶解螺旋酶 DnaB T抗原消除张力 拓扑异构酶 拓扑异构酶单链结合 SSB RP-A第77页/共124页复制的调控 大肠杆菌染色体DNA的复制调控1、染色体复制与细胞分裂是同步的，但不偶连。

22、2、复制的起始与复制子的起始物位点和调节蛋白质的相互作用有关。起始物位点的突变可使复制停止导致细胞死亡。第78页/共124页大肠杆菌染色体复制的调控机制1、在复制子上。2、复制子的调控由复制起始因子和起始位点两部分组成。3、大肠杆菌DNA复制的起始点序列oriC与起始因子dnaA、dnaH等的相互作用，启动复制。第79页/共124页第80页/共124页质粒ColE1 DNA复制的调控1 1、质粒、质粒ColE1DNAColE1DNA复制从复制从RNARNA的转录的转录开始。开始。2 2、RNARNA转录的起始于转录的起始于oriori上游上游555bp555bp处。处。3 3、转录合成的、转录

23、合成的RNARNA引物有两种调控：引物有两种调控：（1 1）RNARNA（与（与RNARNA引物互补的引物互补的108b108b的的RNARNA分子）分子）-阻止阻止RNaseHRNaseH产生产生RNARNA引物的引物的3 3/-OH-OH末端；末端；（2 2）附近基因编码的蛋白质）附近基因编码的蛋白质RopRop蛋白蛋白抑制引物抑制引物的形成的形成。第81页/共124页第82页/共124页 RNA RNA的调控的调控第83页/共124页 真核生物DNA复制的调控有三个水平的调控：1、细胞生活周期水平的调控 细胞周期分为：间期 G1、S、G2 分裂期 M2、染色体复制水平的调控3、复制子水平

24、的调控第84页/共124页 细胞周期细胞周期第85页/共124页细胞周期的调控细胞周期的调控发现了细胞周期的控制机发现了细胞周期的控制机制。制。CDKCDK细胞周期蛋白依赖酶细胞周期蛋白依赖酶 cyclincyclin细胞周期蛋白质细胞周期蛋白质 CDKCDK分子可以比作引擎，细胞分子可以比作引擎，细胞周期蛋白可以比作齿轮箱以控周期蛋白可以比作齿轮箱以控制引制引 擎处于空转状态或者驱动擎处于空转状态或者驱动细胞继续细胞周期。细胞周期细胞继续细胞周期。细胞周期蛋白依赖激酶分子和细胞周期蛋白依赖激酶分子和细胞周期蛋白驱动细胞从一个阶段到下蛋白驱动细胞从一个阶段到下一个阶段。一个阶段。他们识别出了所

25、有真核生物中他们识别出了所有真核生物中调节细胞周期的关键分子，真调节细胞周期的关键分子，真核生物包括酵母菌，植物，动核生物包括酵母菌，植物，动物和人。这些发现可为人类找物和人。这些发现可为人类找到诊疗癌症的新方法。到诊疗癌症的新方法。第86页/共124页2.5 DNA的修复DNA复制时，会出现碱基错配现象，或因环境因素使DNA损伤等。在细胞内有DNA修复系统。可保证DNA损伤的修复。修复系统有：1、错配修复2、碱基切除修复3、核苷酸切除修复4、直接修复第87页/共124页1 错配修复（mismatch Repair）错配修复对DNA复制忠实性的贡献力达102-103，DNA子链中的错配几乎完全

26、都被修正，充分反映了母链的重要性。第88页/共124页第89页/共124页第90页/共124页2.碱基切除修复（Base-Excision Repair）DNA gylcosylases能特异性识别常见的DNA损伤（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化产物）并将受损害碱基切除。去掉碱基后的核苷酸被称为AP位点（apurinic or apyrimidinic）。细胞中最常见的Uracil Glycosylase就能特异性切除细胞中的去氨基胞嘧啶。第91页/共124页3.核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair）当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，由核

27、苷酸切除修复系统负责进行修复。第92页/共124页第93页/共124页4.DNA的直接修复（Direct repair）第94页/共124页第95页/共124页第96页/共124页错配修复第97页/共124页找错配碱基第98页/共124页错配修复过程第99页/共124页2.6 DNA的转座或移位第100页/共124页 转座因子或转位因子概念发现：1、20世纪40年代由美国的女遗传学家meclintock在玉米中发现的。2、60年代又在酵母和细菌中发现。概念：指基因组中可移动的控制因子。用Tn表示。最初叫插入序列（Inserted seguence)又称IS因子。第101页/共124页转位因子结

28、构特点和类型结构特点：1、两端有末端重复序列（TIR）；2、绝大多数转位因子含有开放阅读框（ORF），可能是转座酶的基因，其功能是促进转位因子的转位。3、靶序列在转位因子的两侧形成正向重复序列。第102页/共124页 第103页/共124页转位因子的类型原核生物细菌的转位因子根据结构的大小分：1、插入序列，一般小于2000bp2、复合转位子3、TnA型转位子第104页/共124页 1、细菌的插入序列 细菌的插入序列是细菌染色体和质粒的正常组分。组成：由一段DNA序列和两端重复序列组成。特点：1、只含有与转位有关的基因，不含有其他基因。2、末端序列长度一般在1525bp之间。第105页/共124

29、页 第106页/共124页 2、复合转位子复合转位子是一类复杂的转位子。组成：有两个重复序列夹着一个或多个结构基因组成。特点：1、除含有转位有关的功能基因外，还含有其它的基因如抗药性基因、抗金属离子基因、抗毒素基因。2、结构较复杂，有200020000bp第107页/共124页 第108页/共124页复合转位子基因特征 第109页/共124页3、TnA型转位子组成：含有约5000bp的转位子有关基因和抗药性基因。特点：两端没有IS序列，通常含有末端反向重复序列。例如Tn3第110页/共124页 第111页/共124页转座作用的机理1、转座时插入的靶序列（受体分子的短序列）的DNA会被复制，使插

30、入的转座子位于重复的靶序列之间。2、靶序列复制的机制可能起源于特定的内切酶所造成的粘性DNA末端。3、转座有复制性和非复制性两大类。复制性转座是整个转座子被复制，所移动和转位的是原转座子的拷贝。非复制性转座是原始转座子实体直接移位。第112页/共124页 第113页/共124页第114页/共124页转座作用的遗传学效应 转座子印发了许多遗传变异。其遗传学效应主要有：（1）引起插入突变。（2）产生新基因。（3）产生染色体畸变。（4 4）引起的生物进化.第115页/共124页 转座引起插入突变第116页/共124页真核生物中的转座子1 玉米中的控制因子发现：类型：玉米细胞内的控制因子可归纳为两大类

31、：自主性因子：具有自主剪接和转座的功能非自主性因子：单独存在时稳定，不能转座；当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时才能具备转做功能，成为与自主性因子相同的转座子。第117页/共124页Transposons in EucaryoteAc-Ds:CCbzbzIIBzBzCIBzbz无色青铜色无色理论上：实际上：稳定的紫色突变、不稳定的斑点突变Ds+Ds+DsDsDs+DsC:色素基因I：色素抑制基因Bz：紫红色Bz：青铜色Ds+：染色体上存在解离因子第118页/共124页Ds因子的存在：1、使染色体断裂，导致I基因的缺失稳定的紫色突变（Ac因子不存在时突变稳定）紫色色素抑制基因紫色基

32、因第119页/共124页插入解离紫色2、Ds因子的移动（存在Ac因子）插入到C基因中无色；从C基因解离紫色青铜色色素基因紫色基因青铜色基因插入无色第120页/共124页2、果蝇中的转座子-Copia转座子第121页/共124页第二章 思考题1、解释名词HMG蛋白C值矛盾卫星DNA复制子转座子Klenow大片段第122页/共124页第二章 思考题2、染色体的组蛋白有那些特征？3、原核生物和真核生物的基因组有何差异？4、环状双链DNA的复制依中间物的结构可分为那几类？5、DNA修复与修复酶有何关系？6、原核生物与真核生物DNA复制如何调控？第123页/共124页感谢您的观看。第124页/共124页