高通量测序技术的临床应用及质量管理21425.pdf

《高通量测序技术的临床应用及质量管理21425.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高通量测序技术的临床应用及质量管理21425.pdf（9页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、高通量测序技术的临床应用及质量管理 高通量测序技术，又称下一代测序技术（next generation sequencing，NGS），能够一次对大量核酸分子进行平行序列测定。随着测序技术的发展及成本的降低，在临床遗传性疾病基因诊断、肿瘤的诊断、靶向治疗、液体活检、感染性疾病病原体筛查等方面得到了广泛应用。由于 NGS检测步骤繁琐、流程复杂，对结果分析解读要求高，检测具有一定特殊性，在临床应用中伴随出现了许多问题，对其质量管理提出了新的挑战。一、高通量测序技术在临床上的应用 1.NGS 在遗传病诊断中的应用：NGS 技术的发展逐渐改变了遗传疾病诊断的方式。根据不同文库构建方式，可分为全基因组（

2、whole-genome sequencing，WGS）、全外显子（whole-exome sequencing，WES）、医学外显子、靶向基因测序等。传统遗传病的研究方法是从临床表型到基因型分析，即所谓的“正向遗传学”研究方法。随着 NGS 技术的发展，形成了以遗传信息为基础确定表型的“反向表型”研究方式，使临床医生能够根据个体的遗传变异准确预测疾病及相关临床表现。当同种疾病不同患者的表型因人而异时，以基因型为基础的方法能够在疾病表征完全展现前对患者进行诊断，凸显了 NGS 技术在遗传性罕见疾病临床诊断中的优势1。常用的研究方法包括：（1）使用 WES 或 WGS 分析具有相同临床特征的一组

3、患者，筛选出不同患者中的相同变异；（2）先证者与父母或其他家庭成员同时进行 WES 或 WGS分析，并根据疾病遗传模式（常染色体显性、隐性、X 连锁或新发变异）筛选出致病变异。2.NGS 在肿瘤诊断、靶向治疗以及预后监测中的应用：随着精准医学和测序技术的发展，NGS 在肿瘤的早期筛查、诊断治疗、预后评估方面显示出独特优势。NGS 可用于识别癌症中常见的基因变异，包括单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）、小片段插入缺失、拷贝数变异（copy number variation，CNV）以及某些恶性肿瘤中的融合基因2,3。目前靶向基因测序是临床实验室肿瘤诊断

4、的首选方法，与 WGS 与 WES 相比，具有测序质量高、结果易分析、成本效益低和周转时间短等优势。临床上肿瘤基因检测体外诊断产品（in vitro diagnostic product，IVD）也大都为靶向测序 panel。2017 年美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了第一个伴随诊断产品-Oncomine Dx，能够同时检测包括 BRAF、EGFR、ROS1 等在内 23 个与非小细胞肺癌相关的变异4。2018 年国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）审批通

5、过了人类 10 基因突变联合检测试剂盒，可以定性检测组织样本中 EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、HER2、MET 基因变异，能够为非小细胞肺癌、结直肠癌患者治疗方案提供参考5,6。2019 年 NMPA 又通过了人类 BRCA1 基因和 BRCA2基因突变检测试剂盒的审批，可用于卵巢癌、乳腺癌等相关肿瘤的遗传风险评估、诊疗方案选择等方面7,8。NGS 还用于液体活检中循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的检测，国内专家共识建议可应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期实体肿瘤的伴随诊断、靶向耐药机制的识别

6、9。微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）是指在癌症治疗期间或之后留在体内的少量癌细胞。MRD 检测可以用于评估疗效、监测病情预测复发风险等。临床通过 ctDNA 检测来评估肺癌 MRD 状态，研究发现超过 95%MRD 检测持续阴性的人群在随访期内肿瘤未复发10，可用于定义潜在的治愈人群。此外，使用 NGS 方法检测部分血液肿瘤患者 MRD 灵敏度能够提高到百万分之一（1个肿瘤细胞/106 健康细胞），能够更好地对患者进行风险评估和临床干预11。3.高通量测序技术在感染性疾病诊断中的应用：感染性疾病仍是全球范围发病和死亡的重要因素，病原学诊断对感染性疾病的精

7、准诊疗具有重要的意义。NGS 技术在微生物检测中的应用主要包括：靶向测序（targeted next-generation sequencing，tNGS）、WGS 和宏基因组测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）。tNGS 可用于检测多种类型的已知病原体，包括细菌、病毒、真核生物12，其优点是特异性和灵敏度高、周转时间短，缺点是检测范围有限，无法识别新的病原体或耐药位点。WGS 能够对整个病原体基因组进行测序，识别抗生素耐药谱，从而为临床用药提供依据 13。缺点是大部分细菌测序需要进行分离培养，去除其他微生物的污染。虽然 WGS 检测能

8、够准确检测已知的耐药基因，但新发突变对表型的影响给检测结果带来了许多不确定性。mNGS 能够直接检测患者标本中的所有遗传物质，包括样本中多种类型的病原体，如细菌、分枝杆菌、RNA 和DNA 病毒、酵母、霉菌等14。研究表明 mNGS 能够成功鉴别诊断多个部位的感染，包括中枢神经系统、血液、呼吸道、胃肠道、泌尿生殖系统等15。缺点是检测过程复杂，步骤繁多，缺乏标准化。由于使用人体样本直接检测，测序结果中病原体所占比例相对很少，此外，实验室环境及试剂中存在的微生物也会对结果分析造成干扰。二、NGS 在临床应用中存在的问题 不同的 NGS 平台测序技术不同，但都具有相同的基本流程：将纯化后的核酸随机

9、剪切成无数独立的小片段同时进行检测，从而降低单条序列的测序成本，同时获得海量序列信息。然而目前高通量测序的读长偏短（100600 bp），对基因组的覆盖度并不均匀，容易产生序列缺口，导致检测效能下降。同时主流高通量测序技术流程中都涉及 PCR 扩增过程，容易产生碱基错配，生成不存在的突变；并且 PCR 过程中的GC 偏好性也会造成不同区段内的覆盖度不一致。测序后产生的短序列数据需要通过生物信息分析比对后组装成长片段，对于基因组中复杂度较低的重复区域（约占基因组大小的60%），序列比对和组装困难；此外对于序列高度同源的区域（如真假基因），短序列无法区分片段来源，从而导致假阳性或假阴性的结果16。

10、NGS 技术在临床上的应用正处于不断发展阶段，其检测流程也存在一些问题。目前，临床上基于 NGS 技术的临床 IVD产品数量有限，大多数检测项目使用的是实验室自建方法（laboratory developed test，LDT），不同项目存在多种不同文库构建方法。实验过程中，手工操作步骤繁多，检测的标准化、自动化程度较低，在实际检测的诸多方面存在不稳定性，如标本的处理（核酸提取）、文库构建、测序平台特异的出错和纠错问题、临床验证/确认程序和标准化问题等，给检测结果带来一定的不确定性17。NGS 结果解读高度依赖后续生物信息学分析。目前基于NGS 数据的分析流程仍处于不断更新完善阶段，标准化程度

11、有待提高。有研究表明，同一个实验室使用不同分析流程对同一组微生物检测数据分析后得到的结果存在一定差异18。除此之外，分析软件的更新、数据库的更新、不同生信分析人员，都会在一定程度影响数据分析结果和解读。除此之外，NGS 的数据需要与现有的基因组数据库进行比对分析，结果的解释和分析也是基于已知的数据库内容，不能检测或预测未知的生物体某些致病或耐药的相关机制。如果对编码区或非编码区中改变蛋白质结构、动力学等新发现的变异的功能没有充分研究，仅通过生信预测分析很难解释变异对生物体的影响12。NGS 检测结果分析与判读往往与临床脱节，造成结果的偏差。NGS 数据处理通常由专业的生物信息分析人员进行。由于

12、缺乏临床医学背景知识，大部分生信人员更专注于数据的处理和不同算法软件的选择，往往忽视检测数据与患者临床表征的联系。一项在对 423 例遗传性视网膜病变患者研究中发现，通过对初次 NGS 检测结果阴性的患者进行二次临床表型与基因检测分析时，成功确定了 56%初次结果为阴性患者的遗传变异19，NGS 检测与临床结合能够提高检测成功率。临床实验室开展 NGS 检测需要投入许多资源。在正式开展 NGS 检测前，实验室需要根据指南要求独立完成项目的性能验证或确认，对测序结果的分析和解读需要专业的生物信息学支持，以及海量检测数据的存储问题等，都要求实验室投入大量的资源和成本，这对于许多临床实验室来说成本过

13、高。此外，目前虽然测序成本较早先有了大幅降低，但相比常规临床检测项目来说，临床 NGS 检测的成本仍然偏高，限制了多基因 panel、外显子测序和基因组测序在癌症检测和治疗中的应用20。三、NGS 临床实验室质量保证的几点建议 实验室管理需转变思维，提高质量管理意识。NGS 正处于从科学问题研究向临床检测应用转化的阶段。科学问题研究以创新和突破为目标，利用各种前沿技术手段研究有争议的问题，不断试错以期望解决问题，得到新的认识和发现。但临床检测以保证质量为目标，通过应用相对成熟的检测方法和稳定可控的流程检测患者样本，最终得到真实可靠的结果，为临床治疗提供依据。因此，实验室应建立相应的质量管理体系

14、，或是将 NGS 检测纳入现有的质量管理体系中，从人、机、料、法、环等方面进行同质化管理。不能认为 NGS检测具有特殊性，而对其区别对待。实验室应了解 NGS 技术本身存在的问题，充分认识 NGS在不同项目检测中的局限性，对项目可行性进行评估。有条件的实验室应尽量避免 NGS 检测的外送，自主开展检测。NGS检测的本地化的好处是能够通过实验室已有的质量管理体系来控制检测的工作流程，保证质量21。开展 NGS 检测前，需独立完成方法的性能验证/确认。NGS 检测分为湿实验和干实验两部分，这两部分都需要进行验证，实验室可以参照相关指南从准确度、精确度、参考范围、可报告范围、分析灵敏度、分析特异度、

15、临床验证等方面进行22,23。实验室应对不同类型的项目进行分级分类管理。采用NMPA 注册的检测产品开展的项目，已经通过了大量的临床检测验证，应用相对成熟，这类项目应该建立从核酸纯化（湿实验）到结果分析（干实验）标准化、自动化的操作和分析流程，减少检测过程中人为因素带来的不确定性。而那些处于不断发展，尚未经临床充分验证，但有强烈临床需求的项目，在有条件的实验室可以尝试进行 LDT 试点。开展 LDT 试点过程中，建议由实验室负责人对所开展的项目负主要责任，做好检测性能确认与临床应用评估，建立完善 LDT 项目的内部质量控制体系，编写从标本采集到结果解释全过程的规范化操作规程24,25。实验室需

16、重视生物信息分析流程的质量管理。不同实验室在建立和验证 NGS 生物信息分析流程方面存在一定差异，生信分析流程存在的偏差可能导致检测结果的差异，影响后续临床判断。实验室需要建立和完善内部生信分析流程，并自行完成性能验证/确认。生信分析流程验证/确认可以与湿实验同时进行评估，也可参照相关指南独立进行验证 26，当生信分析流程中某个软件或数据库发生变化时，应对整个分析流程进行重新验证。此外，建议生信分析人员具备一定的医学背景并通过专业的 NGS 数据分析培训和考核认证，并且定期参加相关培训。实验室需注重 NGS 检测结果的分析与解释与临床紧密结合。所有检测的目的都是辅助临床对疾病进行有效的诊断。N

17、GS 检测结果是否与患者临床表征一致，或者能否解释患者的疾病表现，这都需要实验室在结果判读解释时与临床密切沟通。此外，任何诊断的最终价值都是对患者临床治疗决策的影响，使患者受益。这离不开临床医生对检测结果的认可及相应治疗方案的选择。在此过程中，实验室需要与临床进行密切沟通，比如开展包括临床医生、病理学专家、分子遗传学专家及实验室技术专家等在内的多学科讨论，最终达成检测与临床判断的一致。四、展望 作为一项具有划时代意义的技术，NGS 极大推动了精准医学的发展，被应用于遗传病的筛查、单基因疾病筛查或诊断、肿瘤的临床诊断、药物基因组学检测、癌症的化疗与治疗、感染性疾病的诊断等方面，为实现患者的个体化临床诊疗奠定了基础。同时，NGS 在实际应用中也面临诸如检测流程及质量管理体系不完善、结果分析与临床脱节等问题。随着技术的不断发展与完善、相关应用指南与规范的逐步出台，相信 NGS 技术将更好地服务于精准医疗实践。