细胞工程考试复习题.doc

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1、 细胞工程复习题第一章：绪论1.细胞工程是指按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。 狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。2. 细胞培养（cell culture）和组织培养（tissue culture）都属于体外培养（in vitro culture），是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增殖。是细胞工程的最基本技术。3.动物细胞工程发展史1、细胞融合现象的发现2、动物细胞培养技术的建立，1907年，Harrison首先培

2、养了蛙胚神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞（神经纤维），他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志；3.细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生4、动物克隆技术的建立4动物细胞工程的应用1、 动物细胞培养生产医药产品（单克隆抗体)2、新品种培育3、试管动物与婴儿4、组织工程5、珍稀动物资源的保存与保护5.将目的基因在器官或组织中进行特异性高表达的基因动物称为动物生物反应器第二章1 .动物细胞工程实验室的设置无菌操作室（接种室）功能：细胞筛选、接种、培养基无菌制备要求：密封、防尘、防霉规划：更衣间、缓冲间、操作间培养与观察室功能：细胞培养、观察要求：清洁，防尘规划：观察室，培养室制备室功能：培养基

3、的初制备、提取工艺的操作、细胞培养的上游和下游技术操作要求：清洁，防尘清洗灭菌室功能：培养皿的清洗、灭菌和无菌纯水的制备要求：清洁、防尘储藏室功能：保存细胞、无菌培养基、常用液体以及消毒后的器皿等要求：清洁，防尘2.细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，用以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。细胞计数的原则：”S”型计数，遵循数上不数下数左不数右的原则。细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，以培养时间（d）为横坐标、细胞密度为纵坐标所做出的曲线。 3.细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力，和部分底物材料的相容性。4.细胞

4、活力测定方法：MTT比色法、 CCK-8 法5.细胞培养活体染色方法：1）碱性活性染料：噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胶蓝）、哑喷类（量焦油蓝、量焦油紫）、吖嗪类（中性红、詹纳斯绿）、三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）2） 酸性活性染料:台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）6.支原体污染的检测方法：相差显微镜观察、荧光染色法观察 、电镜检测 、培养检测7.污染后解决方法：使用抗生素、加温处理、使用支原体特异性血清、其他方法第四章1.接触抑制定义：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。2.密度抑制：细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，数量仍

5、在增多，但当细胞密度进一步增大时，培养液中营养成分的减少，细胞营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止细胞永生化也称不死性，是细胞获得持续生长增殖能力的特性。而恶性细胞不仅能长期增殖生长并有异体接种致瘤性。3.细胞系（cell line）是指由原代培养经初步纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。 4.细胞株（cell strain）是指细胞系经进一步的克隆化，得到的由单一细胞组成的群体。细胞系（cell line）是指由原代培养经初步纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。 5.细胞培养的常用液体:水-新鲜制备的纯水或三蒸

6、水平衡盐溶液-Hanks、PBS液等维持渗透压平衡消化液-胰蛋白酶、EDTA-Na及胶原酶溶液、消化酶抑制液-含血清培养液、大豆胰酶抑制剂pH调整液-NaHCO3、HEPES溶液抗生素液-青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素等谷氨酰胺补充液-谷氨酰胺溶液，注意其很不稳定6.传代细胞培养方法1）贴壁生长的细胞：消化法传代、直接吹打或用硅胶软刮2）悬浮细胞：直接吹打、自然沉降法细胞的冻存原则：慢速冷冻、保存温度低细胞的复苏原则快速解冻7. 细胞同步化培养方法：1）选择细胞同步化：M期细胞震摇脱落法、离心洗脱法、梯度沉降法2）诱导细胞同步化法：血清饥饿法（G1）、异亮氨酸营养缺乏法（G1）、DNA合成

7、抑制剂阻断法（S）、秋水仙素阻断法（M）8.细胞的冻存要点：消化细胞（同前），将细胞悬液收集至离心管中。 1000rpm离心10分钟，弃上清液。 沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5106/ml左右。 将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 按下列顺序降温：室温4（20分钟）冰箱冷冻室（30分钟） 低温冰箱（30 1小时）气态氮（30分钟）液氮。9细胞的复苏要点将冻存于液氮中的冻存管取出， 迅速放入37-40水浴中使其在1min内融化。 无菌操作下打开冻存管

8、，将细胞悬液吸取到培养瓶中，补足生长液 后，置37培养。待细胞贴壁（约4h）后，换培养液一次。 或取出细胞悬液至离心管中，补加10ml培养液，500-1000r/min低 速离心5min，去上清，用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置37培 养，次日后更换一次培养液。 待细胞长成单层后即可传代。第五章1.细胞融合：定义：指用自然或人工方法、使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程，又称为体细胞杂交。2.细胞融合的方法：PEG介导的融合、细胞电融合、病毒介导的融合3,.特异性杂交瘤细胞的筛选原理：通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性

9、质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。4. 单抗的制备：1）过程动物免疫与亲本细胞的选择、2）细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备、3）杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等 4）单克隆抗体的制备和冻存5）单克隆抗体的纯化抗体制备有两种方法增量培养法小鼠腹腔接种法5. 杂交瘤技术的原理及流程：用抗原免疫小鼠-免疫牌细胞、骨髓瘤细胞的培养-骨髓瘤细胞-在PEG作用下融合成杂交瘤细胞-选择培养基（HAT培养基）；未融合的的细胞死亡，杂交瘤细胞存活-阳性克隆的筛选及克隆化-克隆扩增及大量制备McAb6. 杂交瘤技术产生的3个技术关键：1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性 2）细胞融合技术 3）杂交瘤细胞的筛选

10、7单抗纯化方法盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法辛酸沉淀法第六章1.胚胎工程（embryo engineering）以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的操作，利用人工方法影响、改变动物胚胎品质发育和进程的一种生物技术。主要技术包括体外受精、胚胎切割、胚胎移植等。2.精子获能：精子离开精巢后，无使卵受精的能力，它必须经过在附睾中成熟及在雌性生殖道内停留一段时间，才具有使卵受精的能力，这种现象称精子获能。 3.顶体反应定义：精子在同卵子表面接触或与卵膜分泌的物质相遇后，精子的顶体就会发生一系列的变化。4. 体外受精（IVF）：就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。 5.胚胎移植（

11、embryo transfer，ET）一般是针对早期胚胎而言，它是指附植前的早期胚胎很容易由子宫中取出，经过人为处理，可以再送入子宫的过程，这是胚胎生物工程的基本技术。6.同期发情：胚胎移植时，供体胚胎必须与受体子宫内膜发育状态高度同步化，才能获得好效果，这个过程称为同期发情7.多精受精的阻止：透明带反应、受精膜的形成8.胚胎的收集：A 手术法收集胚胎:1）输卵管冲胚(顺向冲胚、逆向冲胚)；2）子宫角冲胚 B 非手术法收集胚胎：二路法、三路法第七章1.干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，干细胞具有两种特性：能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞；同时还能分化成为多种特定功能的体细胞

12、。2.干细胞有几个主要特征 ：干细胞本身不是终末分化细胞；干细胞能无限增殖分裂； 干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态； 干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保持为干细胞或分化为特定细胞。3.干细胞的分类：很据分化潜能大小分：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞根据来源来分: 胚胎干细胞 ESC 、 成体组织来源的干细胞 ASC 4.ES细胞生物学特性：细胞形态结构及核型、细胞的高度分化潜能 、碱性磷酸酶的表达 、胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达5. 组织工程是指应用工程学和生命科学的原理和 方法来研究正常或病理状况下哺乳动物组织的结构、 功能和生长的机制，研究开发能够修复、维持或

13、改 善损伤组织的人工生物替代物的一门学科。 第八章1.核移植定义 ：将供体细胞核移入去核的卵母细胞中,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育,使得核供体的基因得到完全复制。2.核移植目的：生殖性克隆、治疗性克隆3.治疗性克隆技术途径包括以下几个步骤：首先取病人体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞；在早期胚胎形成后，从中分离获得人ES 细胞；对ES细胞进行基因修饰和定向分化研究；4）将定向分化后的细胞移植给病人。4.核移植技术的一般程序：核受体细胞的准备、核供体细胞的准备、核移植、激活、重构胚胎的培养、胚胎移植、体细胞克隆动物的鉴定5.核移植原理：1）胚胎、胚胎干细胞、胎儿成纤维细

14、胞、成体细胞的每一个细胞核具有相同的遗传物质。2）已经发生分化的胚胎细胞核移植到成熟的卵母细胞中，因为特殊因子作用，使植入核基因表达被重新编程或调整，将“发育钟”拨回到受精状态，即恢复“全能性”（totipotent)。3）已经分化的细胞经过去分化培养后，同样具有潜在发育潜能，可以恢复全能性。6.核移植技术存在的问题A成功率低，为1-5B理论研究滞后技术研究C体细胞克隆后代可能出现老化现象D核移植技术环节尚需要不断完善第十一章1.植物组织培养：在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。2.植物组织培养的类型：愈伤组织培养、器官培养、细胞

15、培养：悬浮细胞培养和单细胞培养、原生质体培养3.植物细胞的全能性：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下如同受精卵一样，具有发育成完整植物体的潜在能力。 两个含义：1）植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息2）每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力4.细胞分化：细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。5.脱分化（dedifferentiation)：细胞分化是可逆的，分化的细胞在一定条件下，可以转变为胚性状态，重新获得分裂能力，称为脱分化。6.愈伤组织：在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。7.细胞再分化：即脱分化后的分

16、生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株。8.再分化通过两种不同途径实现(1)器官发生方式：外植体-脱分化-愈伤组织-再分化-不定芽-转管-不定根-再生植株（2）无性胚胎方式：外植体-脱分化-愈伤组织-再分化-胚状体-再生植株9.植物激素配比模式：高有利于根的形成和愈伤组织的形成适,适中有利于根的分化、低 有利于芽的形成第十二章1.快速繁殖：利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。也称微繁、快速繁殖。2.微繁技术具有以下特点：一是繁殖周期短，可加快培育

17、某些难繁殖、繁殖速度低、珍贵或濒危等类植物；二是繁殖数量大，集约化培养使每平方米面积，每年可生产数以万计的株苗，增殖速度大大提高；三是可以通过消毒，在无菌条件下进行，特别适合一些易感染病毒的植物，如马铃薯等；四是不受季节和环境条件的限制，适于工厂化生产，扩大规模，降低成本。五、杂合植物材料的大量繁殖。 六、单独繁殖雄株或雌株。3.快速繁殖程序：外植体清洗消毒接种愈伤组织不定芽的形成不定根的形成驯化移栽。4.外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。5.不定芽：除顶芽和腋芽以外，任何其他器官或组织产生的

18、芽称为不定芽6.继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。7.不定芽的三种途径：1. 腋芽形成途径。2.器官发生途径。3.胚状体形成途径。三种途径优点、缺点比较：1）腋芽途径容易成苗，对培养基要求不高，后代遗传性较为稳定，但取材受到一定限制，仅限于具有明显顶端分生组织和次生分生组织的物种。2）器官发生途径和胚状体发生途径，对培养基要求高，器官发生条件苛刻。繁殖数量不如腋芽途径高，但是来源丰富。8.微茎尖培养法脱毒原理:感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约0.11.0mm区域)则几乎不含或含病毒

19、很少、这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。9.植物脱毒方法：微茎尖培养法、珠心组织培养法、热处理法第十三章1.单倍体：植物减数分裂后形成的雌雄配子，其染色体数只有体细胞的一半，将这具有单套染色体的细胞称为单倍体细胞2.单倍体育种：将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯和二倍体，从中筛选优良个体，直接繁育成新品种，或具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料。3.看护培养法：取出花粉，制成每ml含有20个花粉粒的细胞悬浮液。看护培养时，把花药放在琼脂培养基表面上，然后在每个花药上覆盖一小块圆片滤纸。用移液管吸取1滴已准

20、备好的花粉粒悬浮液，滴在每个小圆片滤纸上培养，在25和一定光照强度下，大约一个月长出细胞群4.幼胚培养的途径有3条：1、正常胚胎发育途径 2、脱分化形成愈伤组织 3早熟萌发产生畸形苗第十五章1.体细胞胚（胚状体）：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，统称为体细胞胚。2.体细胞胚胎有以下几方面的界定： 体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚； 体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚； 体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别于离体培养中器官发生形成个体的途径。3.体细胞胚发育特点：1）与器官发生的途径比：体细胞胚发育再生植株有两个明显

21、的特点。 一是体细胞胚具有双极性 二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统联系较少，即出现所谓的生理隔离现象。 2）与合子胚相比：体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构，而合子胚在发育初期具有明显的胚柄。体细胞胚的子叶常不规范，有时具有两片以上的子叶。而合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据。与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。体细胞胚没有休眠而是直接形成植株。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。 4.狭义人工种子:是指植物离体培养中产生的胚状体，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。 广义人工种子:是

22、在胚状体或微芽（顶芽、腋芽）、微型变态器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。 5.人工种子的分类 一）根据包被情况划分为三类： 1、裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。 2、人工种皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。 3、水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。 二）根据繁殖体

23、的类型划分为两类:1、以体细胞胚为繁殖体的人工种子2、以微器官为繁殖体的人工种子6.人工种子的制备： 制作流程(以体细胞胚为例) 外植体的选择和消毒 愈伤组织的诱导 体细胞胚的诱导 体细胞胚的同步化 体细胞胚的分选 体细胞胚的包裹(人工胚乳) 包裹外膜(人工种皮)7.人工种子的优点及应用1、与利用试管苗相比，具有更多的优点：人工种子可以直接播种、可以存储避免移栽困难、可以长距离运输。2、与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；3、在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法。4、可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量

24、种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义5、对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用。8.人工种子的局限性繁殖体的诱导及其可能发生变异；人工胚乳和人工种皮还存在缺陷发芽技术尚待解决；人工种子工厂化生产配套设施、及种子成本过高等。第十六章1.植物原生质体的分离方法：1、机械分离法2、酶解分离法2.影响植物原生质体数量和活力的因素1）材料选择：离体培养植株（试管苗）、田间或温室的植株，其叶片、叶柄、茎段等均可作为原生质体分离材料，但一定要用幼嫩的植株。2）渗透压稳定剂 常用的稳定剂有两类：1）糖溶液系统2）盐溶液系统

25、3）细胞质膜稳定剂常用质膜稳定剂有：葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl22H2O、KH2PO4等。4）酶的种类和组合原生质体分离主要取决于酶的种类、浓度及组合。主要用的酶有：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 5）pH值、温度、光照3.原生质体纯化方法：过滤法 、离心法、飘浮法4.原生质体培养的意义A为细胞融合提供培养方法B为遗传转化提供受体C利用培养变异选育新品种 D用于细胞器的分离与转移 E 用于理论研究 第十七章1.染色体工程是按照预先的设计，添加、消除或替代同种或异种染色体的全部或一部分，从而达到定向改变生物遗传性状或选育新品种的目的。2.人工加倍方法1、化学诱导法：秋水仙素、细胞松弛素B 2生

26、物学的方法：3.多倍体倍性鉴定1、 核体积测量法 细胞核的大小与染色体数目成比例 2、 DNA含量测定 3、染色体计数法-最直观、最准确4.多倍体的优势：形态巨大；营养改善；生理上代谢活动增强。5.三倍体西瓜的培育过程1）四倍体母本的获得（2）三倍体获得（3）无籽西瓜获得单体植物 :2n-1、缺体植物 ：2n-2 、三体植物 :2n+1、四体植物 ：2n+2第十八章1.转基因技术与体细胞杂交技术比较体细胞杂交转基因技术相同遗传物质重组来改良生物的遗传性状 区 别整个基因组的操作和转移明确定义的基因的转移种内、部分种间进行基因转移不受生物体间亲缘关系的限制2.植物转基因技术的应用：转基因农作物：

27、提高农作物产量和改善农作物的抗虫性、抗病性、抗除草剂和抗旱、能改变花色和花形、延长保鲜期等。转基因食品：改善食品的营养价值和食用风味，如营养素含量、风味品质、延长食品储藏和保存时间。3.转基因植物的安全性A 食物安全1）含有抗虫害基因的农作物可能会威胁人类健康；2）抗性选择标记基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质，或者对宿主的代谢具有潜在毒性，并出现滞后效应或长期效应，可能会潜移默化的影响人的免疫系统。3）转基因植物可能会表达出过敏蛋白；它们都有可能是过敏体质的人产生过敏反应。B生物安全1）科学家赋予了转基因生物某些全新的性状，增强了它们与其他生物的生存竞争能力，它可能会使本地区本来生活力就

28、很纤弱的个体或物种加速从地球上消失。可能会破坏生物多样性，影响生物进化。2）具有抗虫功能的转基因植物，其体内产生的抗虫蛋白可能使害虫产生抗性，使害虫变得更加难以防治3）抗除草剂基因等可能会通过花粉传播或近缘杂交进入到杂草或半驯化植物中，结果产生出超级杂草。C环境安全1）转基因生物是自然界中不存在的“人工制造”的生物，它们所具有的强大的生存竞争将使处于脆弱平衡状态的农田生态系统等遭到破坏。2）重组DNA进入水体、土壤后，将流向何方？存活多久？他们会不会与细菌杂交，出现对人体有害的、新的致病菌？4.植物转基因技术：是指利用分子生物学技术，将人工分离和修饰过的基因导入植物的基因组中，进行表达而引起植物体的性状的可遗传修饰。