任务三细菌菌落总数的测定.ppt

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1、项目三 原料乳入厂验收检验 任务一原料乳感官检验任务一原料乳感官检验任务二原料乳理化指标检验任务二原料乳理化指标检验 任务三原料乳微生物指标检验任务三原料乳微生物指标检验 任务任务三原料乳微生物指标检验三原料乳微生物指标检验 菌落总数的测定菌落总数的测定 (GB(GB 47894789.2202201010)教学目标教学目标1、了解菌落总数测定的意义了解菌落总数测定的意义22、学习原料乳中菌落总数测定方法和原理、学习原料乳中菌落总数测定方法和原理 3 3、掌握原料乳菌落总数测定检验程序、掌握原料乳菌落总数测定检验程序 、操作步骤及、操作步骤及结果报告结果报告教学内容教学内容 一一、原料乳微生物

2、概述、原料乳微生物概述 二、二、平板计数法检验原料乳菌落总数平板计数法检验原料乳菌落总数三、三、菌落总数其他常用的检验方法菌落总数其他常用的检验方法一一、原料乳微生物概述、原料乳微生物概述 (一一)乳中微生物的种类及贮藏中的变化乳中微生物的种类及贮藏中的变化1、乳中微生物的种类、乳中微生物的种类 (1)(1)产酸菌产酸菌。指能分解乳糖产生乳酸的细菌。指能分解乳糖产生乳酸的细菌 链球菌类链球菌类：乳酸链球菌、乳酪链球菌、粪链球菌、嗜热链：乳酸链球菌、乳酪链球菌、粪链球菌、嗜热链球菌、液化链球菌。球菌、液化链球菌。乳酸杆菌类乳酸杆菌类：嗜酸乳杆菌、保加亚利乳杆菌、干酪乳杆菌、：嗜酸乳杆菌、保加亚利

3、乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌。短乳杆菌、发酵乳杆菌。明串珠菌属明串珠菌属：其次：其次 (2)(2)产气菌产气菌。这类微生物能使鲜乳发酵生成酸和产气，能。这类微生物能使鲜乳发酵生成酸和产气，能使牛乳凝固，产生多孔气泡，并产生异味和臭味。使牛乳凝固，产生多孔气泡，并产生异味和臭味。大肠菌群大肠菌群，主要有大肠杆菌和产气杆菌，这类细菌除产酸，主要有大肠杆菌和产气杆菌，这类细菌除产酸产气外，还能分解蛋白质，产生异味，评价乳细菌污染程度产气外，还能分解蛋白质，产生异味，评价乳细菌污染程度的指标之一。的指标之一。丁酸菌类丁酸菌类，主要有丁酸梭菌、魏氏梭菌等，使鲜乳产酸产，主要有丁酸梭菌、魏氏梭

4、菌等，使鲜乳产酸产气气 ，其中的丁酸，气味恶臭，所产气体量很大，可使凝固的，其中的丁酸，气味恶臭，所产气体量很大，可使凝固的鲜乳裂成碎块，形成暴烈发酵现象。鲜乳裂成碎块，形成暴烈发酵现象。丙酸细菌丙酸细菌，也能使鲜乳产酸产气，丙酸菌的发酵可使干酪，也能使鲜乳产酸产气，丙酸菌的发酵可使干酪形成网眼，并产生特殊的芳香风味，对干酪的品质有良好的形成网眼，并产生特殊的芳香风味，对干酪的品质有良好的影响。影响。(3)(3)分解蛋白质发生胨化的细菌分解蛋白质发生胨化的细菌假单胞菌属假单胞菌属，分解蛋白质能力极强，可将蛋白质，分解蛋白质能力极强，可将蛋白质形成胺和氨，并产生不良气味。形成胺和氨，并产生不良气

5、味。液化粪链球菌、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌液化粪链球菌、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌等使乳等使乳产酸与蛋白质分解同时进行。产酸与蛋白质分解同时进行。产碱杆菌属、黄杆菌属、微球菌属等产碱杆菌属、黄杆菌属、微球菌属等低温菌，能低温菌，能在低温条件下使蛋白质分解，从而使冷藏乳腐败变在低温条件下使蛋白质分解，从而使冷藏乳腐败变质并产生苦味。质并产生苦味。(4)(4)产碱菌产碱菌。使鲜乳呈碱性的细菌。使鲜乳呈碱性的细菌主要有主要有粪产碱菌和粘乳产碱菌粪产碱菌和粘乳产碱菌，粪产碱菌不常存在于肠，粪产碱菌不常存在于肠道内，由粪便混入鲜乳中；粘乳产碱菌常存在于水中，故通道内，由粪便混入鲜乳中；粘乳产碱菌常存在于水中，

6、故通常由水混入到鲜乳中，使鲜乳变为粘稠。这两种纽重子笔分常由水混入到鲜乳中，使鲜乳变为粘稠。这两种纽重子笔分解柠檬酸盐为碳酸盐，而使鲜乳呈碱性反应。解柠檬酸盐为碳酸盐，而使鲜乳呈碱性反应。(5)(5)使乳变色的细菌使乳变色的细菌 深蓝色假单胞菌产生的色素，在中性或碱性乳中呈灰深蓝色假单胞菌产生的色素，在中性或碱性乳中呈灰色，在酸性乳中呈蓝色。色，在酸性乳中呈蓝色。黄假单胞菌在乳中繁殖时，分解乳中的脂肪、蛋白质并黄假单胞菌在乳中繁殖时，分解乳中的脂肪、蛋白质并产生淡黄色色素，从而使乳呈黄色，此外黄杆菌属的细菌增产生淡黄色色素，从而使乳呈黄色，此外黄杆菌属的细菌增后也可使乳呈黄色。后也可使乳呈黄色

7、。粘质沙雷氏菌在乳中纯培养可引起红乳，但通常情况，粘质沙雷氏菌在乳中纯培养可引起红乳，但通常情况，由于其它细菌阢下量繁殖抑制了该菌生长，故红乳很少见。由于其它细菌阢下量繁殖抑制了该菌生长，故红乳很少见。(6)(6)脂肪分解菌脂肪分解菌。能使甘油酯分解生成甘油和脂肪酸的菌。能使甘油酯分解生成甘油和脂肪酸的菌群。群。主要有：荧光极毛杆菌、蛇蛋果假单胞菌、无色解脂主要有：荧光极毛杆菌、蛇蛋果假单胞菌、无色解脂菌、解脂小球菌、干酪乳杆菌、白地霉、黑曲霉、大毛霉等。菌、解脂小球菌、干酪乳杆菌、白地霉、黑曲霉、大毛霉等。脂肪分解菌。能使甘油酯分解生成甘油和脂肪酸的菌群。脂肪分解菌。能使甘油酯分解生成甘油和

8、脂肪酸的菌群。多是使牛乳和乳制品变质的细菌，尤其对稀奶油和奶油多是使牛乳和乳制品变质的细菌，尤其对稀奶油和奶油危害更大。危害更大。一部分脂肪分解菌在干酪生产上为有益菌。一部分脂肪分解菌在干酪生产上为有益菌。(7)(7)酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌鲜乳中常见酵母为脆壁酵母、膜脯毕赤氏酵母、汉逊氏酵鲜乳中常见酵母为脆壁酵母、膜脯毕赤氏酵母、汉逊氏酵母和圆酵母属及假丝酵母属等。母和圆酵母属及假丝酵母属等。脆壁酵母是生产牛乳酒、酸马奶酒巴的珍贵菌种。脆壁酵母是生产牛乳酒、酸马奶酒巴的珍贵菌种。毕赤氏酵母能使低浓度的酒精饮料表面形成干燥皮膜。毕赤氏酵母能使低浓度的酒精饮料表面形成干燥皮膜。膜脯毕赤氏酵母主要

9、存在于酸凝乳及发酵奶油中。膜脯毕赤氏酵母主要存在于酸凝乳及发酵奶油中。圆酵母属能使乳制品产生酵母味，并能使干酪和炼乳罐头圆酵母属能使乳制品产生酵母味，并能使干酪和炼乳罐头膨胀。膨胀。霉菌主要有根霉、毛霉、曲霉、青霉、串珠霉等，大多数霉菌主要有根霉、毛霉、曲霉、青霉、串珠霉等，大多数属于有害菌。属于有害菌。与乳品有关的主要有白地霉、毛霉及根霉属等，如生产卡与乳品有关的主要有白地霉、毛霉及根霉属等，如生产卡门墙尔干酪、罗奎福特干酪和青纹干酪时需要依靠霉菌。门墙尔干酪、罗奎福特干酪和青纹干酪时需要依靠霉菌。(8)(8)鲜乳中可能存在的病原菌鲜乳中可能存在的病原菌常见的有结核分支杆菌、副结核分枝杆菌，

10、布氏杆菌、常见的有结核分支杆菌、副结核分枝杆菌，布氏杆菌、溶血性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无孚溶血性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无孚L链球菌等。链球菌等。鲜乳的变质及其相关微生物鲜乳的变质及其相关微生物乳制品乳制品类型类型变质类型变质类型微微 生生 物物 种种 类类鲜乳与鲜乳与市售乳市售乳变酸及酸凝固变酸及酸凝固乳球菌、乳杆菌属、大肠菌群、微球菌属、微杆菌属、链球乳球菌、乳杆菌属、大肠菌群、微球菌属、微杆菌属、链球菌属菌属蛋白质分解蛋白质分解假单胞菌属、芽胞杆菌属、变形杆菌属、无色杆菌属、黄杆假单胞菌属、芽胞杆菌属、变形杆菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌属、微球菌属等菌属、产碱杆菌属、微球菌

11、属等脂肪分解脂肪分解假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌属、芽胞杆菌、微球菌属假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌属、芽胞杆菌、微球菌属产气产气大肠菌群、梭状芽胞杆菌、芽胞杆菌、酵母菌、丙酸菌大肠菌群、梭状芽胞杆菌、芽胞杆菌、酵母菌、丙酸菌变色变色类蓝假单胞菌（灰蓝致棕色）、类黄假单胞菌（黄色）、荧类蓝假单胞菌（灰蓝致棕色）、类黄假单胞菌（黄色）、荧光假单胞菌（棕色）、黏质沙雷氏菌（红色）、红酵母（红光假单胞菌（棕色）、黏质沙雷氏菌（红色）、红酵母（红色）、玫瑰红微球菌（红色下沉）、黄色杆菌（变黄）色）、玫瑰红微球菌（红色下沉）、黄色杆菌（变黄）变黏稠变黏稠黏乳产碱杆菌、肠杆菌、乳酸菌、微球菌等黏乳产碱杆菌、肠杆

12、菌、乳酸菌、微球菌等产碱产碱产碱杆菌属、荧光假单胞菌产碱杆菌属、荧光假单胞菌变味变味蛋白分解菌产生腐败味，脂肪分解菌产生酸败味，球拟酵母蛋白分解菌产生腐败味，脂肪分解菌产生酸败味，球拟酵母（变苦），大肠菌群（粪臭味），变形杆菌（鱼腥臭）（变苦），大肠菌群（粪臭味），变形杆菌（鱼腥臭）2 2、牛乳在室温下贮存时微生物的变化牛乳在室温下贮存时微生物的变化 新鲜牛乳在杀菌前都有一定数量的、不同种类的微生新鲜牛乳在杀菌前都有一定数量的、不同种类的微生物存在，如果放置在室温（物存在，如果放置在室温（10-21 10-21 ）下，会因微生物在乳）下，会因微生物在乳液中活动而逐渐使乳液变质。室温下微生物的生

13、长过程可分液中活动而逐渐使乳液变质。室温下微生物的生长过程可分为以下几个阶段为以下几个阶段 (1)(1)抑制期抑制期(2）乳酸链球菌期）乳酸链球菌期(3）乳酸杆菌期）乳酸杆菌期(4）真菌期）真菌期(5）胨化菌期）胨化菌期 (1)抑制期抑制期特征：牛乳中均含有多种抗菌性物质，它特征：牛乳中均含有多种抗菌性物质，它在最初阶段抑制牛乳中的微生物，使其中的微在最初阶段抑制牛乳中的微生物，使其中的微生物反而减少。生物反而减少。(2）乳酸链球菌期）乳酸链球菌期生鲜牛乳过了抑菌期后，抗菌物质减少或消失，其内的微生鲜牛乳过了抑菌期后，抗菌物质减少或消失，其内的微生物迅速繁殖，尤其是细菌的繁殖占绝对优势，分解出

14、酸性生物迅速繁殖，尤其是细菌的繁殖占绝对优势，分解出酸性物质，使乳酸度升高，致使牛乳凝块出现。物质，使乳酸度升高，致使牛乳凝块出现。这些细菌主要是乳链球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和一些蛋这些细菌主要是乳链球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和一些蛋白分解菌等，特别是乳链球菌生长繁殖特别旺盛。乳链球菌白分解菌等，特别是乳链球菌生长繁殖特别旺盛。乳链球菌分解牛乳中的乳糖产生乳酸，牛乳的酸度不断升高。如大肠分解牛乳中的乳糖产生乳酸，牛乳的酸度不断升高。如大肠菌增殖，将会有产气现象出现。由于牛乳酸度不断升高，其菌增殖，将会有产气现象出现。由于牛乳酸度不断升高，其他腐败细菌的活动就受抑制。当酸度升高至一定限度时他腐败细

15、菌的活动就受抑制。当酸度升高至一定限度时（pH4.5)，乳链球菌本身受到抑制不再继续繁殖，相反会逐，乳链球菌本身受到抑制不再继续繁殖，相反会逐渐减少，渐减少，特征：这时就有牛乳凝块出现，有时有气体产生。特征：这时就有牛乳凝块出现，有时有气体产生。(3）乳酸杆菌期）乳酸杆菌期乳酸链球菌在牛乳中繁殖，使牛乳乳酸链球菌在牛乳中繁殖，使牛乳PH下降至下降至6左右这左右这时乳酸杆菌的活动力逐渐增强。当时乳酸杆菌的活动力逐渐增强。当PH继续下降至继续下降至4.5以下时，以下时，由于乳酸杆菌耐酸力较强，尚能继续繁殖并产酸。此时还有由于乳酸杆菌耐酸力较强，尚能继续繁殖并产酸。此时还有非常耐酸的丙酸菌、孢子形成

16、菌等出现，它们会消耗部分乳非常耐酸的丙酸菌、孢子形成菌等出现，它们会消耗部分乳酸而形成一些优势菌。酸而形成一些优势菌。特征：乳液中可出现大量乳凝块，并有大量乳清析出。特征：乳液中可出现大量乳凝块，并有大量乳清析出。(4）真菌期）真菌期当酸度继续下降至当酸度继续下降至PH3.53时，绝大多数微生物被抑制时，绝大多数微生物被抑制甚至死亡，仅酵母和霉菌尚能适应高酸性的环境，并能利用甚至死亡，仅酵母和霉菌尚能适应高酸性的环境，并能利用乳酸及其他一些有机酸，于是形成优势菌。乳酸及其他一些有机酸，于是形成优势菌。特征：由于酸的被利用，乳液的酸度会逐渐降低，使乳液特征：由于酸的被利用，乳液的酸度会逐渐降低，

17、使乳液的的PH不断上升接近中性。不断上升接近中性。(5）胨化菌期）胨化菌期 经过上述几个阶段的微生物活动后，乳液中的乳糖大量经过上述几个阶段的微生物活动后，乳液中的乳糖大量被消耗，残余量已很少，在乳中仅是蛋白质和脂肪尚有较多被消耗，残余量已很少，在乳中仅是蛋白质和脂肪尚有较多的量存在。因此，适宜于分解蛋白质和脂肪的细菌在其中生的量存在。因此，适宜于分解蛋白质和脂肪的细菌在其中生长繁殖。这样就产生了乳凝块被消化（液化）、乳液的长繁殖。这样就产生了乳凝块被消化（液化）、乳液的pH pH 逐逐步提高向碱性方向转化，并有腐败的臭味产生的现象。这时步提高向碱性方向转化，并有腐败的臭味产生的现象。这时的腐

18、败菌大部分是属于芽胞杆菌属、假单胞菌属以及变形杆的腐败菌大部分是属于芽胞杆菌属、假单胞菌属以及变形杆菌属的一些细菌。菌属的一些细菌。特征：乳凝块被消化（液化）、乳液的特征：乳凝块被消化（液化）、乳液的pH pH 逐步提高向逐步提高向碱性方向转化，并有腐败的臭味产生的现象。碱性方向转化，并有腐败的臭味产生的现象。(二二)菌落总数定义及检验意义菌落总数定义及检验意义 乳中细菌数量的表示方法主要有两种：乳中细菌数量的表示方法主要有两种：1 1、菌落总数、菌落总数 2 2、细菌总数、细菌总数二、二、平板计数法检验原料乳菌落总数平板计数法检验原料乳菌落总数一、原理一、原理 1、菌落总数菌落总数是指一定数

19、量和面积的食品检样，在一定条是指一定数量和面积的食品检样，在一定条件下件下(如样品的处理、培养基种类、培养时间、温如样品的处理、培养基种类、培养时间、温度等度等)进行培养，使适应该条件的每一个活菌必须进行培养，使适应该条件的每一个活菌必须而且只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌而且只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得到的菌落总数量。落计数所得到的菌落总数量。通常以通常以1g或或1mL或或1cm2样品中所含的菌落数量样品中所含的菌落数量cfu(菌落形成单位菌落形成单位)来来表示。表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、间、pH、是否需要氧气

20、、是否需要氧气等。等。目前中国的食品标准中规定细菌总数实际上目前中国的食品标准中规定细菌总数实际上是指菌落总数。是指菌落总数。菌落总数：菌落总数：并不表示实际中的所有细菌并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为以有时被称为杂菌数杂菌数，需氧菌数需氧菌数等。等。菌落总数主要作为判别菌落总数主要作为判别食品被污染食品被污染程度程度的标志，也可以应用这一方法观察的标志，也可以应用这一方法观察

21、细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。样品进行卫生学评价时提供依据。食品中细菌食品中细菌菌落总数越多菌落总数越多，则食品，则食品含有致病菌含有致病菌的可能性越大，食品的可能性越大，食品质量越质量越差差；菌落总数越小，则食品含有致病菌；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合的可能性越小。须配合大肠菌群和致病大肠菌群和致病菌菌的检验，才能对食品做出较全面的评的检验，才能对食品做出较全面的评价。价。2 2、细菌总数、细菌总数指一定数量或面积的食品指一定数量或面积的食品检检样，经过样，经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直适当的

22、处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种接计数。其中包括各种活菌数活菌数和尚未消失和尚未消失的的死菌数死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以数。通常以1g或或1mL样品中的细菌总数来样品中的细菌总数来表示。表示。二二、材料材料1、食品检样食品检样2、培养基培养基平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液盐缓冲液3、其它其它无菌培养皿，无菌吸管，电炉、无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培恒温培养箱养箱等。等。四、四、流程流程1 1、检样检样 2 2、做几个适当倍数的稀释液做几个适当倍数的稀释液3、选择选择23个适宜个适宜

23、稀释度各稀释度各1 1 m mL,L,分别加入分别加入灭菌平皿内灭菌平皿内 4 4、平皿内倾注平皿内倾注15152020 m mL L琼脂培养基，混匀琼脂培养基，混匀5 5、36 136 1培养培养482482小时或（小时或（242242）小）小时时6、记录稀释倍数和相应的记录稀释倍数和相应的各平板各平板菌落菌落数量数量7 7、计算菌落总数计算菌落总数 报告报告 五、五、步骤步骤(一一)取样、稀释和培养取样、稀释和培养1、以无菌操作取检样以无菌操作取检样25g（mL），），放于放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌

24、乳钵内，璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。的均匀稀释液。固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理的速度处理12min，制成，制成1:10的均匀稀释液。的均匀稀释液。2、用、用1mL灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1:10稀释稀释液液1mL，沿管壁徐徐注入含有，沿管壁徐徐注入含有9mL灭灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管振摇试管或反复吹打混合均匀，制成或反复吹打混合均匀，制成1:100的稀

25、释液。的稀释液。3、另取、另取1mL灭菌吸管，按上项操灭菌吸管，按上项操作顺序，制作顺序，制10倍递增稀释液，如此每倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即递增稀释一次即换用换用1支支1mL吸管。吸管。4、根据标准要求或对污染情况的估根据标准要求或对污染情况的估计，选择计，选择23个个适宜稀释度，分别在制适宜稀释度，分别在制作作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做每个稀释度做两个平皿两个平皿。同时分别取同时分别取1ml稀释液（不含样品）稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作加入两个灭菌平皿内

26、作空白对照空白对照。5、稀释液移入平皿后，将稀释液移入平皿后，将冷却冷却至至46琼脂培养基注入平皿约琼脂培养基注入平皿约1520ml，并转动平皿，并转动平皿，混合均匀混合均匀。6、待琼脂凝固后，翻转平板，置待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养温箱内培养482h，水产品，水产品301温温箱内培养箱内培养723h。如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固毫升），凝固后培养。后培养。（二）（二）菌落菌落记录记录方法方法做做平平板板菌落

27、数菌落数记录记录时，可用肉眼观察，时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度同稀释度的各的各平平板板平均菌落数平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于不能立即计数，应将平板放置于0 044，但，但不要超过不要超过24h24h。1 1、平皿菌落数的选择平皿菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在3030300300之间的平板作之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用采用两个平皿两个平皿

28、，大于大于300300的可记为多不的可记为多不可计。可计。2、其中一个平板有较大、其中一个平板有较大片状菌落片状菌落生生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落片状菌落不到平板的一半不到平板的一半，而，而其余一半其余一半中菌落分布又很中菌落分布又很均匀均匀，则可以计算，则可以计算半个半个平板后乘以平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。，以代表一个平板的菌落数。3、当平板上有链状菌落生长时，、当平板上有链状菌落生长时，如呈如呈链状生长链状生长的菌落之间无任何明显的菌落之间无任何明显界限，则应作

29、为一个菌落计，如存在界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。每一个菌落分开计数。（三）菌落（三）菌落总总数的数的计计算算 1 1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值平均值，再将平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数乘以相应稀释倍数，作为每作为每g g（mLmL）中菌落总数结果。）中菌落总数结果。试样试样例次例次稀释度稀释度选定计数稀释度选定计数稀释度菌

30、量菌量/(个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 343543521021048481010-3-3，1010-4-43.5x103.5x105 54 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法计数无法计数5685

31、683123121010-4-43.1x103.1x106 6 2 2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：数范围内时，按如下公式计算：N=C/N=C/（n n1 1+0.1n+0.1n2 2）d d（1)1)式中：式中：N N 样品中菌落数；样品中菌落数；C C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；之和；n nl l 第一个适宜稀释度平板数；第一个适宜稀释度平板数；n n2 2 第二个适宜稀释度平板数；第二个适宜稀释度平板数；d d 稀释因子（第一稀释度）。稀释因子（第一稀释度）。

32、例如：例如：稀释度稀释度1:100（第一稀释度）（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）（第二稀释度）菌落数菌落数232，24433，35232+244+33+35(2+0.12)10-2=544/0.022=24727四舍五入表示为四舍五入表示为:2.5104试样试样例次例次稀释度稀释度选定计数稀释度选定计数稀释度菌量菌量/(个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x1

33、05 53 343543521021048481010-3-3，1010-4-43.5x103.5x105 54 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法计数无法计数5685683123121010-4-43.1x103.1x106 63、若所有稀释度的平板菌落数若所有稀释度的平板菌落数均均300，则取，则取最高稀释度最高稀释度的平均菌落数乘的平均菌落数乘以稀释倍数计算。以稀释倍数计算。试样试样例次例次稀释度稀释度选定计数稀释度选定计数稀释度菌量菌量

34、/(个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 343543521021048481010-3-3，1010-4-43.5x103.5x105 54 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0 x109.0 x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法计数无法计数5685683

35、123121010-4-43.1x103.1x106 64、若所有稀释度平板菌落数、若所有稀释度平板菌落数均均30，则以则以最低稀释度最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍的平均菌落数乘稀释倍数计算。数计算。5、若所有稀释度平板均、若所有稀释度平板均无菌落生长无菌落生长，则应按则应按300，有的又，有的又30，则应以，则应以最接近最接近300或或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（四）（四）菌落计数报告方法菌落计数报告方法1、菌落数在、菌落数在1100时，按四舍五入报时，按四舍五入报告告两位有效数字。两位有效数字。2、菌落数菌落数100时，第三位数字按四舍时，第三位数字按

36、四舍五入计算，取五入计算，取前面两位有效数字前面两位有效数字，为了缩，为了缩短数字后面的零数，也可以短数字后面的零数，也可以10的指数表示。的指数表示。3 3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告数，则报告菌落蔓延菌落蔓延。4 4、若空白对照上有菌落生长，则此次检若空白对照上有菌落生长，则此次检测测结果无效结果无效。5 5、称重取样以称重取样以CFU/g为单位报告，体积为单位报告，体积取样以取样以CFU/mL为单位报告。为单位报告。注意事项注意事项1、无菌操作、无菌操作操作中必须有操作中必须有“无菌操作无菌操作”的概念，所用的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌

37、的。所用剪刀、镊子玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用应用75%75%乙醇乙醇在包装开口处擦拭后取样。操在包装开口处擦拭后取样。操作应当在作应当在超净工作台超净工作台或经过消毒处理的或经过消毒处理的无菌室无菌室进行。进行。2 2、采样的代表性、采样的代表性 如系固体样品，取样时不应集中一如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。点，宜多采几个部位。固体样品固体样品必须经必须经过均质或研磨，过均质或研磨，液体样品液体样品须经过振摇，须经过振摇，以获得均匀稀释液。以获得均匀稀释液。3 3、稀释液、稀

38、释液 样品稀释液主要是样品稀释液主要是灭菌生理盐水灭菌生理盐水，或，或磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（或（或0.1蛋白胨水蛋白胨水），后），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水。4 4、每递增稀释一次即换用、每递增稀释一次即换用1 1支支1ml1ml灭菌灭菌吸管。吸管。5 5、倾注用培养基应在、倾注用培养基应在4646水浴内保温，水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混

39、匀。如无水于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。6 6、倾注培养基的量规定不一，从、倾注培养基的量规定不一，从121220ml20ml不等，一般以不等，一般以15ml15ml较为适宜，平板较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。7、为使菌落能在平板上均匀分布，、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并

40、旋转混匀旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间间不宜超过不宜超过20min，以防止细菌有所死，以防止细菌有所死亡或繁殖。亡或繁殖。8、培养温度一般为、培养温度一般为37（水产品的（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用故多采用30）。培养时间一般为）。培养时间一般为48h，有些方法只要求，有些方法只要求24h的培养即可计数。的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养养48h后，培养基失重不应超过后，培养基失重不应超

41、过15。9 9、为了避免食品中的微小颗粒或培、为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于合的平板，不经培养，而于4 4环境中放环境中放置，以便计数时作对照观察。置，以便计数时作对照观察。六、六、结果结果1、将实验测出的样品数据以表格的将实验测出的样品数据以表格的方式报告。方式报告。2、对样品菌落总数作出是否符合卫对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。生要求的结论。报告方式报告方式样品样品稀释液及稀释液及菌落数菌落数选择稀选择稀释度释度报告报告(C

42、FU/g,ml)10-210-310-4样品样品名称名称原始原始数据数据计算公式计算公式报告报告平均平均七、思考七、思考1、什么是细菌菌落总数（什么是细菌菌落总数（cfu）？）？2、影响杂菌总数准确性的因素有哪些？影响杂菌总数准确性的因素有哪些？3、在食品卫生检验中，为什么要以细菌、在食品卫生检验中，为什么要以细菌菌落总数为指标？菌落总数为指标？4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在持在461的温度？的温度？酱油（酱油（GB/T2717-2003）：细菌菌落总数：细菌菌落总数：30000CFU/mL大肠菌群：大肠菌群：30MPN/100mL肠道致病菌：肠道致

43、病菌：不得检出不得检出全脂奶粉、脱脂奶粉（全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）：特级特级一级一级二级二级细菌菌落总数：细菌菌落总数：200003000050000（CFU/ml）大肠菌群大肠菌群409090（MPN/100g）肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出巴氏杀菌乳（巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：细菌菌落总数：30000CFU/mL大肠菌群：大肠菌群：90MPN/100mL肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出生活饮用水卫生标准（生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数菌落总数cfu/ml：100总大肠菌群总大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出耐热大肠菌群耐热大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出瓶瓶(桶桶)装饮用纯净水卫生标准装饮用纯净水卫生标准(GB17324-2003)细菌菌落总数细菌菌落总数cfu/ml：20大肠菌群大肠菌群MPN/100ml：3致病菌致病菌(肠道致病菌和致病性球菌肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出：不得检出霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出不得检出