现代生物技术进展答案.pdf

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1、1.激光共聚焦扫描显微镜有什么特点？1 光源：用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。2 共聚焦技术：在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住。3 点扫描技术：共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束点光源逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。也就是通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象 Z Z 轴重叠就可形成一个完整的三维图象 普通光镜：是在可见光源下一次性成像。4 信号放大、电子图像：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。5 软件：计

2、算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。优势：在结构方面：激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高，可实现分层扫描，可实现连续扫描，可动态记录变化，可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像，扫描速度快，对样品损伤小。在效果方面：更灵敏：共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。定位更精确：不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。定量测量。静态的定量测量：对于不同组的样品，可以单纯比拟一种成分，

3、也可以同时比拟两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比拟不同成分含量。动态的定量测量：共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分如：钙、钠、氢等进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。快速性：由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。数据图像可及时输出或长期储存：用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等；而且图像可进一步加工处理。2.与静态细胞观察相比，活细胞观察有哪些优势？活细胞动态观察 静态成像 科研角度 能够连续观察

4、细胞及分子水平的动态变化，说明机制，更能说明问题 需要大量样品、时间点，样品的差异化问题，出现假阳性结果 应用范围 既能满足高分辨，又能够满足实践分辨要求较高的实验 无法做时间分辨比拟高的实验，以及对细胞或分子实时动态三维观察 实验过程 实验简单化，操作步骤少，数据信息充足 实验设计复杂，步骤多，数据信息少 3.绿色荧光蛋白如何发出绿色荧光？水母体中有一种发光蛋白 Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收从而发出绿色荧光，这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质就是 GFP。GFP 生色团：Ser 65-Tyr 66-Gly 67，GFP 中丝氨酸 65 展开多肽骨架 环

5、化 形成咪唑啉酮环系统形成 通过脱氢反响-H2O 形成 环化环系统 在经过 氧化反响+O2 形成成熟绿色荧光发色基团，发绿色荧光。荧光的发光是被一定波长光激发后，电子被激发到高能级，随后向低能级跃迁的过程中发出比激发光波长更长的荧光，这也就是上面提到的受激辐射。我们将能接受光辐射，并跃迁发出颜色光的基团叫做生色团。绿色荧光蛋白含有一个三肽的单位 Ser65-Tyr66-Gly67，在蛋白质折叠的时候，这三个氨基酸会折叠成 5 元环的咪唑酮的结构，也就是生色团。当它被激发后，失去一个质子，形成了带负电荷的结构，在这种构象下就可以发光了。4.与传统的荧光素相比，绿色荧光蛋白应用于蛋白质的荧光标记时

6、有哪些优缺点？5.与荧光素酶相比，绿色荧光蛋白作为报告基因有哪些优缺点？6.举例说明绿色荧光蛋白可以应用于哪些方面？（1）报告基因：可以监控细胞内活动；可以进行细胞筛选FACS：例如，可以在胚胎或成体复杂的组织中别离得到表达荧光蛋白的活细胞，通过荧光激活细胞分选，我们可以通过解剖别离含有目的的荧光蛋白的组织，然后酶消化成单个细胞，流式分选出表达目的的荧光蛋白的活细胞；还可用作蛋白质定位，如果蛋白质进入那么颜色会叠加；可用来观测基因的表达水平。（2）转基因动物：主要是 GFP 在肿瘤研究中的应用，例如可以通过荧光的强弱判断肿瘤的大小与深度，内部的肿瘤所发出的荧光由于受周围组织，尤其是皮肤的干扰，

7、小的瘤灶常难以显示，因此我们可以在欲检测的器官做一个可逆性的皮瓣，观察时翻开皮瓣，建立荧光通路。（3）传感器：检测细内 PH，绿色荧光蛋白可以激活 FP，转换 FP，开关 FP。光漂白恢复：光漂白 photo bleaching 指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象。借助于高强度激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光淬灭即漂白，该区域周围的非淬灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测，因而可得到活细胞的动力学参数。7.为什么说“蛋白质药物开发是独一无二的挑战？蛋白质分子与小分子物质稳定性比拟 蛋白质 小分子

8、大量潜在的反响位点 很少反响位点 大量离子化位点 很少离子化位点 有二级、三级、四级高级结构 没有高级结构 温度效应是间断的变性 温度效应是连续的 易支撑微生物生长 8.常用的包涵体复性方法有哪些？有何优缺点？常用方法：稀释法，透析法，超滤法，液相色谱法 优点：复性条件比拟温和、层析介质的隔离降低了蛋白相互作用产生的聚集；可同时实现蛋白质的复兴和纯化，耗时少；回收率高、快速、易放大、样品稀释倍数小一般 5倍左右 缺点：很难防止在交换溶液时变性蛋白聚体形成少量沉淀，并且吸附在凝胶介质，造成复性率和柱子载样量降低 9.药用重组蛋白生产过程中需要检测哪些工程？要使用哪些方法来检测？检测工程 检测方法

9、 产品是否含内毒素 家兔热原法 蛋白质是否变异 肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳 甲硫氨酸是否被甲酰化 肽谱、质谱、HPLC、Edman 分析 蛋白质是否变形、聚合、脱氨基 SDS-PAGEA、凝胶层分析、等电聚焦、质谱、HPLC、毛细管电泳、Edman 分析 是否含 DNA DNA 点印迹杂交 氨基酸是否发生取代 氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳 产品是否被细菌、病毒、支原体等污染 微生物学检测 10.列出糖蛋白的分析路线。11.与非重组蛋白相比，重组蛋白在特性描述方面有何特别之处？12.药用蛋白制备过程中必须去除的 3 种特殊物质是什么？如何去除？DNA、热源和病毒是蛋白质纯化过程中

10、尤其需要重视的 3 种潜在的非蛋白质杂质。DNA：每剂药用蛋白中 DNA 含量4.0 时)是一个强阴离子分子，可在适宜的条件下吸附到阴离子交换色谱上，利用此特点可去除 DNA。DNA 不会吸附于亲和色谱柱和疏水色谱柱，因此利用此特点也可去除 DNA。热源：注射用药用蛋白要求最终到达无热源状态，否那么会引起被注射者发烧、发冷、改变血管渗透性或其他副作用，这种反响为热源反响，生化或药用产品中任何引起该种反响的组分被称为热源。最主要的热源污染物来源于肠细菌族的内毒素，它们是革兰阴性菌细胞壁的组成成分为脂多糖，该种多糖在细胞生长或溶胞时被释放而且非常稳定，即使在高压消毒后仍有生物活性。传统的除热源方法

11、通常有两种：通过化学或热处理使其无活性；采用活性炭、石棉、亚硫酸钡等介质吸附。最优化的和最有效的方法是使用色谱法从蛋白质溶液中去除热源。脂多糖是阴离子分子，从而可以用阴离子交换色谱方法除去，也可使用相应的亲和色谱法去除。病毒：终产品中的病毒污染物主要来源于宿主细胞中的内生病毒，因此，充分地对母细胞库进行病毒筛选和检测便显得尤为重要。在细胞株被用于生产前，主细胞库应该是无病毒的，这将彻底减少最终纯化产品中病毒污染的危险。实际上，大多数情况下，为获得产品的理想蛋白纯度而设计的正常层析方案应该能除去最终产品中的病毒污染物，然而在纯化过程中，推荐使用专门的有效的方法，如过滤、UV 失活(除去或使病毒失

12、活)等，即使这些步骤不能提高产品的产量和纯度，为了产品的平安性，在纯化过程中应该将这些步骤结合起来。13.蛋白质作为药物的缺陷有哪些？（1）常稳定性差，体内易降解（2）半衰期短，需要长期频繁给药（3）分子量大，易产生免疫原性（4）相对分子量较大，难以透过生物膜（5）给药途径单一，注射用溶液剂和冻干粉针 14.与传统药物相比，纳米药物有哪些优势？（1）纳米药物载体可以进入毛细血管，在血液循环系统自由流动，还可以穿过细胞，被组织与细胞胞饮的方式吸收，提高生物利用率（2）纳米载体的比外表积高，水溶性差的药物在纳米载体中的溶解度相对增强，克服无法通过常规方法制剂的难题（3）纳米载体经特殊加工后可以制成

13、靶向定位系统，如磁性载药纳米颗粒。可降低药物剂量减轻副作用。（4）延长药物的体内半衰期，藉由控制聚合物在体内的降解速度，能使半衰期短的药物维持一定水平，可改善疗效及降低副作用，减少患者服药次数。（5）可消除特殊生物屏障对药物作用的限制，如血脑屏障、血眼屏障及细胞生物膜屏障等，纳米载体微粒可以穿过这些屏障部位进行治疗（6）口服胰岛素纳米囊可保护胰岛素不被酶破坏，提高胰岛素的降糖作用。（7）皮下注射胰岛素纳米囊，降糖作用可持续 7 天，3 天 1 次给药的降糖作用可接近 1天 3 次给药的常规胰岛素治疗效果，并减小血药浓度的波动。（8）作为控制剂的聚乳酸药效实践，实验最长已经到达 200 天，一般

14、也可以到 1-2 个月 15.什么是 EPR 效应？纳米药物靶向技术中的物理化学导向和生物导向指的是什么？EPR 效应：即是癌细胞会分泌比正常细胞多的 vascular permeability factor，造成肿瘤组织附近血管比起正常的血管物质渗透性高，因此分子体积大的高分子化合物更能渗透、经过癌组织。加上癌细胞破坏淋巴系统，造成高分子化合物停留在肿瘤组织附近时间较长的现象。物理化学导向：利用药物载体的 PH 敏、热敏、磁性等特点在外部环境的作用下如外加磁场对肿瘤组织实行靶向给药。生物导向：利用抗体、细胞膜外表受体或特定基因片段的专一性作用，将配位子结合在载体上，与通过特异性结合，使药物能

15、够准确送到肿瘤细胞中。16.纳米物质生物效应机制研究的内容有哪些？（1）确定纳米颗粒在体内的吸收、分布、代谢和去除的生物学途径；（2）各种形态纳米物质与生物器官细胞/分子相互作用的方式；（3）不同纳米材料可能的靶器官或生物标志等；（4）纳米材料的急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性等；（5）新的实验方法学如荧光检测法。17.哪些方法可以实现蛋白质的靶向性？这些方法各有哪些优缺点？试设计实验方案加以证明。18.归纳整理出案例“Sustained gastrointestinal activity of dendronized polymerenzyme conjugates详细的技术路线。四种多聚物分

16、别修饰得到的修饰酶在胃中的表现行为有何不同？为什么？题目：树枝状聚合物-酶缀合物的胃肠活性持续 目的：改善口服酶 PEPs 在胃肠中的稳定性和活性。方法：共价交联多聚物 内容：1.制备酶-多聚物交联物 2.PG1 和 PDL 在体外和体内粘膜吸附能力表征 3.MX 和 MX-多聚物在体外模拟胃肠条件下的稳定性和活性 4.活体检测 MX 和 MX-多聚物的胃肠活性 5.MX-PG1 在胃里的 稳定性 6.通用性 摘要：稳定和保持胃肠道中酶活性的方法很少被研究，因为保护蛋白质免受已经进化以促进其消化的环境的困难。然而，在这些条件下阻止酶的降解对于开发新的基于蛋白质的口服疗法是至关重要的。在这里我们

17、显示共价结合到聚合物可以稳定在胃肠道不同位置的口服治疗酶。建筑上和功能上不同的聚合物被用来保护酶的空间失活，并促进与胃壁粘蛋白的相互作用。使用这种方法，酶的体内活性可以在胃和/或小肠中持续几个小时。这些发现为基于口服蛋白质的新的治疗和成像策略的开发提供了新的见解和坚实的根底，使用简单易行的技术。19.归 纳 整 理 出 案 例“Preparation of chitosan-based multifunctional nanocarriers overcoming multiple barriers for oral delivery of insulin中纳米颗粒的设计方案，各组分的作用是什

18、么？作者如何验证纳米颗粒的效果?题目：基于多功能纳米载体克服多重障碍的口服胰岛素壳聚糖的制备 各组分作用：壳聚糖与聚阴离子的相互作用导致在水性介质中和温和条件下自发形成纳米颗粒，不需要使用有机溶剂或加热，防止细胞毒性问题和对胰岛素稳定性的威胁。LV，L-缬氨酸，用作促进小肠吸收的靶配体 PBA，L-缬氨酸修饰的壳聚糖在纳米粒子中对蛋白质药物的包封率高，药物吸收增强，药物在肠道中滞留时间延长以及有利的酶促抑制作用等都有很大的奉献。L-缬氨酸结合的药物增强了药物的口服生物利用度，L-缬氨酸结合的载体在吸收药物中的巨大潜力。苯基硼酸，疏水和葡萄糖敏感单元，从合成组分中引入替代的葡萄糖传感器局部苯基硼

19、酸作为这样的目标的潜在候选者，这是由于硼酸可逆地与二醇结合形成环状硼酸酯在水介质中 如何验证：通过壳聚糖的接枝反响合成多功能纳米载体。为了设计具有目标特异性的系统，将 L-缬氨酸引入纳米载体，其通过受体介导的内吞作用促进其递送。由于胰岛素和 PBA之间的疏水反响以及胰岛素和壳聚糖之间的静电反响，胰岛素可以被装载到纳米碳管中。在含有胃蛋白酶的模拟胃液SGF和含有胰酶的模拟肠液SIF的存在下分别建立负载胰岛素抵抗消化酶的化学稳定性。共聚焦激光扫描显微镜观察 HT-29 细胞的摄取行为。口服给糖尿病大鼠后，与皮下注射胰岛素相比，获得了有效的降血糖作用。这项工作说明，L-缬氨酸改性壳聚糖基多功能纳米载

20、体可能是口服胰岛素的有前途的药物递送载体。为了克服口服递送胰岛素的多重障碍，将 L-缬氨酸 LV，用作促进小肠吸收的靶配体 和苯基硼酸 PBA，用作葡萄糖响应性的的基于壳聚糖的多功能纳米载体单位已被设计和评估在这项研究中。得到的纳米载体对 HT-29 细胞显示低的细胞毒性，并且对蛋白质溶液具有优异的稳定性。通过 pH 和葡萄糖体外评估胰岛素释放行为。在含有胃蛋白酶的模拟胃液SGF和含有胰酶的模拟肠液SIF的存在下分别建立负载胰岛素抵抗消化酶的化学稳定性。共聚焦激光扫描显微镜观察HT-29 细胞的摄取行为。口服给糖尿病大鼠后，与皮下注射胰岛素相比，获得了有效的降血糖作用。这项工作说明，L-缬氨酸改性壳聚糖基多功能纳米载体可能是口服胰岛素的有前途的药物递送载体。20.对报告文献的理解针对英文版研究论文，答题时要先注明文献题目