实时定量PCR技术realtime PCR.pptx

《实时定量PCR技术realtime PCR.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时定量PCR技术realtime PCR.pptx（69页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、会计学1实时定量实时定量PCR技术技术realtime PCR一、实时定量一、实时定量PCR技术原理技术原理1.1 技术发展史1993年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念。1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术，1996年又推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，荧光定量PCR才很快得到大家的接受，并广为应用。第1页/共69页n n实时定量技术的优势n n污染机会少：闭管化学没有后处理：不用杂交、电泳、拍照操作简单：高度自动化用途广泛：既能定量又能定

2、性灵活：既可多点测定，又可单点测定第2页/共69页n n1.2 什么是PCR第3页/共69页n n典型的PCR四阶段第4页/共69页n nPCR的理论方程第5页/共69页n n理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实实际的际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。第6页/共69页n n扩增曲线第7页/共69页n n1.3 起点定量与终点定量第8页/共69页n n不同的PCR反应体系进入平台期

3、的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是即使是96次次PCR重复实验，各重复实验，各种条件基本一致，所得结果有种条件基本一致，所得结果有很大差异很大差异。n n也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次次PCR扩增曲线都有一个共扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量同的拐点，即荧光定量PCR中中Ct值的重现性值的重现性，恒定的Ct值为荧光定量PCR的分析提供了理论依据。第9页/共69页n n1.4 基本概念n nCT值n nC C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，所谓，所谓CtC

4、t值就是在荧值就是在荧光光PCRPCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。设定的阈值时所经过的扩增循环次数。从基线到从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。指数增长的拐点所对应的循环次数。第10页/共69页n n因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。第11页/共69页n nCT值与起始DNA浓度的关系第12页/共69页第13页/共69页阈值阈值荧光阈值是在荧

5、光扩增曲线上荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定人为设定的一个的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值的缺省设置是位置上，荧光域值的缺省设置是3 31515个循环个循环的荧光信号的标准偏差的的荧光信号的标准偏差的1010倍（机器自动设置）倍（机器自动设置）。荧光本底信号，我们一般把荧光荧光本底信号，我们一般把荧光PCRPCR的前的前1515个个循环信号作为荧光本底信号（循环信号作为荧光本底信号（baselinebaseline，基线期），基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信

6、号被荧光背景信号所掩盖。扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。第14页/共69页第15页/共69页n n基线调整规则n n如果CT值18，不需调整，使用自动分析结果。n n如果CT值2 ug2 ug，分成几管，分成几管第39页/共69页标准品标准品目的：生成标准曲线，建立目的：生成标准曲线，建立CTCT值与浓度之间的数学关系值与浓度之间的数学关系不要求：不要求：数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA,DNA,可以使用相同的可以使用相同的DNA,DNA,也可以使用不同的：也可以使用不同的：PCRPCR产物、质粒、病产物、质粒、病毒

7、、人工合成片段毒、人工合成片段要求：要求：5 5点以上点以上浓度已知浓度已知PCRPCR效率一致，且接近效率一致，且接近100%100%仪器一致仪器一致反应条件一致：循环参数、同一次实验反应条件一致：循环参数、同一次实验试剂质量一致：模板、引物和探针试剂质量一致：模板、引物和探针TmTm值、酶及缓冲液值、酶及缓冲液第40页/共69页n n标准品制作流程第41页/共69页梯度稀释梯度稀释选择目标、提取选择目标、提取/PCR/PCR、纯化、测定浓度、调、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释整浓度、梯度稀释CTCT值在值在18-3018-30之间，覆盖全部样品浓度区间之间，覆盖全部样品浓度区间1010

8、倍连续梯度稀释方法：倍连续梯度稀释方法：1v1v原液原液(标准品标准品i)+9vi)+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品ii ii1v1v标准品标准品ii+9vii+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iii iii1v1v标准品标准品iii+9viii+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iv iv1v1v标准品标准品iv+9viv+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品v v第42页/共69页n nPCR效率对定量结果的影响第43页/共69页第44页/共69页n n管家基因-IPCn nIPC通常选用管家基因它与目标基因在相同的PCR条件下具有相似的扩增效率

9、n nIPC的作用监控PCR抑制物、DNA/RNA提取的损失、操作误差等对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行修正。第45页/共69页在所有待测样品中，内对照在所有待测样品中，内对照(Endogenous Control)(Endogenous Control)的表的表达量都恒定不变达量都恒定不变注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依赖的、注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依赖的、或者处理方式依赖的或者处理方式依赖的多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高推荐使用推荐使用Human Endogenous Control Plate(P

10、/N Human Endogenous Control Plate(P/N 4309920)4309920)测试不同管家基因的效果测试不同管家基因的效果常用的内对照有常用的内对照有18S rRNA18S rRNA、-actinactin、GAPDHGAPDH等等第46页/共69页校准荧光ROXn nROX以固定的浓度配在Master Mix中ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Mix用量有关。校准枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如校准枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）

11、的误差仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等减少孔间差异和批间差异，提高数据的重现性等减少孔间差异和批间差异，提高数据的重现性和精度。和精度。第47页/共69页第48页/共69页n n样品重复n n重复次数请遵循统计学的要求n n小样本统计，n6（n3）n n未知样品和标准品都要重复n n所有复管在同样条件下完成PCR第49页/共69页n n2.2 技术方法及数据第50页/共69页n n绝对定量与相对定量第51页/共69页n n绝对定量：绝对标准曲线法第52页/共69页n n标准品拷贝数的计算n n待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数n n样本分子量=碱基数324 n n待测

12、样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014第53页/共69页相对定量相对定量管家基因校准管家基因校准(Normalization Gene)(Normalization Gene)得出每个细胞中的得出每个细胞中的 目的基因目的基因目的基因目的基因 目标基因目标基因vs.vs.管家基因管家基因管家基因管家基因对照样品校准对照样品校准(Calibrator Sample)(Calibrator Sample)得出相对于某个样品的基因表达量得出相对于某个样品的基因表达量,1X,1X sample.sample.处理的处理的vs.vs.未处理的，未处理的，未处理的，未处理的，

13、6hr vs.0 hr,6hr vs.0 hr,病理病理病理病理vs.vs.正正正正常常常常.第54页/共69页示例示例第55页/共69页n n对于不同的实验需求，我们可以采用不同的方法对于不同的实验需求，我们可以采用不同的方法进行实验设计和数据分析，一般常用的方法有双进行实验设计和数据分析，一般常用的方法有双标准曲线法、标准曲线法、CtCt、2 2-CtCt、用参照基因的、用参照基因的CtCt法和法和PfaffiPfaffi法，应用每种方法都有适应条件。法，应用每种方法都有适应条件。第56页/共69页n n目前相对定量普遍采用操作简便的2-Ct分析方法第57页/共69页第58页/共69页CT

14、法计算示例法计算示例第59页/共69页n n基于产物长度和基于产物长度和G/CG/C含量的不同，扩增产物会在含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩微分可以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰与凝胶电泳中条带类似。增到的产物。这些峰与凝胶电泳中条带类似。第60页/共69页n n熔解曲线的设置是在整个PCR完成后进行，从60升至95，每升高1仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降

15、的过程，且在Tm值下降最快，为方便分析，我们将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，这样我们就可以证明引物的特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰。第61页/共69页三、实时定量三、实时定量PCR技术的应用技术的应用 基因突变分析基因突变分析 单基因遗传病诊断，如血友病、地贫单基因遗传病诊断，如血友病、地贫 SNPSNP扫描扫描扫描扫描 疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNPSNP的鉴定的鉴定SNPSNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异异 药物副反应的

16、预防，如麻醉意外药物副反应的预防，如麻醉意外 物种鉴定、菌株鉴定物种鉴定、菌株鉴定 各种病毒，细菌，病毒各种病毒，细菌，病毒 病原体检测，如炭疽菌，病原体检测，如炭疽菌，E coli.O157E coli.O157第62页/共69页四、常见问题四、常见问题4.14.1无无 Ct Ct 值（信号）出现值（信号）出现 1 1、反应循环数不够：一般都要在、反应循环数不够：一般都要在 35 35 个循环以上，可根据实验个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于情况增加循环，但高于4545个循环会增加过多的背景信号。个循环会增加过多的背景信号。2 2、检测荧光信号的步骤有误：一般采用、检测荧光信号的步骤

17、有误：一般采用 7272延伸时采集荧光，延伸时采集荧光，Taqman Taqman 方法则一方法则一 般在退火结束或延伸结束采集信号；般在退火结束或延伸结束采集信号；3 3、引物或探针降解：可通过、引物或探针降解：可通过PAGEPAGE电泳检测其完整性。电泳检测其完整性。4 4、探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上、探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸。而产物已延伸。5 5、模板量少：对未知尝试的样品应从系列稀释样品的最高浓度、模板量少：对未知尝试的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。做起。6 6、模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的

18、、模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。情况发生。第63页/共69页4.2 CT4.2 CT值出现过晚值出现过晚1 1、反应条件不佳：重新设计引物或探针，适当降低、反应条件不佳：重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加退火温度，增加MgMg离子浓度等。离子浓度等。2 2、PCRPCR各种反应成分的降解或加样量不够。各种反应成分的降解或加样量不够。3 3、扩增产物片段过长：一般采用、扩增产物片段过长：一般采用100-200bp100-200bp的扩增长的扩增长度。度。4.3 4.3 标准曲线的线性关系不佳标准曲线的线性关系不佳1 1、加样误差，标准品稀释不呈梯度。、加样

19、误差，标准品稀释不呈梯度。2 2、标准品降解：避免反复冻融。、标准品降解：避免反复冻融。3 3、引物或探针不佳，重新设计。、引物或探针不佳，重新设计。4 4、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。第64页/共69页4.4 4.4 阴性对照也出现明显的扩增阴性对照也出现明显的扩增1 1、荧光、荧光PCR mixPCR mix或水被污染。或水被污染。2 2、引物二聚体的出现：在、引物二聚体的出现：在3535循环后阴性对照出现扩增循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。3 3、反应过程中探针降解：用、反应过程中探针

20、降解：用PAGEPAGE电泳对探针进行检电泳对探针进行检测。测。4.5 4.5 熔解曲线不止一个主峰熔解曲线不止一个主峰1 1、引物设计不佳：二聚体和发夹结构。、引物设计不佳：二聚体和发夹结构。2 2、引物浓度不佳。、引物浓度不佳。3 3、退火温度过低。、退火温度过低。4 4、MgMg离子浓度过高。离子浓度过高。5 5、模板中有基因组的污染。、模板中有基因组的污染。第65页/共69页4.6 4.6 扩增效率低扩增效率低1 1、反应试剂中部分成分特别是染料降解。、反应试剂中部分成分特别是染料降解。2 2、反应条件不佳：降低退火温度或三步法。、反应条件不佳：降低退火温度或三步法。3 3、反应体系有

21、抑制物：大多为模板中引入，应先适、反应体系有抑制物：大多为模板中引入，应先适当稀释模板，再加入到体系中，减少抑制物的影响。当稀释模板，再加入到体系中，减少抑制物的影响。4.7 4.7 重复性不好重复性不好1 1、加样不准确。、加样不准确。2 2、仪器的温度均一性不好。、仪器的温度均一性不好。3 3、模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，、模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。应减少样品的稀释倍数。第66页/共69页4.8 4.8 扩增曲线不正常扩增曲线不正常1 1、基线等设置不当。、基线等设置不当。2 2、模板量过多：当扩增曲线在、模板量过多：当扩增曲线在1010个循环内起个循环内起峰时，应稀释峰时，应稀释100-1000100-1000倍后使用。倍后使用。4.9 4.9 荧光定量荧光定量PCR CTPCR CT值一般在多少后认为模板值一般在多少后认为模板没扩增？没扩增？当进入对数期的循环数大于当进入对数期的循环数大于3535时，一般认为检时，一般认为检测无效，基因没有表达，当进入对数期的循环测无效，基因没有表达，当进入对数期的循环数在数在32-3532-35个循环时，需要有至少的个重复才能个循环时，需要有至少的个重复才能判断是否能检测到基因的表达。判断是否能检测到基因的表达。第67页/共69页谢谢谢谢！第68页/共69页