核酸提取及常见问题分析ppt课件.ppt

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1、 核酸提取核酸提取 及常见问题分析及常见问题分析TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p DNADNA提取及常见问题分析提取及常见问题分析p RNARNA提取及常见问题分析提取及常见问题分析讲座内容讲座内容DNADNA提取提取及常见问题分析及常见问题分析TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的

2、费用p DNADNA提取的原则提取的原则p DNADNA提取的方法提取的方法p DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析DNADNA提取及常见问题分析提取及常见问题分析经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p 保证保证DNADNA一级结构的完整性一级结构的完整性p 排除其它分子的污染排除其它分子的污染 RNARNA、蛋白质、多糖等、蛋白质、多糖等DNADNA提取的原则提取的原则经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务

3、的费用p基因组基因组DNA的提取的提取l CTAB法法l SDS法法p质粒质粒DNA的提取的提取l碱裂解法碱裂解法l煮沸法煮沸法p线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取l差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法DNADNA提取的方法提取的方法经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用基因组基因组DNADNA提取主要方法提取主要方法p CTAB法 适用于植物组织，真菌等p SDS法 适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，

4、增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用CTABCTAB法法(植物植物DNADNA提取经典法提取经典法)p原理原理CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵），），是一种阳离子去污剂，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸

5、分离出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前

6、加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组基因组DNADNA CTAB CTAB法法经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者

7、的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。和

8、多糖结合，有效去除多糖。基因组基因组DNADNA CTAB CTAB法法经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用CTABCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料植物材料植物材料裂解液裂解液裂解液裂解液上层溶液上层溶液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨液氮研磨液氮研磨抽提抽提抽提抽提细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀酒精沉淀酒精沉淀DNADNA溶液溶液溶液溶液经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损

9、失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用植物基因组植物基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒 缓冲液缓冲液GP1GP1缓冲液缓冲液GP2GP2去蛋白液去蛋白液GDGD洗脱缓冲液洗脱缓冲液TETE吸附柱吸附柱CB2(20CB2(20g)g)收集管收集管每个离心柱处理每个离心柱处理材料的量为材料的量为鲜重：鲜重：100mg100mg干重：干重：30mg30mg经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用SDS法p 原理原理SDS 阴离子去垢剂阴离子去垢剂 高温（5565）裂解细胞，蛋白变性，染色体

10、离析高盐高盐(KAc或或NH4Ac)或降低温度（冰浴）或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl SDS 终浓度终浓度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)SDSSDS提取缓冲液的配方提取缓冲液的配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合M

11、g2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用动物组织细胞动物组织细胞动物组织细胞动物组织细胞裂解液裂解液裂解液裂解液上层溶液上层溶液上层溶液上层溶液抽提抽提抽提抽提细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉

12、淀酒精沉淀酒精沉淀DNADNA溶液溶液溶液溶液组织匀浆组织匀浆组织匀浆组织匀浆SDSSDS法流程图法流程图经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p细菌基因组细菌基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒p血液血液/细胞细胞/组织基因组组织基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒p病毒基因组提取试剂盒病毒基因组提取试剂盒p酵母基因组酵母基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒 CB2CB2：20 20(g)g)g)g)SDSSDS提取试剂盒提取试剂盒经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿

13、其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用细菌基因组细菌基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒 15ml细菌菌液/离心柱 10-40 0 gg 血液血液/细胞细胞/组织基因组组织基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒全血全血 100 ll1ml 3-30 g1ml 3-30 g动物细胞培养液动物细胞培养液 10 106 610107 7cells 5-30cells 5-30gg动物组织动物组织 30mg 10-30g 30mg 10-30g病毒基因组提取试剂盒病毒基因组提取试剂盒病毒基因组提取试剂盒病毒基因组提取试剂盒 DNA DNA DNA DNA RNA RNA

14、RNA RNA酵母基因组酵母基因组酵母基因组酵母基因组DNADNADNADNA提取试剂盒提取试剂盒提取试剂盒提取试剂盒 Lyticase(20U/Lyticase(20U/gg）不同材料对不同材料对SDSSDS提取试剂盒提取量提取试剂盒提取量 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p9696血液基因组血液基因组DNADNA试剂盒试剂盒 一次实验可提取一次实验可提取9696个样品，快捷、方便。个样品，快捷、方便。不同材料对不同材料对SDSSDS提取试剂盒提取量提取试剂盒提取量 经营者提供商品或者服务有欺诈

15、行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用基因组基因组DNADNA其它裂解方法其它裂解方法p 根据根据细细胞裂解方式的不同有：胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解生物方式：酶法生物方式：酶法经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用基因组DNA纯化的方法p 吸附材料吸附材料结结合法：合法：吸附材料吸附材料纯化原理纯化原理硅质材料硅质材料高

16、盐低高盐低pH值结合核酸值结合核酸低盐高低盐高pH值洗脱值洗脱阴离子交换树脂阴离子交换树脂低盐高低盐高pH值结合核酸值结合核酸高盐低高盐低pH值洗脱值洗脱磁珠磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的达到分离目的经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用硅基质膜(离心柱型)DNA产物纯化试剂盒超薄超薄普通普通大量大量寡核苷酸寡核苷酸9696CB1CB2CB3CB2CB25gg20gg40gg20gg20gg100bp-40kp100bp-40kp

17、100bp-40kp20bp-10kb100bp-40kp质粒DNA提取TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p 碱裂解法碱裂解法p 煮沸法煮沸法 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用碱裂解法原理碱裂解法原理p染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DN

18、ADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；p当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象；p变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿

19、其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液上层溶液上层溶液抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀质粒质粒DNA溶液溶液经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用离心柱型 质粒DNA提取试剂盒小提小提小提中小提中量量大提大提高纯度高纯度小提小提高纯度小高纯度小提中量提中量无内毒无内毒素小提素小提酵母酵母15ml5-15ml100-200ml1

20、-5ml5-15ml15ml15mlCB3CB4CB5CB3CB4CB3CB340gg70gg1000gg40gg70gg40gg40gg去蛋白液去蛋白液去内毒素树脂去蛋白液Lyticase经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用96系列96高纯质粒小提试剂盒高纯质粒小提试剂盒 96快速质粒小提试剂盒快速质粒小提试剂盒96个样品96个样品去蛋白液 CB3(40g)g)异丙醇或者酒精沉淀细胞器DNA提取TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按

21、照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用细胞器细胞器DNA 线粒体线粒体 叶绿体叶绿体q差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。从而得以分离。经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的

22、费用材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存DNADNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 基因组基因组基因组基因组DNADNA 新鲜材料，低温保存新鲜材料，低温保存新鲜材料，低温保存新鲜材料，低温保存 血液基因组血液基因组血液基因组血液基因组DNADNA提取选择有核细胞提取选择有核细胞提取选择有核细胞提取选择有核细胞 细胞培养时间不能过长细胞培养时间不能过长细胞培养时间不能过长细胞培养时间不能过长 含病毒的液体材料提取

23、前先富集含病毒的液体材料提取前先富集含病毒的液体材料提取前先富集含病毒的液体材料提取前先富集 质粒质粒质粒质粒DNADNA 对数期的菌体对数期的菌体对数期的菌体对数期的菌体 培养时应加入筛选压力培养时应加入筛选压力培养时应加入筛选压力培养时应加入筛选压力 低拷贝或大质粒，应加大菌体用量低拷贝或大质粒，应加大菌体用量低拷贝或大质粒，应加大菌体用量低拷贝或大质粒，应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存DNADNA提

24、取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 基因组基因组基因组基因组DNADNA 材料过多影响裂解，导致材料过多影响裂解，导致材料过多影响裂解，导致材料过多影响裂解，导致DNADNA量少，纯度低量少，纯度低量少，纯度低量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀

25、浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K 细细细细 菌溶菌酶破壁菌溶菌酶破壁菌溶菌酶破壁菌溶菌酶破壁 酵酵酵酵 母破壁酶或玻璃珠母破壁酶或玻璃珠母破壁酶或玻璃珠母破壁酶或玻璃珠 质粒质粒质粒质粒DNADNA 菌体量适当，除净培养基菌体量适当，除净培养基菌体量适当，除净培养基菌体量适当，除净培养基 变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5 5分钟）分钟）分钟）分钟）控制复性时间，避免基因组控制复性时间，避免基因组控制复性时间，避免基因组控制复性时间，避免基因组DNADNA的污

26、染的污染的污染的污染 GG菌、酵母细胞酶或机械处理菌、酵母细胞酶或机械处理菌、酵母细胞酶或机械处理菌、酵母细胞酶或机械处理材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存DNADNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 采用吸附材料吸附分离采用吸附材料吸附分离采用吸附材料吸附分离采用吸附材料吸附分离DNADNA，应提，应提，应提，应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系 采用有机溶剂（酚采用有机溶剂（酚

27、采用有机溶剂（酚采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应氯仿）抽提时应氯仿）抽提时应氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀充分而轻柔的混匀充分而轻柔的混匀充分而轻柔的混匀 离心分离两相时，应保证一定的转离心分离两相时，应保证一定的转离心分离两相时，应保证一定的转离心分离两相时，应保证一定的转速和时间速和时间速和时间速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程针对不同材料的特点，在提取过程针对不同材料的特点，在提取过程针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法中辅以相应的去杂质的方法中辅以相应的去杂质的方法中辅以相应的去杂质的方法材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核

28、酸溶解保存核酸溶解保存DNADNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 蛋白质的去除：蛋白质的去除：蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚酚酚/氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提 使用变性剂（使用变性剂（使用变性剂（使用变性剂（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理蛋白酶处理蛋白酶处理蛋白酶处理材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存DNADNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品

29、或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 多糖的去除：多糖的去除：多糖的去除：多糖的去除：多糖水解酶多糖水解酶多糖水解酶多糖水解酶 在提取缓冲液中加在提取缓冲液中加在提取缓冲液中加在提取缓冲液中加1/21/2体积氯苯，氯苯可以体积氯苯，氯苯可以体积氯苯，氯苯可以体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖与多糖的羟基作用，从而去除多糖与多糖的羟基作用，从而去除多糖与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用用用PEG8000PEG8000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在：在：在500L

30、 500L DNADNA液中加入液中加入液中加入液中加入200l 20%PEG8000(200l 20%PEG8000(含含含含1.2 1.2 M NaCl)M NaCl)，冰浴，冰浴，冰浴，冰浴20min20min。材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存DNADNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 多酚的去除：多酚的去除：多酚的去除：多酚的去除：加入还原剂：加入还原剂：加入还原剂：加入还原剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、

31、半胱巯基乙醇、抗坏血酸、半胱巯基乙醇、抗坏血酸、半胱巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等氨酸、二硫苏糖醇等氨酸、二硫苏糖醇等氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEGPEG，可防止酚类与，可防止酚类与，可防止酚类与，可防止酚类与DNADNA的结合的结合的结合的结合 盐离子的去除：盐离子的去除：盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤的乙醇洗涤的乙醇洗涤材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存DNADNA提取基本步骤提

32、取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀 加入加入加入加入1/101/10体积的体积的体积的体积的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M）更充）更充）更充）更充分沉淀分沉淀分沉淀分沉淀 晾干晾干晾干晾干DNADNA，让乙醇充分挥发，让乙醇充分挥发，让乙醇充分挥发，让乙醇充分挥发材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存p

33、p 若长期储存建议使用若长期储存建议使用TETE缓冲液溶解缓冲液溶解pp pHpH值为值为8.08.0，可防止，可防止DNADNA发生酸解发生酸解DNADNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用问题一：问题一：DNADNA降解降解1.1.材料不新鲜、反复材料不新鲜、反复材料不新鲜、反复材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老冻融或细胞衰老冻融或细胞衰老冻融或细胞衰老2.2.提取操作过于剧烈，提取操作过于剧烈，提取操作过于剧烈，提取操作过于剧烈，DNADNA被打断被打断被打断被打断3.3.

34、外源核酸酶污染外源核酸酶污染外源核酸酶污染外源核酸酶污染1.1.低温保存，避免反复冻融低温保存，避免反复冻融低温保存，避免反复冻融低温保存，避免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液裂解缓冲液裂解缓冲液裂解缓冲液3.3.增加裂解液中螯合剂的含量增加裂解液中螯合剂的含量增加裂解液中螯合剂的含量增加裂解液中螯合剂的含量4.4.细胞裂解后操作应尽量轻柔细胞裂解后操作应尽量轻柔细胞裂解后操作应尽量轻柔细胞裂解后操作应尽量轻柔5.5.试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌试剂用无菌水配制

35、，耗材经高温灭菌试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.6.DNADNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融分装保存于缓冲液，避免反复冻融分装保存于缓冲液，避免反复冻融分装保存于缓冲液，避免反复冻融经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用问题二：问题二：DNA DNA样品不纯样品不纯 1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒在溶解前，有酒在溶解前

36、，有酒精残留，酒精抑制后精残留，酒精抑制后精残留，酒精抑制后精残留，酒精抑制后续酶解反应续酶解反应续酶解反应续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离中残留有金属离中残留有金属离子子子子1.1.重新纯化重新纯化重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋白、多去除蛋白、多去除蛋白、多去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见糖、多酚等杂质（具体方法见糖、多酚等杂质（具体方法见糖、多酚等杂质（具体方法见前）前）前）前）2.2.重新沉淀重新沉淀重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精充分挥让酒精充分挥让酒精充分挥让酒精充分挥发发发发3.3.增加增加增加增加7070乙醇洗涤的次数（乙醇洗涤的次数（乙

37、醇洗涤的次数（乙醇洗涤的次数（2-32-3次）次）次）次）经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料尽量选用新鲜（幼嫩）的材料尽量选用新鲜（幼嫩）的材料尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀

38、浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；GG菌、酵母菌、酵母菌、酵母菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁裂解前先用生物酶或机械方式破壁裂解前先用生物酶或机械方式破壁裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物高温裂解时，时间适当延长（对于动物高温裂解时，时间适当延长（对于动物高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加细胞、细菌可增加细胞、细菌可增加细胞、细菌可增加PKPK的用量）的用量）的用量）的用量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀

39、加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒倾倒倾倒倾倒问题三：问题三：DNADNA提取量少提取量少RNARNA提取提取及常见及常见问题问题分析分析TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p RNARNA提取相关知识及注意事项提取相关知识及注意事项p RNARNA提取方法提取方法p RNARNA提取常见问

40、题分析提取常见问题分析经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p 107 个个细胞胞10g 30mg动物物组织，30-100mg植物植物组织prRNA 占占8085pmRNA占占1-5%AAAAAA细胞中细胞中RNARNA的含量的含量AAAAAAtRNAmRNArRNARNAase经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用mRNAmRNA的应用的应用p RT-PCR,Northern杂交，杂交，cDNA文库构建文库构建

41、p mRNA末端快速扩增末端快速扩增(RACE)，差异表达，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应，体外转录，引物延伸反应，体外转录RNA标记，标记，RNA酶保护试验，酶保护试验，RNA微注射微注射(RNA Microinjection)经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 RNA的不稳定性的不稳定性p内因：内因：核糖残基的核糖残基的2和和3位置带有羟基，易被水解位置带有羟基，易被水解p外因：外因：内源、外源内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活够

42、正确折叠恢复活性，不易失活经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用常用的常用的RNARNA酶抑制剂酶抑制剂p焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC）与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 p异硫氰酸胍异硫氰酸胍目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种

43、RNA酶结合，使其失活p 氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性p SDS、尿素、硅藻土等尿素、硅藻土等常用的常用的RNARNA酶抑制剂酶抑制剂经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p RNAsafeRNARNA酶抑制剂酶抑制剂经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用提取提取RNA的注意事项的注意事项p 经常更换新手套。皮肤

44、和实验室用品上可能有经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致，会导致RNase污染污染p 塑料器皿可用塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡水浸泡4-10小时，再灭菌小时，再灭菌p 玻璃器皿可在玻璃器皿可在180烘烤烘烤4小时小时p 塑料制品和枪头避免交叉污染塑料制品和枪头避免交叉污染经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用p RNARNA提取相关知识及注意事项提取相关知识及注意事项p RNARNA提取方法提取方法p RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析经营者提供商品或者服务有欺诈行

45、为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法p细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放 p释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用动植物材料动植物材料研磨或匀浆研磨或匀浆细胞裂解细胞裂解基因组基因组DNA水相有机相RNA氯仿氯仿纯化纯化pH5.7离心离心加入裂解液加入裂解液(TRNzol

46、)RNARNA提取流程示意图提取流程示意图经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用等体积异丙醇沉淀等体积异丙醇沉淀70乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀晾干溶解晾干溶解RNA吸附柱吸附柱去蛋白液去蛋白液漂洗漂洗洗脱洗脱水相水相RNA传统方法：有机溶剂抽提，得率高传统方法：有机溶剂抽提，得率高柱纯化法：纯度高，无有机溶剂柱纯化法：纯度高，无有机溶剂RNARNA提取流程示意图提取流程示意图经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用T

47、RNzol(DP405TRNzol(DP405)RNAprep(DP401)RNAprep(DP401)RNAultra(DP406)RNAultra(DP406)RNAprep(DP402)RNAprep(DP402)RNAplant(DP407)RNAplant(DP407)普遍适用普遍适用动物组织动物组织富含多糖和酚类的植物组织富含多糖和酚类的植物组织50-100mg/500 50-100mg/500 l l30-100mg/30-100mg/离心柱离心柱30-100mg/30-100mg/离心柱离心柱50-100mg/1ml50-100mg/1ml可选择的可选择的RNA提取产品提取产品

48、经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用材料准备材料准备TRNzol裂解细胞裂解细胞加入氯仿抽提加入氯仿抽提RNA沉淀沉淀 柱纯化柱纯化 RNA溶解溶解 保存保存植物组织选取杂质少生长较快的幼植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位嫩部位培养细胞除尽培养液培养细胞除尽培养液消化系统的组织选取杂质少的部位消化系统的组织选取杂质少的部位细菌和酵母需要破壁处理细菌和酵母需要破壁处理样品切成小块投入液氮或专门的样品切成小块投入液氮或专门的RNARNA样品储存液中保存样品储存液中保存液氮研磨时不要使液氮挥发净液氮研磨时

49、不要使液氮挥发净RNARNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用材料准备材料准备TRNzol裂解细胞裂解细胞 加入氯仿抽提加入氯仿抽提RNA沉淀沉淀 柱纯化柱纯化RNA溶解保存溶解保存异硫氰酸胍、酚异硫氰酸胍、酚(TRNzol)裂解细胞灭活裂解细胞灭活RNaseTRNzol要与细胞组织充分接触要与细胞组织充分接触裂解尽量充分裂解尽量充分RNARNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品

50、的价款或接受服务的费用材料准备材料准备TRNzol裂解细胞裂解细胞 加入氯仿抽提加入氯仿抽提RNA沉淀沉淀 柱纯化柱纯化RNA溶解保存溶解保存氯仿抽提时充分混匀氯仿抽提时充分混匀离心分离两相，保证一定的转速和时离心分离两相，保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和间，使蛋白质、多糖和DNA分布到分布到有机相和中间层，有机相和中间层，RNA留在水相中留在水相中注意避免吸入中间层注意避免吸入中间层不慎吸入再次用有机溶剂抽提不慎吸入再次用有机溶剂抽提RNARNA提取基本步骤提取基本步骤经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接