细胞培养工程细胞培养基课件.ppt

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1、细胞培养工程细胞培养基第1页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院 2培养基为细胞提供营养成分和关键生物活性物质，支持细胞生长、代培养基为细胞提供营养成分和关键生物活性物质，支持细胞生长、代谢以及生物学功能活性谢以及生物学功能活性主要营养成分主要营养成分C 源：Glucose，GlutamineN 源：游离氨基酸，蛋白质水解物脂类：必需与非必需脂肪酸，胆固醇维生素：水溶性，非水溶性矿物质（包括微量元素）关键生物活性物质关键生物活性物质细胞贴壁因子，促有丝分裂因子（参照血清成分）在强化营养的同时，蛋白质水解物具有促有丝分裂作用物理条件物理条件pH，渗透压，溶解氧（Dissolved oxy

2、gen）细胞培养基第2页，此课件共36页哦3细胞培养工业过程的两个阶段细胞培养工业过程的两个阶段细胞扩增（与化学过程催化剂角色相似）产物形成（蛋白质表达）或细胞分化（细胞治疗）不同阶段分别优化细胞培养过程优化细胞培养过程优化充分了解细胞的生理需要和代谢特点生长培养基与生产培养基分别优化结合生物反应器操作，操纵细胞生长与代谢行为操纵细胞生长与代谢行为，使过程效益（或效率）最大化 细胞生长环境优化细胞培养工程南开大学药学院 第3页，此课件共36页哦在体内，细胞与血液不直接接触，物质交换依赖于庞大的毛细血管网络与细胞间质中的扩散过程胞间质浓度（mM）胞内浓度（mM）Na+14014K+4.0140C

3、a2+1.20.01Mg2+0.720Cl-1084HCO3-28.310HxPO4y-211SO42-0.51Amino acids28Lactate1.21.5Glucose56Protein24Total Chemicals(mM)301.8302.2CorrectedOsmolarity(mM)281.3281.3 体内细胞间质的化学环境Source:Cell Culture Bioprocess Eng.pp100细胞培养工程南开大学药学院 第4页，此课件共36页哦生物体液生物体液血清血浆胚胎提出物淋巴液蛋白质水解物 天然培养基细胞培养工程南开大学药学院 5第5页，此课件共36页哦6

4、 现代培养基类型细胞培养工程南开大学药学院 基底培养基（基底培养基（Basal Media）糖氨基酸脂肪酸，脂类前体维生素，核苷类普通盐类，微量元素pH 缓冲体系添加物（添加物（Supplements）血清生长因子/载体蛋白质蛋白质水解物（含）血清培养基血清培养基无血清培养基无血清培养基（Serum-free media）第6页，此课件共36页哦7 培养基比较细胞培养工程南开大学药学院 复合（血清）培养基复合（血清）培养基 （Complex media）血清含量可占到 20%成分非完全确定血清植物蛋白质水解物大豆磷脂化学定义培养基化学定义培养基 （Chemically defined medi

5、a）所有成分明确可能含有基因工程表达的蛋白质多肽生长因子细胞因子载体蛋白第7页，此课件共36页哦8 培养基比较细胞培养工程南开大学药学院 无血清培养基无血清培养基 （Serum-free media）不含血清成分完全确定成分非完全确定植物蛋白质水解物大豆磷脂无动物成分培养基无动物成分培养基 （Animal component-free media)所有成分明确可能含有生长因子细胞因子载体蛋白为了避免动物病毒或朊蛋白污染，为了避免动物病毒或朊蛋白污染，无血清培养基或无动物成无血清培养基或无动物成分培养基已经成为工业标准，贯穿细胞库构建和生产过程。分培养基已经成为工业标准，贯穿细胞库构建和生产过程

6、。第8页，此课件共36页哦9 培养基比较细胞培养工程南开大学药学院 无蛋白培养基无蛋白培养基 （Protein-free media）不含血清不含任何蛋白质成分成分可能含有蛋白质水解物非成分明确脂类或脂肪酸第9页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院化学成分化学成分F12DMEMD/F12(1:1)CaCl2CaCl22H2OCa(NO3)24H2OCuSO45H2OFeSO47H2OFe(NO3)39H2OKClMgSO4MgCl2MgCl26H2ONaClNaHCO3NaH2PO4H2ONa2HPO4Na2HPO412H2OZnSO47H2O33.220.00240.830.1022

7、3.6057.22759911761420.8620040097.6764003700125116.60.00130.4170.05311.848.8428.646995.5243862.571.020.43化学成分化学成分F12DMEMD/F12(1:1)丙氨酸精氨酸H2O天冬氨酸天冬酰胺H2O半胱氨酸HClH2O胱氨酸胱氨酸2HCl谷氨酸谷氨酰胺甘氨酸组氨酸HClH2O羟脯氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸HCl蛋氨酸苯丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸酪氨酸2Na2H2O缬氨酸8.9021113.315.0135.1214.71467.521413.136.54.5534.510.511.927

8、.8111.7846358430421051051463066429516104944.45147.56.657.5017.5631.297.3536518.7531.4854.4759.0591.2517.2435.4817.2526.2553.45 9.0255.7952.85化学成分化学成分F12DMEMD/F12(1:1)氯化胆碱葡萄糖还原型谷胱甘肽HEPES次黄嘌呤（Na）i-肌醇亚油酸硫辛酸酚红腐胺2HCl丙酮酸（Na）胸苷1418024.77180.0840.211.20.1611100.74.045007.2158.9831512.3912.60.0420.1058.10.08

9、1550.365化学成分化学成分F12DMEMD/F12(1:1)对氨基苯甲酸生物素泛酸钙叶酸烟酰胺吡哆醛HC1吡哆醇HCl核黄素硫胺素HCl维生素 B120.00730.51.30.0360.060.0370.31.44.04.04.04.00.44.00.00352.242.652.022.00.030.222.170.68 基底培养基（mg/L）第10页，此课件共36页哦11 基底培养基成分分类细胞培养工程南开大学药学院 计量性消耗大部分基底培养基成分，包括葡萄糖、氨基酸、维生素、核苷酸、脂类、脂肪酸、部分盐类、部分生长因子消耗量与胞内能量产生、细胞生长和产物生成呈正相关计量关系陪伴类大

10、宗盐类如 Na+、Cl-，白蛋白以及某些生长因子胞内能量产生、细胞生长和产物生成所需量很小第11页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院12pH 值范围值范围多数细胞系在 7.4 下生长良好转化细胞系：7.0-7.4常用指示剂常用指示剂-酚红酚红pH 7.8 紫色pH 7.6 红色略带蓝色pH 7.4 红色pH 7.0 橙色pH 6.5 黄色 培养基的物理性质-pH缓冲系统缓冲系统细胞产生 CO2 和乳酸NaHCO3 缓冲系统生理 pH 区间缓冲能力差毒性小成本低HEPES 缓冲系统pH 7.2-7.6 缓冲能力较强浓度：5-20 mM成本高第12页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学

11、药学院13渗透压渗透压多数细胞耐受 260-320 mOsm/kg人细胞浆的渗透压：290 mOsm/kg更高的渗透压通常会使细胞生长速率减缓，但也常可使蛋白产物的合成速率加快培养基营养物总浓度上限测量方法Freezing-point depressionElevation of vapor pressure 培养基的物理性质 渗透压第13页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院14温度温度温度对细胞生长有直接作用；避免温度过高；在离开细胞培养环境之后，最好将培养直接置放在碎冰上；过程开发：在细胞密度达到适合程度时，降低培养温度（如 30oC），阻止细胞生长但不阻止蛋白质合成。培养基的物

12、理性质 温度Q:培养基使用前需要预热吗？培养基使用前需要预热吗？第14页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院15表面张力和泡沫表面张力和泡沫贴壁培养：培养基表面张力可促进贴壁细胞在介质上贴附悬浮培养：气泡形成是为细胞生长提供溶氧的主要机制泡沫会使蛋白质变性的速率增加。加入硅油消泡剂降低表面张力，有助于防止泡沫生成泡沫达到培养容器的顶部会增加污染的危险泡沫在液面上的破碎过程是能量快速释放的过程，会造成细胞的严重伤害。Pluronic F68 培养基的物理性质 表面张力第15页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院16 细胞培养基的基本组成（1）水水培养基缓冲液主要污染物无机物：包括

13、重金属、铁、钙、氯等。有机物：主要是植物腐败的副产物和洗涤剂。细菌：热原。颗粒：主要是气溶胶物质。注射用水（Water for injection,WFI）水纯化单元操作：过滤、活性炭吸附、超滤、蒸馏、离子交换、反渗透、紫外氧化。大规模生产：316L 不锈钢；高温循环第16页，此课件共36页哦能源和碳源物质能源和碳源物质六碳糖及糖酵解的产物葡萄糖：5-20 mM半乳糖：果 糖：Glut-5，少数细胞种类丙酮酸：主要代谢产物：ATP，乳酸，CO2，TCA循环谷氨酰胺：2-6 mM消耗量相当于葡萄糖的10-20%蛋白质合成为核苷合成提供氨基经-酮戊二酸进入TCA循环脱氨反应水溶液自分解血清具有谷氨

14、酰胺酶活性 细胞培养基的基本组成（2）Glut-1，大多数细胞种类第17页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院18 细胞培养基的基本组成（3）氨基酸氨基酸：蛋白质合成、含氮化合物的前体，能源。必需氨基酸必需氨基酸：细胞无法自我合成；谷氨酰胺：细胞能量代谢、蛋白质合成；若干其它氨基酸：可能 12 种，必须从培养基中摄取。非必需氨基酸非必需氨基酸：其余 7 种氨基酸可在细胞内自己合成，或通过转氨作用由其他物质转化而来；对谷氨酰胺谷氨酰胺的利用量通常超过其它必需氨基酸的总和；丙氨酸丙氨酸常是被大量生成的氨基酸（谷氨酰胺代谢）；各种细胞对氨基酸的种类和浓度有不同的要求，对氨基酸的利用也有差别，

15、但除了谷氨酰胺外，通常亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸的利用量较大；脯氨酸脯氨酸为重组 CHO 细胞所特需，天冬酰胺为某些肿瘤细胞系所必需；甘氨酸甘氨酸有时在叶酸缺乏或甲氨蝶呤和氨基蝶呤存在下需要，丝氨酸常在克隆密度下所必需；具体氨基酸利用情况需要通过氨基酸分析（具体氨基酸利用情况需要通过氨基酸分析（HPLC）结果决定，不要被必需）结果决定，不要被必需/非必非必需氨基酸生化定义所误导。需氨基酸生化定义所误导。第18页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院19 细胞培养基的基本组成（4）维生素维生素维持细胞正常生理状态的重要生物活性化合物，在细胞中多以酶的辅

16、基或辅酶形式存在，对细胞的代谢过程有重要影响。水溶性维生素：水溶性维生素：生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醛（醇）、泛酸、核黄素、硫胺素、维生素B12、维生素C、对氨基苯甲酸等。脂溶性维生素：脂溶性维生素：维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等溶解方法：先高浓度溶于有机溶剂如酒精维生素的用量因细胞而异，但通常培养基中的量已经能够满足大多数细胞系的需要。第19页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院20 细胞培养基的基本组成（5）无机离子无机离子大宗离子大宗离子常见：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO4-、SO42-Na+/K+：细胞膜电位Na+/CI-：维持渗透压平衡Mg2+：

17、酶反应的辅因子Mg2+/Ca2+：细胞贴附HPO4-/HCO3-:缓冲作用微量元素微量元素常见：铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜 其它：无蛋白长期培养往往需要钴、锆、锗、镍、锡、铬、铝、锂、溴、碘、硼、氟、硅、钛、铷、银、钡等。试剂等级试剂等级化学品和添加剂中普遍存在污染物和杂质药典级如 USP分析纯第20页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院21 细胞培养基的基本组成（6）脂类和磷脂前体脂类和磷脂前体有血清细胞培养有血清细胞培养：脂类来自于血清无血清无血清/无蛋白培养无蛋白培养：需要添加脂类如胆固醇、脂肪酸、磷脂。胆 碱：卵磷脂合成前体乙醇胺：脑磷脂合成前体肌 醇：肌醇磷脂合成前体核酸前体

18、核酸前体核酸(RNA/DNA)前体通常不是培养基的必需成分缺陷型 CHO 细胞：叶酸不足，添加嘌呤类（腺嘌呤和次黄嘌呤）和胸腺嘧啶有益于细胞生长。第21页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院22 细胞培养基的基本组成（7）非营养性物质 调节细胞的物理化学环境，间接影响细胞行为；抗生素：对细胞生长有不利影响，尽量避免；pH 缓冲剂：碳酸氢钠：常用 26 mM，与 5-10%CO2 平衡；HEPES：10-50 mM，更高会产生细胞毒性。pH 指示剂：酚红 商业化生产不予采用第22页，此课件共36页哦血 清主要类型胎牛血清（Fetal bovine serum）小牛血清（Calf seru

19、m）马血清（Horse serum）人血清（Human serum）主要作用促进细胞贴壁，多数原代细胞及许多细胞株具有贴壁生长要求；刺激细胞生长与细胞分裂；细胞营养来源；对细胞的保护作用。细胞培养工程 南开大学23第23页，此课件共36页哦血清成份（1）蛋白质蛋白质白蛋白（Albumin）：转运（如脂类）、缓冲与保护功能纤维连接蛋白（Fibronectin）：细胞贴壁胎球蛋白（Futuin）：细胞贴壁（不是甲胎蛋白）巨球蛋白（2-Macroglobulin）：抑制胰蛋白酶 Transferrin（转铁蛋白）：与铁结合，使其失去毒性并转运抗体与补体（Antibodies&complements）

20、：多肽类多肽类血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）胰岛素类生长因子（Insulin-like growth factor，IGFI/II）成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）上皮细胞生长因子（Epidermal growth factor，EGF）细胞培养工程南开大学药学院24第24页，此课件共36页哦激素激素胰岛素（Insulin）：葡萄糖吸收，刺激有丝分裂；氢化可的松（Hydrocortisone）：贴壁，生长，分化；代谢产物与营养物代谢产物与营养物氨基酸葡萄糖酮酸许多其他营养物和中间代谢物矿

21、物质类矿物质类血清蛋白：微量元素和铁、铜和锌硒：与还原型谷胱甘肽一起发挥抗氧化作用，保护细胞抑制剂抑制剂细菌毒素细胞培养工程南开大学药学院25血清成份（2）第25页，此课件共36页哦取血（Blood collection）减少供体动物痛苦；无菌操作；自然凝血（Natural clotting,4oC）血小板细胞释放关键生长因子，如 PDGF；离心去除较大固体物质；过滤：去除颗粒性物质，最终达到无菌微生物污染，包括支原体和噬菌体；膜过滤：1.2、0.8、0.65、0.45、0.22、0.1 微米；0.1 微米多次。血清的制备方法细胞培养工程南开大学药学院 26第26页，此课件共36页哦特殊血清透

22、析血清（透析血清（Dialyzed serum）采用膜透析（生理盐水），去除干扰小分子化合物采用膜透析（生理盐水），去除干扰小分子化合物活性炭活性炭/葡聚糖处理胎牛血清葡聚糖处理胎牛血清（Charcoal/dextran treated FBS）降低类固醇激素含量如黄体酮降低血清批次间差异热灭活血清（热灭活血清（Heat inactivated serum）血清中补体成分造成干扰30 minutes of treatment at 56C（水浴）-射线辐射射线辐射降低血清中潜在病毒浓度 106 倍27Source：http:/ 第27页，此课件共36页哦筛选品种和批次之间存在生物活性差异；购买

23、前，应针对支持细胞生长的能力进行筛选；筛选后，备足够数量以供长期使用。冷冻储藏保持血清成分的生物活性；分装冻存解冻：2-8 oC，期间轻轻混匀以减少蛋白质沉淀；解冻后，无菌操作，分装 50 毫升无菌离心管；-80oC 冻存。注意事项血清的储藏细胞培养工程南开大学药学院 28第28页，此课件共36页哦血清质量证明Certificates of Analysis:Filtration statementCountry of originCell growth performance testingMicrobial sterility testingScreening:mycoplasmaviru

24、sendotoxinhaemoglobinIgGtotal protein29细胞培养工程南开大学药学院 第29页，此课件共36页哦血清的主要问题血清原料来源有限血清批次之间生物活性差异较大血清是蛋白质药物生产的主要原料成本之一蛋白质药物纯化成本一般占蛋白质生产的总成本的 50%以上血清会引入大量杂质蛋白质（如 IgG），大幅度增加纯化难度和成本BSA：过敏反应，药典安全水平 50 ng/剂量潜在生物污染病毒朊蛋白（疯牛病）细胞培养工程南开大学药学院 30血清对细胞的负面作用抗体交叉反应干扰第30页，此课件共36页哦胰岛素 vs 胰岛素样生长因子-1（IGF-1）胰岛素对许多细胞类型有调控葡萄

25、糖吸收的作用；在较高浓度时，通过与 IGF-1 共享信号传导通路，胰岛素也具有促有丝分裂作用；IGF-1 可以刺激 DNA、蛋白质、糖原合成以及细胞周期蛋白 D；浓度胰岛素：1-10 g/ml（血液正常浓度 1.3）IGF-1：100-200 ng/ml尽管不涉及内吞，胰岛素本身仍有稳定性问题，半衰期很短，IGF-1 则相对比较稳定基因重组胰岛素和 IGF-1 上市 无血清培养基主要添加物细胞培养工程南开大学药学院 31第31页，此课件共36页哦转铁蛋白（Transferin）80 kDa 糖蛋白，N 和 C 端都有结合域与 Fe3+结合转铁蛋白与受体结合之后被内吞并转移至溶酶体，Fe3+在酸

26、性环境中被释放，转铁蛋白则迁移至胞外，循环利用；胰岛素对许多细胞类型有调控葡萄糖吸收的作用；转铁蛋白与异种受体结合能力比较弱；基因重组人转铁蛋白上市可被其它蛋白质取代如血红蛋白可被铁络合物取代（如柠檬酸铁），但需要较高浓度 无血清培养基主要添加物细胞培养工程南开大学药学院 32toxic第32页，此课件共36页哦血清白蛋白血清中最丰富的蛋白质难溶物的载体：游离脂肪酸结合有害混合物：胆红素、重金属离子0.1-5 mg/ml基因工程人血清白蛋白上市 无血清培养基主要添加物细胞培养工程南开大学药学院 33toxic第33页，此课件共36页哦蛋白水解物动物或植物组织水解物或提取物曾经用于细胞培养，以减

27、少对血清的依赖；动物来源水解物或提取物现已剔除，取而代之的是大豆、稻米、小麦的酶或酸水解物；含有氨基酸、短肽、无机盐、碳水化合物和维生素；功能：以短肽形式提供氨基酸，以较小渗透压代价富化培养基某些短肽可能起到细胞因子的模拟混合物，与受体结合，起到促进细胞生长、延缓细胞凋亡的作用 无血清培养基主要添加物细胞培养工程南开大学药学院 34第34页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院35实验技术 1 培养基过滤醋酸纤维素膜结构非对称性亲水性干燥：空气通过湿润：空气排斥过滤前后完整性测试第35页，此课件共36页哦细胞培养工程南开大学药学院36实验技术 1 培养基过滤滤器准备第36页，此课件共36页哦