诱变育种加上lys育种实例.ppt

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1、第二部分 工业微生物诱变育种第一节第一节 诱变剂诱变剂第二节、诱变育种步骤与方法第二节、诱变育种步骤与方法诱变第一节第一节 诱变剂诱变剂 一、诱变剂和诱变处理 诱变剂（mutagen）：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变频率的物理因子或化学物质。物理诱变剂：紫外线、X射线、射线，快中子；化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。诱变剂n物理诱变剂n化学诱变剂n非电离 辐射n碱基类似物5-BU，5FU，2-AP，2MPn电离 辐射n紫外线n机制n快中子X射线r射线n烷化剂n单功能n多功能n亚硝基胍NTGn机制n甲基磺酸乙酯EM

2、Sn硫酸二乙酯DESn移码突变剂 吖啶类，ICRn机制两个碱基间插入吖啶类分子常用诱变剂的诱变机理使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。第二节、诱变育种步骤与方法第二节、诱变育种步骤与方法出发菌株的选择出发菌株的选择处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备诱

3、变处理诱变处理中间培养中间培养分离和筛选分离和筛选诱变育种前的准备工作诱变前对出发菌株的了解了解菌种特性与生产性能的关系了解影响菌种生长发育的主要因素了解菌种有效成分中各组分在代谢合成过程中与培养条件的关系建立一个准确、简便、快速检测产物的方法研究最佳的菌种保藏培养基和条件区分不同菌落类型出现不同菌落类型的原因培养基斜面制备技术移种密度温度药品和原材料一一 出发菌株的选择出发菌株的选择1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3采用有利性状的菌株，如生长速度快，产孢子早而多。4某次诱变后对其他诱变剂敏感的菌

4、株。5采用“增变菌株”。6在选择氨基酸或核苷酸的出发菌株时，应考虑能少量积累所需产物或其前体的菌株，选择抗生素的出发菌株时，选择每次诱变效价都有一定提高的菌株。（一）一般出发菌株的要求（二）选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株（三）选择纯种作出发菌株。（四）选择出发菌株应考虑其稳定性。（五）连续诱变育种过程中如何选择出发菌株（六）选择出发菌株的其他因素（七）采用多出发菌株（八）菌种的代谢特点 二二 单孢子悬液的制备单孢子悬液的制备（一）菌悬液制备的要求如下：1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。（同步、旺盛、单细胞或单核孢子）2、细菌选择对数期，孢子刚刚成熟的新鲜孢 子。（霉菌孢子

5、浓度106ml放线菌孢子浓度106-107ml）3、对不产孢子的真菌 4、制备原生质体为诱变材料菌丝尖端法处理菌落周围的尖端菌丝混合培养法原生质体是异质的不具有细胞壁不产孢子的菌株诱变时会有遗传分离或遗传不稳现象（二）菌悬液制备的方法：细菌经2024h培养的新鲜斜面基本培养基培养至对数期于6培养1h，使之同步加入一定的嘧啶嘌呤或酵母膏培养2060min离心用生理盐水或缓冲液制备菌悬液用盛有玻璃珠的三角瓶中分散无菌脱脂棉或滤纸过滤菌体计数、调节浓度三三 诱变处理诱变处理（一）诱变剂种类的选择 1、根据各种诱变剂诱变机理和菌株的特性 2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂 3、参考出发菌株原有的

6、诱变系谱来选择 对遗传稳定的菌株，采用从前没使用过、突变谱宽、诱变效果强的诱变剂 对遗传不稳定的菌株，先自然分离，然后用温和的诱变剂或诱变史上有效的诱变剂。40突变频率正突变辐射剂量/krad负突变形态突变40突变频率正突变处理时间负突变亚热带链霉素的白霉素高产菌39#X射线辐射量与变异的关系低产的B12产生菌乙烯亚胺处理时间与变异的关系（二）最适诱变剂剂量的选择（三）诱变剂的处理方式 1、单因子处理 2、复合因子处理：两个以上的因子同时处理 不同诱变剂交替处理 同一种诱变剂连续重复使用 紫外线光复活交替处理 （四）诱变处理中影响突变率的因素1、菌种的遗传特性不同2、菌体的细胞壁结构不同3、环

7、境条件的影响 诱变前预培养和诱变后培养 温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响 平皿密度效应 四四 中间培养中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。表型延迟（phenotype lag）：指微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当代出现，其表型必须经过2代以上的遗传复制。方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。