实验二植物体内硝酸还原酶活力的测定.ppt

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1、实验二 植物体内硝酸还原酶活力的测定植物生物学实验植物生物学实验-植物生理部分植物生理部分n nNO3-和NH4+是能被植物利用的最主要的氮源。在一般田间条件下，NO3-是植物吸收的主要形式。硝酸盐的还原硝酸盐的还原硝酸盐硝酸盐硝酸还原酶硝酸还原酶亚硝亚硝酸盐酸盐氨氨亚硝酸还原酶亚硝酸还原酶 硝硝酸酸还还原原酶酶是是一一种种诱诱导导酶酶，在在植植物物体体内内本本来来不不含含有有，但但在在特特定定外外来来物物质质的的如如NONO3 3-诱诱导导下下可以生成硝酸还原酶。可以生成硝酸还原酶。n n硝酸还原酶（硝酸还原酶（硝酸还原酶（硝酸还原酶（NRNR）是植物氮素同化的关键酶，它催）是植物氮素同化的

2、关键酶，它催）是植物氮素同化的关键酶，它催）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO NO3 3-+NADH+H+NADH+H+NO NO2 2-+NAD+NAD+H+H2 2OO 产生的亚硝酸盐与对产生的亚硝酸盐与对产生的亚硝酸盐与对产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰胺）及胺）及胺）及胺）及-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量萘胺（或萘基乙

3、烯胺）在酸性条件下定量萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成红色偶氮化合物。生成红色偶氮化合物。生成红色偶氮化合物。NR【实验原理】【实验原理】生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以单位时间内每克鲜重含氮量表示，即以g/g/h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。n n小麦的新鲜叶片（诱导组和非诱导组）【实验材料】n n冷冻离心机；分光光度计；天平(0.01g)；冰箱；恒温水浴；研钵；剪刀；离心管；移液管(5、2、1mL)；洗耳球；试

4、管架；(12)胶头滴管。【实验器材】n n标准曲线制作 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度（g/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（r）建立回归方程。【实验步骤】【实验步骤】管号管号管号管号1 12 23 34 45 56 67 7试剂试剂试剂试剂取量取量取量取量mLmL亚亚亚亚硝酸硝酸硝酸硝酸钠标钠标钠标钠标准液准液准液准液0 00.10.10.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水1.01.00.90.90.80.80.60.60

5、.40.40.20.20 01%1%磺胺磺胺磺胺磺胺2 22 22 22 22 22 22 20.2%0.2%萘萘萘萘基乙基乙基乙基乙烯烯烯烯胺胺胺胺 2 22 22 22 22 22 22 2每管每管每管每管亚亚亚亚硝硝硝硝态态态态氮氮氮氮浓浓浓浓度度度度g/mLg/mL0 00.020.020.040.040.080.080.120.120.160.160.200.201.1.酶的提取酶的提取酶的提取酶的提取 称取称取称取称取0.5-1g 0.5-1g 鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎鲜样（诱导组和非诱导组分

6、别进行），剪碎置冰箱冰冻置冰箱冰冻置冰箱冰冻置冰箱冰冻30min30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵洗研钵洗研钵洗研钵2-32-3次，将液体转入离心管中，共用提取液次，将液体转入离心管中，共用提取液次，将液体转入离心管中，共用提取液次，将液体转入离心管中，共用提取液6 6 mLmL，4 4 8000rpm 8000rpm离离离离心心心心15min15min，上清液即为粗酶提取液。，上清液即为粗酶提取液。，上清液即为粗酶提取液。，上

7、清液即为粗酶提取液。2.2.酶反应酶反应酶反应酶反应 取取取取4 4个个个个10 10 mLmL离心管，按照下表所列进行操作，混匀，离心管，按照下表所列进行操作，混匀，离心管，按照下表所列进行操作，混匀，离心管，按照下表所列进行操作，混匀，2525保保保保温温温温30min30min。n n终止反应和比色测定终止反应和比色测定终止反应和比色测定终止反应和比色测定 30min 30min后立即加入后立即加入后立即加入后立即加入l mLl mL磺胺溶液终止酶反应，磺胺溶液终止酶反应，磺胺溶液终止酶反应，磺胺溶液终止酶反应，再加再加再加再加l mLl mL萘基乙烯胺溶液，显色萘基乙烯胺溶液，显色萘基

8、乙烯胺溶液，显色萘基乙烯胺溶液，显色30min30min后于后于后于后于4000rpm4000rpm离心离心离心离心5min5min，取上清液在，取上清液在，取上清液在，取上清液在540nm540nm下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（g/mL g/mL）。）。）。）。反应底物反应底物 酶反应管酶反应管 粗酶液粗酶液/mL 0.1mol/LKNO3磷磷酸缓冲液酸缓冲液/mL NADH溶溶液液/mL 0.1mol/L pH7.

9、5磷酸缓冲液磷酸缓冲液/mL 非非诱导诱导对照对照 1.0 1.6 0 0.2 非非诱导诱导实验实验 1.0 1.6 0.2 0 诱导诱导对照对照 1.0 1.6 0 0.2 诱导诱导实验实验 1.0 1.6 0.2 0 【结果计算】【结果计算】样品中酶活性（样品中酶活性（g gg g-1-1hh-1-1）=X X 反应液酶催化产生的亚硝态氮浓度（反应液酶催化产生的亚硝态氮浓度（g/mLg/mL）；）；V1V1提取酶时加入的提取缓冲液体积（提取酶时加入的提取缓冲液体积（mLmL）；）；V2V2酶反应时加入的粗酶液体积（酶反应时加入的粗酶液体积（mLmL）；）；V3V3与磺胺等发生颜色反应的总体积（与磺胺等发生颜色反应的总体积（mLmL）；）；W W 样品质量（样品质量（g g）；）；t t 反应时间（反应时间（h h）。）。X*V3/V2*V1W*t【注意事项】n n硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4下进行。n n制作标准曲线时，从显色到比色时间尽可能保持一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。【思考与作业】【思考与作业】n n 比色测定前加入磺胺和萘基乙烯胺的顺序不能颠倒的原因是什么？