分子杂交.ppt

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1、1分子杂交分子杂交MolecularHybridization分子杂交分子杂交n分子杂交（分子杂交（molecularhybridization）分子生物学中用于检测生物样本中是否含分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。有特定的生物分子的一门技术。分子杂交分子杂交固相杂交固相杂交液相杂交液相杂交滤膜杂交滤膜杂交原位杂交原位杂交印迹杂交印迹杂交斑点杂交斑点杂交SouthernblotNorthernblotWesternblot分子杂交分类分子杂交分类支持物不同支持物不同 概念：概念：参加反应的一条核酸链被预先固定参加反应的一条核酸链被预先固定在在固体支持物固体支持物上

2、，另一条上，另一条反应核酸反应核酸则游离在溶液中则游离在溶液中进行的杂交反应。进行的杂交反应。固相支持物：固相支持物：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板，乳胶颗粒、磁珠、微孔板，芯片等芯片等固相杂交固相杂交u分类：分类：杂交后，游离片段杂交后，游离片段容易经漂洗除去容易经漂洗除去；菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、SouthernSouthern印迹杂交、印迹杂交、NorthernNorthern印迹杂交、印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。组织原位杂交和夹心杂交等。u 固相杂交的特点：固相杂交的特点：支持物上留下的支持物上

3、留下的杂交物容易检测杂交物容易检测；能防止能防止靶靶DNADNA自我复性自我复性。因此，该法最为常用。因此，该法最为常用。液相杂交液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。在溶液中。o定义：定义：杂交后溶液中过量的未杂交探针杂交后溶液中过量的未杂交探针难以除去，误差较高。难以除去，误差较高。应用不广。应用不广。o特点：特点：分子杂交分类分子杂交分类nSouthernBlot -DNA杂交杂交nNorthernBlot -RNA杂交杂交nWesternBlot -蛋白质杂交蛋白质杂交核酸分子杂交核酸分子杂交分子杂交流程图分子杂交流程图样样品品制制备备电电泳泳杂杂交

4、交转转膜膜结结果果显显示示探针探针/抗体制备抗体制备按片断长短进行分离凝胶中的片段转移到固相支持物DNA/DNADNA/RNA抗原/抗体提取DNA/RNA/蛋白放射自显影荧光检测显色技术ProtectionofINS-1CellsFromFreeFattyAcidInducedApoptosisbyTargetinghOGG1toMitochondriaRacheket.al,Diabetes,2006STORYBACKGROUNDPancreaticbetacellpChronicexposuretoelevatedlevelsoffreefattyacids(FFAs)impairspan

5、creaticcellfunctionandcontributestothedeclineofinsulinsecretionintype2diabetes.pFFAsdamagedmitochondrialDNA(mtDNA)andultimatelyledtoapoptosisinINS-1cells.STORYBACKGROUNDHuman8-oxoguanineDNAglycosylase/apuriniclyase(hOGG1)糖基化酶糖基化酶hOGG1hOGG1是细胞修复是细胞修复DNADNA氧化损伤特异性产物氧化损伤特异性产物8-8-羟基羟基鸟嘌呤鸟嘌呤(8-OHdG)(8-OH

6、dG)的重要酶类的重要酶类IntegrateMTS-OGG1intotheINS-1cellulargenomeWHAT DID THEY WANT TO DO?MTS-OGG1transfected INS-1 cellsMitochondrialtargetingsequence(MTS)pMTS-OGG1cellsshowedasignificantdecreaseinFFA-inducedmtDNAdamagecomparedwithvector-onlytransfectants.phOGG1overexpressioninmitochondriadecreasedFFA-induc

7、edinhibitionofATPproductionandprotectedINS-1cellsfromapoptosis.RESULTHow to identify hOGG1 expression in mitochondria of INS-1 cells?A:SouthernblotanalysisusingtheMTS-OGG1sequenceasaprobe.B:WesternblotanalysisusinghOGG1antiserum.Immunodetectionofcytochromecwasperformedtoassuremitochondriallocalizati

8、on.SouthernblotWesternblotamtDNA-specificprobeNeuronatin,aDownstreamTargetofBETA2/NeuroD1inthePancreas,IsInvolvedinGlucose-MediatedInsulinSecretionKhoiChu,Diabetes,2005pBETA2(NeuroD1)isamemberofthebasichelix-loop-helixtranscriptionfactorfamily.BETA2playsanimportantroleinthedevelopmentofthepancreasas

9、aregulatoryfactorforthetranscriptionoftheinsulingene.pUsingmicroarraytechnology,neuronatin(Nnat)wasidentifiedasdifferentiallyexpressedbetweenwild-type(WT)andknockout(KO)pancreaticRNAfromembryonicday14(e14.5).STORYBACKGROUNDWHAT DID THEY WANT TO DO?confirmthedownregulationofNnatinpancreasofmutantBETA

10、2embryosHow to do?NorthernblotandinsituhybridizationRESULT35Sor33P-UTPlabeledprobesaprobeencodingforGLUT2,amarkerforendocrinecellsinthepancreasinsituhybridizationNnat transcriptswereabsentfromKORNAsamplesate16.5.Thisdecreasewasparalleledbyamarkedreductionininsulinandglucagontranscripts,twoknowntarge

11、tgenesofBETA2,whereastheexpressionoftheexocrinemarkeramylasewasunaltered.RESULTNorthernblot21核酸分子杂交核酸分子杂交一、核酸分子杂交（一、核酸分子杂交（nucleotidemolecularhybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程过复性处理后，形成异源双链的过程核酸分子杂交过程一般需要经历了核酸核酸分子杂交过程一般需要经历了核酸

12、的变性和复性两个阶段。的变性和复性两个阶段。DNA的变性（denaturation）DNA分子在某些理化因素的作用下，其两条互补链之间的氢键发生断裂，双螺旋结构松开分成两条单链。变性DNA的两条互补单链，在适当条件下,重新结合恢复双螺旋结构的过程，称为DNA的复性。DNA的复性（的复性（renaturation）核酸经核酸经加热变性加热变性后，在低于变性温度后，在低于变性温度2020 3030时，反应系统中加入的时，反应系统中加入的核酸探针核酸探针与待测核酸样品中具有与待测核酸样品中具有互补序列互补序列的单链的单链DNADNA或或RNARNA形成双链结构形成双链结构，通过检测，通过检测标记信号

13、标记信号即即可检测特定的核苷酸片段。可检测特定的核苷酸片段。核酸分子杂交技术原理核酸分子杂交技术原理p热变性热变性p酸碱变性酸碱变性核酸溶液pH10时，核酸分子的双链完全打开。常用碱变性法。p化学试剂变性化学试剂变性常用的化学试剂有：尿素、甲酰胺、甲醛等。常用变性方法常用变性方法二、核酸探针二、核酸探针 核酸探针（核酸探针（nucleic probenucleic probe）:带有可带有可检测标记，能与特定序列的核酸片段互检测标记，能与特定序列的核酸片段互补配对形成双链的一段核苷酸。补配对形成双链的一段核苷酸。核酸探针的质量（核酸探针的质量（标记标记效率效率和和特异性特异性）是核酸分）是核酸

14、分子杂交成功的关键。子杂交成功的关键。核酸探针的分类核酸探针的分类根据标记物的性质分：根据标记物的性质分：v 放射性标记放射性标记:3232P,P,3535S,S,125125I,I,3 3H H。v 非放射性标记非放射性标记：化学发光标记、酶标记、：化学发光标记、酶标记、荧光标记等荧光标记等n放射性核素放射性核素：核酸探针传统的标记物核酸探针传统的标记物p优点：优点：l灵敏性高：灵敏性高：0.55pgl特异性高：放射自显影法特异性高：放射自显影法l方法简便。方法简便。p缺点：缺点：l半衰期短，必须经常标记探针（半衰期短，必须经常标记探针（3H的半衰期长达的半衰期长达12.3年，年，但它所释放

15、但它所释放放射线能量太低放射线能量太低，只能用于组织原位杂交）只能用于组织原位杂交）l费用高费用高l检测时间长：曝光时间检测时间长：曝光时间115天天l放射性同位素对人体有害，实验室和环境易被污染放射性同位素对人体有害，实验室和环境易被污染n非放射性标记物非放射性标记物p优点：l无放射性污染；l稳定性好；l探针可长时间保存。p缺点：灵敏度及特异性不高。非放射性标记物的种类n半抗原半抗原：地高辛地高辛，利用半抗原的抗体进行免疫学，利用半抗原的抗体进行免疫学检测。检测。n配体配体：生物素生物素，是一种抗生物素蛋白，是一种抗生物素蛋白avidin和链和链亲和素亲和素streptavidin的配体。的

16、配体。n荧光素荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明异硫氰酸荧光素和罗丹明，可被紫外线，可被紫外线激发出荧光而被检测到。激发出荧光而被检测到。n光密度或电子密度标记物光密度或电子密度标记物：金、银。金、银。根据探针中根据探针中核酸的性质核酸的性质分：分：DNA (DNA (包括包括cDNAcDNA)探针探针RNARNA探针探针(包括包括cRNAcRNA)寡核苷酸探针寡核苷酸探针肽核酸（肽核酸（peptide nucleic acid,PNApeptide nucleic acid,PNA）探针探针(1)DNA(1)DNA探针探针（包括（包括cDNAcDNA探针）：探针）：这类探针多这类探针多克隆在质粒

17、载体克隆在质粒载体中，可以无限中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。繁殖，取之不尽，制备方法简便。DNADNA探针探针不易降解不易降解（相对（相对RNARNA而言）。而言）。DNADNA探针的探针的标记方法较成熟标记方法较成熟，有多种方法可，有多种方法可供选择，能用于供选择，能用于同位素和非同位素标记同位素和非同位素标记。(2)RNA(2)RNA探针探针：主要是：主要是细胞细胞mRNAmRNA和和病毒病毒RNARNA探针。探针。vRNARNA探针和探针和cRNAcRNA探针的特点：探针的特点：RNA:DNARNA:DNA杂交体比杂交体比DNA:DNADNA:DNA杂交体有更高的稳定性。杂交

18、反应效率杂交体有更高的稳定性。杂交反应效率高、高、易于降解易于降解、标记方法复杂、标记方法复杂 。用途：用途：用于检测用于检测DNADNA和和mRNAmRNA，以及研究基因表达，以及研究基因表达中的转录。中的转录。vcRNAcRNA探针探针：以双链：以双链DNADNA中与中与mRNAmRNA序列相同的一序列相同的一条链为模板转录得到的条链为模板转录得到的RNARNA链，其序列与链，其序列与mRNAmRNA互互补，也称为反义补，也称为反义RNARNA。采用化学合成的短链核苷酸探针采用化学合成的短链核苷酸探针,最常用的最常用的寡核苷酸探针有寡核苷酸探针有18-4018-40个碱基。个碱基。(3)(

19、3)寡核苷酸探针寡核苷酸探针特点：特点：链短、序列复杂度低、分子量小链短、序列复杂度低、分子量小，与，与等量靶位点完全杂交的时间短。等量靶位点完全杂交的时间短。寡核苷酸探针可寡核苷酸探针可识别靶序列内识别靶序列内1 1个碱个碱基的变化基的变化。一次可大量合成寡核苷酸探针一次可大量合成寡核苷酸探针，使得使得这种探针价格低廉。这种探针价格低廉。探针设计的条件探针设计的条件 被检基因结构清楚；被检基因结构清楚；有明确的基因产物有明确的基因产物;具备下列条件之一，就可以设计、制备具备下列条件之一，就可以设计、制备特异性基因探针。特异性基因探针。核酸探针的常用标记方法核酸探针的常用标记方法 核酸探针的标

20、记核酸探针的标记几乎总是先将几乎总是先将脱氧单脱氧单核苷酸底物标记核苷酸底物标记相应相应的信号，然后的信号，然后利用核利用核酸合成酸合成的方法合成具的方法合成具有有标记信号的核苷酸标记信号的核苷酸链链。缺口平移法（缺口平移法（nick translationnick translation）PCRPCR法法 DNADNA快速末端标记快速末端标记 T4T4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记DNA 5DNA 5末端末端 随机引物延伸随机引物延伸 放射性探针的标记放射性探针的标记由由DNase和大肠和大肠杆菌杆菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNase：在双链在双链DNADNA上随机打开若上随

21、机打开若干个单链缺口，产干个单链缺口，产生生3 3-OH-OH端端大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶：5 533DNADNA聚聚合酶活性；合酶活性；5 533外切核酸酶活性外切核酸酶活性（1 1）缺口平移标记法）缺口平移标记法（nicktranslationnicktranslation）随机引物随机引物：含有各种：含有各种可能排列顺序的寡核可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。苷酸片段的混合物。4 46 6=4096=4096DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段片段5 533DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 弱弱3 355外切核酸酶活外切核酸酶活性性无无5 533外切核酸酶活外

22、切核酸酶活性性（2 2）随机引物法）随机引物法（random primingrandom priming）产物产物平均长度平均长度为为400-600个核苷酸。个核苷酸。Klenow片段没有片段没有53外切酶活性外切酶活性,反应稳定反应稳定,可以可以获得大量的有效探针。获得大量的有效探针。反应时对反应时对模板的要求不严格模板的要求不严格,用微量制备的质粒用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。模板也可进行反应。制备制备高比活性探针高比活性探针(10(101010 cpm/gDNAcpm/gDNA););Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：1、取2550mg模板DNA于0.5ml离心管

23、中，100水浴5min，立即置冰浴。2、在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5Buffer(含随机引物)10ldNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L)2l-32P dATP 3lKlenow 酶 5U3、将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50l混匀。室温或37 1h.4、加50 l终止缓冲液终止反应标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。由于-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。（3 3）末端标记法）末端标记法 T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶外切酶活性外切酶活性聚合酶活性聚合酶活性无无dNTPdNTP53聚合酶活性，聚

24、合酶活性，1500nt/min,为为polI的两倍的两倍35外切酶活性，可作用于外切酶活性，可作用于ssDNA和和dsDNA,其切除速度分别为其切除速度分别为40和和4000nt/min适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。*杂交信号检测杂交信号检测n放射自显影放射自显影利用放射线在利用放射线在X X线片上成线片上成影作用来检测杂交信号影作用来检测杂交信号非放射性探针的标记非放射性探针的标记生物素标记核酸生物素标记核酸 （光敏生（光敏生物素、酶促生物素）物素、酶促生物素）DNADNA半抗原标记半抗原标记 荧光素标记荧光素标记 以以生物素化的脱氧核苷三磷酸生物

25、素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-Bio-11-dUTP,Bio dUTP,Bio 7 7 dATP dATP、Bio-11 Bio-11-dCTPdCTP）等代等代替相应脱氧核苷三磷酸，经替相应脱氧核苷三磷酸，经DNADNA聚合酶作用聚合酶作用掺入新合成的掺入新合成的DNADNA。可以采用缺口平移法和可以采用缺口平移法和随机引物延伸法进行。随机引物延伸法进行。生物素标记法生物素标记法基本原理：基本原理：地高辛地高辛（Digoxigenin，DIG）是一种类固醇半抗原，是一种类固醇半抗原，来源于植物来源于植物(Digitalispurouren和和Digitalislanta)的的花和叶中，

26、其他生物体中不含花和叶中，其他生物体中不含有地高辛抗体。有地高辛抗体。DIG可以与可以与dUTP反应形成反应形成DIG-dUTP，通通过酶促法插入到合成的过酶促法插入到合成的DNA探探针中。通过酶标记的抗地高辛针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。抗体来实施检测。DNADNA半抗原半抗原标记标记 地高辛标记地高辛标记原理：原理：n非放射性核素探针的检测非放射性核素探针的检测p偶联反应偶联反应l半抗原:通过抗原-抗体反应与显色体系偶联。l配体:亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex，ABC）p显色反应显色反应通过连接在抗体或生

27、物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测。u酶学检测酶学检测 通过酶促反应使底物形成有色产物。通过酶促反应使底物形成有色产物。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRP HRP）和）和碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AKPAKP）u荧光检测荧光检测 异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITCFITC）和罗丹明（）和罗丹明（RhoRho)，可被紫外线激发，可被紫外线激发 出荧光而被检测到。主要应用于原位杂交。出荧光而被检测到。主要应用于原位杂交。u 化学发光法化学发光法 在化学反应过程中伴随的发光反应。适合于在化学反应过程中伴随的发光反应。适合于SouthernSouthern、NorthernNort

28、hern及斑点杂交。及斑点杂交。u 电子密度标记电子密度标记 利用重金属的高电子密度、在电子显微镜下进行检测，适合利用重金属的高电子密度、在电子显微镜下进行检测，适合 于细胞原位杂交。于细胞原位杂交。显色反应显色反应DABDAB辣根过氧化物酶显色试剂盒辣根过氧化物酶显色试剂盒(DABHorseradishPeroxidaseColorDevelopmentKit)DAB，3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride辣根过氧化物酶的常用底物。辣根过氧化物酶的常用底物。辣根过氧化物酶催化，辣根过氧化物酶催化，DABDAB会会产生棕色沉淀。产生棕色沉淀。BCIP/

29、NBTBCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBTAlkalinePhosphataseColorDevelopmentKit)BCIP/NBTBCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。是碱性磷酸酯酶的常用底物。在在碱碱性性磷磷酸酸酯酯酶酶的的催催化化下下，BCIPBCIP会会被被水水解解产产生生强强反反应应性性的的产产物物，该该产产物物会会和和NBTNBT发发生生反反应应，形形成成不不溶溶性性的的深深蓝蓝色色至至蓝紫色的蓝紫色的NBT-NBT-formazanformazan。化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒通过通过Str

30、eptavidinStreptavidin-HRP-HRP及及后续的后续的ECLECL试剂来实现试剂来实现化学发光检测化学发光检测BiotinBiotin标标记核酸的检测试剂盒记核酸的检测试剂盒。(ChemiluminescentBiotin-labeledNucleicAcidDetectionKit)Biotin-Biotin-StreptavidinStreptavidin-HRP-HRPDNABiotin-probeStreptavidin-HRP常用杂交方法介绍基本原理：基本原理：19751975年由年由英国人英国人southernsouthern创建，是研究创建，是研究DNADNA

31、图谱图谱的基本的基本技术，在技术，在遗传病遗传病诊断诊断、DNADNA图谱分析图谱分析及及PCRPCR产物分析产物分析等方等方面有重要价值。面有重要价值。DNADNA标本用限制性内切酶消化后，经标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分琼脂糖凝胶电泳分离离各酶解片段，然后将各酶解片段，然后将DNADNA从凝胶中从凝胶中转印至转印至滤膜上滤膜上与与探针探针杂交杂交。通过通过检测检测与探针互补与探针互补DNADNA条带来确定在众多酶解产物中条带来确定在众多酶解产物中含某一特定序列的含某一特定序列的DNADNA片段的位置和大小。片段的位置和大小。Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern

32、Blot）Southern Blot操作流程1 1、基因组、基因组DNADNA的提取的提取2 2、限制性内切酶切断、限制性内切酶切断DNADNA3 3、电泳分离、电泳分离DNADNA片段片段,变性变性4 4、将、将DNADNA转移至尼龙膜转移至尼龙膜;5 5、尼龙膜洗涤、固定；、尼龙膜洗涤、固定；6 6、预杂交、与探针杂交；、预杂交、与探针杂交；7 7、成像或显色。、成像或显色。tissueSDSProKPhenolChloroETOHpptSpin1 1、酚抽提法酚抽提法提取基因组提取基因组DNADNA SDS使组织蛋白与使组织蛋白与DNA分子分离分子分离 蛋白酶蛋白酶K消化分解蛋白质消化分

33、解蛋白质 酚、氯仿酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，异戊醇抽提除去蛋白质，乙醇沉淀纯化乙醇沉淀纯化DNA 加入加入EDTA能抑制能抑制DNase的活性，的活性，RNase除去除去RNA，此法，此法可获得可获得100200kb的的DNA片段。片段。2 2、限制性内切酶切断、限制性内切酶切断DNADNA基因组基因组DNADNA很长，需要将其很长，需要将其切割成片段后切割成片段后用于杂交分析。用于杂交分析。一般选择一种一般选择一种限制酶来切割限制酶来切割DNADNA分子。分子。有时可采用有时可采用部分和充分消化部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交相结合的方法获得一些具有交叉顺序的叉顺序的DNADN

34、A片段。片段。消化消化DNADNA后，加入后，加入EDTAEDTA，6565加热加热灭活限制酶灭活限制酶。样品可直接进行样品可直接进行电泳分离电泳分离，必要时可进行，必要时可进行乙醇乙醇沉淀，沉淀，浓缩浓缩DNADNA样品样品。3 3、琼脂糖凝胶电泳和碱变性、琼脂糖凝胶电泳和碱变性 先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。琼脂糖凝胶电泳可分辨7080000bp的DNA片段制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构 为了进行有效地实现SouthernSouthern印迹转移，必须将最长的DNA片段控

35、制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。通常是将电泳凝胶浸泡在0.25M 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理，移至碱性溶液中浸泡，使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性PH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4 4、将、将DNADNA转移至尼龙膜转移至尼龙膜将凝胶中单链DNA片段转移到固相支持物上。注意保持各DNA片段的相对位置不变。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等。a处理膜时应戴手套并用平头镊子操作，膜切角膜切角。b去离子水完全湿润膜，浸入变性转移液至少5分钟。c.制作转印“三明治”，用玻璃棒赶出其间滞留的

36、气泡。d.DNA转移持续进行8-24小时。重物重物玻璃板玻璃板吸水纸吸水纸滤纸滤纸NC滤膜滤膜凝胶凝胶滤纸滤纸支持物支持物转移缓冲液转移缓冲液n毛细管虹吸转移法毛细管虹吸转移法尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶滤纸滤纸海绵海绵凝胶支持夹凝胶支持夹缓冲液缓冲液电极电极+滤纸滤纸电极电极n电转移法电转移法n真空转移法真空转移法-1h1h5膜的洗涤、固定1）膜置于0.5M TrisCl（pH7.2）、1M NaCl中，室温浸泡15分钟，除去粘附的琼脂糖。2）将膜平铺于一张纸巾上，室温干燥30分钟以上。3）DNA固定：在真空烧箱或普通烘箱内于80烘烤0.52小时。6.6.探针标记探针标记和预杂交预杂交 预杂交：预杂

37、交：将膜上所有能与将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。结合的位点全部封闭。预杂交液预杂交液：含有鲑鱼精子含有鲑鱼精子DNA（该（该DNA与与哺乳动物哺乳动物的同源性极低，的同源性极低，不会与不会与DNA探针探针DNA杂交）、牛杂交）、牛血清血清等等。southern印迹杂交实验仪器印迹杂交实验仪器 用杂交袋封装。每平方厘米NC膜需预杂交液0.2ml。变性的鲑鱼精DNA置终浓度200g/ml。鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性，保持单链。42水浴中温育4h。7 7、杂交、洗膜、杂交、洗膜加入标记的探针DNA（预先热变性成为单链DAN分子）。杂交是在相对

38、高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高。（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。（三）将暗盒置-70低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。8 8、放射性自显影检测、放射性自显影检测（四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片。Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern blot的应用血迹中的血迹中的DN

39、AnDNA指纹分析指纹分析从DNA转录成mRNA69Northern印迹（印迹（NouthernBlot）nNorthernblot是是在在变变性性条条件件下下将将待待检检RNA样样品品进进行行琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，继继而而按按照照同同SouthernBlot相相同同的的原原理理进进行行转转膜膜和和用用探探针针进行杂交检测进行杂交检测。定性分析定性分析mRNA的常用方法。的常用方法。n用于分析用于分析基因转录与否以及转录水平的变化基因转录与否以及转录水平的变化，比较两个或以上不同组织或细胞某一比较两个或以上不同组织或细胞某一已知基已知基因转录水平的差异因转录水平的差异注意：注意：A A

40、 甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNARNA变性变性,不不能用能用NaOHNaOH （会使会使RNARNA水解）。水解）。B B 样品样品RNARNA变性变性后进行后进行电泳分离电泳分离。C C 转印后，烘烤固定前转印后，烘烤固定前不能用低盐缓冲液洗不能用低盐缓冲液洗 D D 胶中不能加胶中不能加EBEB（影响影响RNARNA与硝酸纤维素膜的与硝酸纤维素膜的结合）结合）mRNAmRNA提取提取甲醛变性电泳甲醛变性电泳 印迹转移印迹转移预杂交预杂交 杂交（变性探针）杂交（变性探针）洗膜洗膜放射自显影或化学发光放射自显影或化学发光甲醛变性电泳：甲醛变性电泳：RNA变性，消除R

41、NA中的二级结构，保证RNA完全按照分子的大小分离。DEPC水处理电泳槽，去除RNA酶。在通风橱中加入甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。进样前用甲基氧进样前用甲基氧化汞、乙二醛或化汞、乙二醛或甲醛使甲醛使RNA变性变性RT-PCRnRT-PCR是以是以mRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNA、再以、再以cDNA为模板进行特异性扩增，为模板进行特异性扩增，进行进行RNA定性或定量分析的一种方法定性或定量分析的一种方法原理原理p通过合适的引物，将细胞内的通过合适的引物，将细胞内的RNARNA（一般为（一般为mRNA)mRNA)逆转录成逆转录成cDNAcDNAp然后，通过然后，通过PCRPC

42、R技术，将痕量的技术，将痕量的cDNAcDNA扩增成大量扩增成大量的双链的双链DNADNA。p获得的获得的dsDNAdsDNA可通过测序获得目的基因，也可用可通过测序获得目的基因，也可用于基因操作。于基因操作。三、斑点杂交（三、斑点杂交（Dotblot）核酸样品变性后直接点样于滤膜上，固定标本，核酸样品变性后直接点样于滤膜上，固定标本，与探针进行杂交可做半定量分析。与探针进行杂交可做半定量分析。基因芯片（Genechip）/DNA芯片（DNAchip）：n1995年斯坦福大学年斯坦福大学SchenaM和和BrownPO等等发表第一篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴发表第一篇基因表达阵列芯片，之后

43、国内外兴起了一股微点阵（起了一股微点阵（microarrays）技术技术基因基因芯片的浪潮。芯片的浪潮。n基因芯片是将各种基因芯片是将各种“探针探针”固定在基质上，用固定在基质上，用于检测受检的各种标记样品中与探针互补的核于检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。酸物质的变化。基因芯片（基因芯片（gene chipgene chip），也叫），也叫DNADNA芯片芯片(DNA chip)(DNA chip)技术是指技术是指通过微阵通过微阵(Microarray)(Microarray)技术将高密度技术将高密度DNADNA片段通过高速点样机片段通过高速点样机器人或原位合成方式以一定的

44、顺序或排列方式使其附着在如器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如硅片、膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的硅片、膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNADNA待待测样品，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测样品，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。测等方面研究的技术。基因芯片的定义“探针探针”：载玻片或尼龙膜表面的寡核苷酸：载玻片或尼龙膜表面的寡核苷酸“样品样品”：标记了荧光或同位素待测靶核酸：标记了荧光或同位素待测靶核酸 DNA DNA、cDNAcDNA或或RNARNA基基因因芯芯片片工工作作流流程程 将成千上万个我们克隆到的

45、特异性靶基因固定在一块芯片上，将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗手段）下细胞内的手段）下细胞内的mRNAmRNA或逆转录所得的或逆转录所得的cDNAcDNA进行检测，从而对这进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立

46、。异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。原位杂交原位杂交（in situhybridization，ISH）n原位杂交（原位杂交（in situhybridization，ISH）即）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；定位分析的一种技术；n可用于基因及其表达产物的定位分析可用于基因及其表达产物的定位分析。可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA基本原理基本原理在细胞或组织结构保持不变的条件下，用在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的核苷酸片段，按核酸杂交中标记的已知的核苷酸片段，按核

47、酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体经显色反应后在光学显微镜或电子显交体经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的核酸分子。微镜下观察其细胞内相应的核酸分子。84荧光原位杂交荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）荧光标记的探针荧光标记的探针85n细胞或组织的固定n组织细胞杂交前的预处理n制备探针n杂交n杂交结果的检测流程流程Whole-mountinsituhybridizationlocalizingPax6m

48、RNAinearlychickembryos从RNA翻译成蛋白质蛋白质印迹（蛋白质印迹（Westernblot）n 对对单向电泳单向电泳后的后的蛋白质蛋白质分子的印迹分析分子的印迹分析称为称为WesternWestern印迹法。印迹法。n免疫印迹（免疫印迹（immunoblottingimmunoblotting）n Western blotWestern blot是分子生物学、生物化学和是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。免疫遗传学中常用的一种实验方法。n可用于分析蛋白质水平的变化可用于分析蛋白质水平的变化n Eastern blotEastern blot？基本原理基本

49、原理 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过经过PAGEPAGE分离分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如的蛋白质样品，转移到固相载体（如NCNC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原蛋白质或多肽作为抗原，与，与对应的抗对应的抗体起免疫反应体起免疫反应，再与酶或同位素标记的，再与酶或同位素标记的第二抗体第二抗体起反起反应，经过应，经过底物显色或放射自显影底物显色或放

50、射自显影以检测电泳分离的特以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blot流程蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l转膜转膜l 封闭封闭l 一抗杂交一抗杂交l 洗涤洗涤l 二抗杂交二抗杂交l 洗涤洗涤l 底物显色底物显色SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）SDSSDS即即十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠（Sodium Sodium DodecylDodecyl SulfateSulfate）是是阴阴离离子子表表面面活活性性剂剂，它它能能以以一一定定比比例例和和蛋