显微技术和显微镜.pptx

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1、显微镜的发展1光学显微镜（17世纪）2电子显微镜（1932年，1952年）3扫描隧道显微镜（1981年）第1页/共57页光学显微镜的原理第2页/共57页光学显微镜的结构 机械部分：镜座、机械部分：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、调焦装镜柱、镜臂、镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器）置、载物台（物镜转换器）光学部分：目镜、光学部分：目镜、物镜、反光镜、聚光镜物镜、反光镜、聚光镜放大倍数放大倍数：目镜的放大倍数目镜的放大倍数物镜的物镜的放大倍数放大倍数第3页/共57页显微镜的基本概念分辨率：能够把两个点分辨开的最小距离。放大倍数：显微镜经多次成像后最终所成像的大小相对原来物体大小的比值。有效放大：对于某一

2、显微镜来说，在其分辨能力之内的图像放大。此时的图像放大不失图像表面的细节。无效放大：在显微镜分辨能力以外的图像放大。只是放大了图像轮廓，不能放大和分辨图像的表面细节。第4页/共57页景深：又称焦点深度，指在要求成一副清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离。焦长：景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离。第5页/共57页电子显微镜第6页/共57页射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可 见 光第7页/共57页加速电压与电子波长加速电压（kV）电子波长（A）加速电压（kV）电子波长（A）

3、25 0.076 200 0.025 50 0.054 500 0.014 75 0.043 1000 0.0087 100 0.037 3000 0.0036加速电压一般在50-100kv之间第8页/共57页电子显微镜（EM）1932年，德国科学家Max knoll和Ernst Rusha 制成了世界上第一台透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM).1952年，英国工程师charles Oatley 制造了第一台扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM).第9页/共57页入射电子束吸收电子二次电子背散射

4、电子俄歇电子特征X射线透射电子透射电子（包含非弹性散射电子）（弹性散射电子）样 品入射电子与样品相互作用后，使样品原子较外层电子（价带或导电电子）电离产生的电子。仅在表面深度5nm-10nm时逸出第10页/共57页TEM的工作原理原理：与光学显微镜相似，不同的是透射电子显微镜用电子束作为光源，用电磁场作透镜。电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子散射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色，称电子密度高。反之，则称为电子密度低。第11页/共57页中性粒细胞（透射电镜）黑白反差结构影像影像较黑称电子密度高反之称

5、电子密度低第12页/共57页 的 结 构照明系统成像系统真空系统供电系统机械系统观察显示系统电子枪聚光镜物镜中间镜投影镜第13页/共57页1.照明系统照明系统主要由电子枪和聚光镜组成。电子枪是发射电子的照明光源。聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。第14页/共57页电子枪的结构及工作原理图电子枪是电镜的电子发射源，其作用是形成电子束，并控制电子束的发射，获得一高亮度和高稳定度的照明电子光源由阴极灯丝发射的电子，通过栅极上的小孔和电子枪交叉点，即电镜的实际电子源。形成射线电子束，经高电

6、压加速后成为高速电子流奔向聚光镜。电子束在电子枪中是逐级加速的第15页/共57页1）阴极又称灯丝，一般由0.080.18mm钨丝作成V或Y形状。第16页/共57页2）控制极：调节电子的初速度、控制电子束流大小及形状，工作电压比灯丝负100500V。改变其电位可改变控制电子束的形状和发射强度。3）阳极：加速从阴极发射出的电子。一般接地。阳极与栅极为互相背相的两个圆形筒，中间有一个小圆孔，均用不锈钢加工制成。第17页/共57页聚光镜由于电子之间的斥力和阳极小孔的发散作用，电子束穿过阳极后，逐渐变粗，射到试样上仍然过大。聚光镜有增强电子束密度和再次将发散的电子会聚起来的作用。多为磁透镜，调节其电流控

7、制照明光斑的大小，使在不同的放大倍数下只照明样品的被观察部分，减少样品不必要的加热和污染。第18页/共57页一般装置双聚光镜，第一聚光镜为一强透镜，可把电子枪交叉点缩小到1um左右，第二聚光镜为一弱透镜，可以把缩小的光斑放大到数微米并聚焦到样品上第19页/共57页电 磁 透 镜 的 结 构电子源电子轨迹铜导线软铁壳软铁壳焦点第20页/共57页2.成像系统由电子透镜组成，是能使电子束聚焦的装置。电子透镜是电镜的核心部件，其工作方式是利用复杂的电极和线圈结构形成静电场和磁场。电子透镜存在各种像差（aberration），这是影响成像质量的主要因素。电子透镜根据其作用又分为物镜、中间镜和投影镜。第2

8、1页/共57页第22页/共57页（1）物镜成一次像。决定透射电镜的分辨本领，要求它有尽可能高的分辨本领、足够高的放大倍数和尽可能小的像差。通常采用强激磁，短焦距的物镜。放大倍数较高，一般为100300倍。目前高质量物镜分辨率可达0.1nm左右第23页/共57页（2）中间镜成二次像。弱激磁的长焦距变倍透镜，020倍可调。（3）投影镜短焦距强磁透镜，最后一级放大像，最终显示到荧光屏上，称为三级放大成像。第24页/共57页电子显微镜与光学显微镜的光路比较第25页/共57页3.真空系统由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。第26页/共57

9、页4.供电系统透射电镜需要两部分电源：一是供给电子枪的高压部分，二是供给电磁透镜的低压稳流部分。电源的稳定性是电镜性能好坏的一个极为重要的标志。所以，对供电系统的主要要求是产生高稳定的加速电压和各透镜的激磁电流。近代仪器除了上述电源部分外，尚有自动操作程序控制系统和数据处理的计算机系统。第27页/共57页5.机械系统包括电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统和控制台等。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50100nm）。第28页/共57页主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步骤超薄切片技术厚度：50100nm1mm3第29页/共57页6.观察记录系统人

10、眼无法观测电子，TEM中的电子信息通过荧光屏和照相底版转换为可观察图像。第30页/共57页硅的晶格排布第31页/共57页应 用在生物医学中主要用于观察组织和细胞内的亚显维结构、蛋白质、核酸等大分子的形态结构及病毒的形态结构。是区别细胞凋亡与细胞坏死的最可靠的办法。第32页/共57页扫描电子显微镜(SEM)第33页/共57页一、SEM的成像原理电子枪发出电子束电磁透镜聚焦形成电子探针激发样品产生二次电子二次电子偏转线圈使得电子束在样品表面逐点逐行扫描二次电子探测器将电子信号转变成为光信号光电倍增管形成二次电子脉冲信号视频放大器形成电压模拟信号在荧光屏显示图像或转换为数字信号输入计算机第34页/共

11、57页第35页/共57页光镜、透射电镜和扫描电镜的工作原理图第36页/共57页二次电子探测器的工作原理图第37页/共57页 SEM电磁透镜HITACHI Model S-3000N样品台操作系统CRT电子枪电子探头 样品室第38页/共57页电子光学系统：电子枪、电磁透镜信号检测系统：二次电子探测器、光电倍增管图像显示和数据处理系统：CRT扫描系统：偏转线圈、扫描波发生器真空系统：机械泵、油扩散泵、阀门等电源：高压电源、真空系统电源等SEM的基本结构第39页/共57页扫描系统扫描偏转线圈（电子束偏转器）随电流波形而产生变化磁场，推动电子束偏转移动，使电子探针在样品上以一定的方式和速度移动扫描信号

12、发生器 产生扫描脉冲信号，同步提供给镜体和显示器中的扫描线圈第40页/共57页SEM的应用主要用来观查组织、细胞表面或断裂面的超微结构及较大的颗粒性样品的表面形态结构第41页/共57页 SEM TEM 最高分辨率 310nm 0.10.3nm放大率 7200,000 100800,000 加速电压 130kv 20200kv成像原理 二次电子 透射电子样品大小 10mm25mm 1mm3 观察对象 表面形貌 内部结构 制样方法 较易 复杂操作维护 方便 复杂SEM与TEM的比较第42页/共57页扫 描 电 镜 照 片 展 示注射针头的扫描电镜照片第43页/共57页扫 描 电 镜 照 片 展 示

13、红血球可以用计算机将黑白照片处理成彩色第44页/共57页放大倍率范围广扫描电镜特点扫描电镜特点立体感强第45页/共57页扫描隧道显微镜（STM）第46页/共57页 量子理论中的隧道效应 极细探针与研究物质作为两个极 隧道电流STM的工作原理第47页/共57页STM的工作原理利用量子力学中的隧道效应，在样品与探针之间加一定（1V左右）的电压，当样品与针尖距离非常接近（小于1nm）时，样品和针尖之间将产生隧道电流隧道电流的大小和两极之间的距离呈指数关系第48页/共57页STM的基本装置工作过程：利用探针针尖扫描样品，通过隧道电流获取信息，经计算机处理得到图象。第49页/共57页STM 探针：金属丝

14、经化学腐蚀，在腐蚀断裂瞬间切断电流，获得尖峰，曲率半径为10nm左右。STM 针尖STM的基本装置第50页/共57页扫描器检测电路输出样品运动轨迹STM的扫描模式特点：扫描速度快，噪音减少，但不能用于 观察表面起伏大于1nm 的样品。（1）恒高测量模式：探针以不变高度在样品表面扫描，隧道电流随试件表面起伏而变化，从而得到样品表面形貌信息。第51页/共57页STM的扫描模式样品输出运动轨迹驱动电路扫描器检测电路控制器（2）恒电流测量模式：探针在样品表面扫描，使用反馈电路驱动探针，使探针与样品表面之间距离（隧道间隙）不变。此时探针移动直接描绘了样品表面形貌。特点：此种测量模式隧道电流对隧道间隙的敏感性转移到反馈电路驱动电压与位移之间的关系上，避免了非线性，提高了测量精度和测量范围。适用于观察表面形貌起伏较大的样品。第52页/共57页STM的性能特点 原子高分辨率 实际空间测量 适应性强 可操作原子位移 可进行单层局部研究 局限性第53页/共57页STM的实际应用STM 观察石墨原子排列的三维图像 第54页/共57页1990年，IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用STM操纵35个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母。STM的实际应用第55页/共57页超高压电子显微镜第56页/共57页感谢您的观看！第57页/共57页