[EP}EP62.6.1无菌检查中文版.pdf

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1、2.6 生物检查 2.6.1 无菌检查 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。在本文的最后，有如何采用检查法检查无菌的指导。 微生物污染的预防无菌检测试验应该在无菌的环境下进行。通过预防，我们可以避免微生物对试验的污染。同时，这些预防也应该不会对检查的微生物有影响。工作的环境应该定期进行检查，进行合适的对照试验（遵循比如欧共体指示中的或GMP 中的要求）。培养基及孵化温度培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的通过生长促进试验的现成的培养基。以下培养基适用于

2、无菌检查。硫乙醇酸盐流体培养基是厌氧菌检查的首选培养基，同时，它也可用于需氧菌检查。大豆消化酪蛋白脉琼脂培养基适用于霉菌和需氧菌检查。也可以使用。其他通过细菌生长促进试验以及验证试验的培养基。硫乙醇酸盐流体培养基 L -胱氨酸 0.5克 颗粒琼脂（水分含量不超过百分之十五） 0.75克 氯化钠 2.5克 葡萄糖 一水/无水 5.5克/5.0克 酵母膏（水溶性） 5.0克 胰酶蛋白胨 15.0克 琉基乙酸钠 0.5克 或琉基乙酸 0.3毫升 新配制的刃天青钠溶液 1.0毫升 （1 g / L的 刃天青钠） 纯水 1000毫升 灭菌后培养基的pH值应为 7.1 0.2 将L - 胱氨酸、琼脂、氯化

3、钠、葡萄糖、酵母膏以及胰酶蛋白脉与纯水混合，加热至完全溶解。然后往溶液中加入琉基乙酸钠或琉基乙酸使溶解，必要时，加入 1M 氢氧化钠调节溶液的 pH ，使灭菌后的 pH值为7.1士0.2。 如需过滤， 再次加热溶液不必沸腾，趁热用浸湿的滤纸过滤，加刃天青钠溶液并混和均匀，将培养基转移至适宜的可给出培养基表面深度比例的容器中，这样，在培养期结束时，显示的氧化层颜色变化不得超过培养基深度的1/2。采用有效的方法对培养基进行灭菌。如果贮存，应贮存在温度介于 2-25、 无菌密闭的容器中。 如果超过 1/3的培养基显示粉色，则应在水浴或流动蒸汽中重新加热容器直至粉色消失，迅速冷却，小心避免非无菌空气导

4、人到容器中。培养基的保存时间不要超过经过验证的保存时间。 硫乙醇酸盐流体培养基置30-35下进行培养。 大豆消化酪蛋白膝琼脂培养基 胰酶蛋白陈 17.0克大豆粉木瓜蛋白酶消化物 3.0克 氯化钠 5.0克 磷酸氢二钾 2.5克 萄糖一水 /无水 2.5 克/2.3克 纯水 1000毫升 灭菌后培养基的pH值应为 7.3 0.2 取上述各固体组份溶于纯水中，微热使溶解完全。放冷至室温，用 1M 氢氧化钠调节 pH ，使灭菌后的 pH值为7.3士0.2。必要时，过滤使之澄清，分装至适宜容器中进行灭菌，采用有效的方法进行灭菌。除非立即使用，否则应贮存在温度介于2-25，无菌密闭良好的容器中。培养基的

5、保存时间不要超过经过验证的保存时间。 大豆消化酪蛋白脉琼脂培养基置20-25培养。 使用的培养基应符合以下检测规定，可与供试品检2011.03.11毛鸡蛋本章由个人翻译、整理，由于个人能力有限，阅读时请注意！ 翻译参考了许多他们的工作，十分感谢！查平行操作，或提前进行该检测。培养基的无菌状况通过在指定的温度下温孵培养部分培养基至少14天，不得出现微生物的生长。 需氧菌、厌氧菌及霉菌的促生长实验检查每批准备使用的培养基以及每批通过脱水培养基制备或各种组分混合制备的培养基。适于采用的微生物菌种见表 2.6.1.-1。 取部分硫乙醇酸盐流体培养基，接种少量的(不多于l00CFU)以下所列的微生物菌种

6、，各个菌种均分别采用独立的培养基 :生抱梭菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌。取部分大豆消化酪蛋白陈琼脂培养基，接种少量的 (不多于100CFU) 以下所列的微生物菌种，各个菌种均分别采用独立的培养基:黑曲霉、枯草杆菌以及白色念珠菌。细菌温孵培养不超过3天，霉菌温孵培养不超过 5天。 使用种子批培养维修技术（种子批系统）使用于接种的菌株传代次数不得超过5代。 培养基温孵后如果出现清晰可见的微生物生长，则该培养基适于进行无菌检查。 方法验证试验除了以下的变更，其他均按照以下供试品无菌检查项下的方法进行检测。 薄膜过滤法在转移容器的内容物或待检容器置薄膜后，接种少量活性微生物 (不多于l00CFU

7、)至最后一份无菌稀释液(用于冲洗过滤器 )中。 直接接种法在转移容器的内容物或待检容器(用于肠线或其它兽用外科缝线 :丝条)置培养基中后，接种少量活性微生物(不多于l00CFU)至培养基中。 在这两种情况下，使用同前面需氧菌，厌氧菌及霉菌的促生长实验中所描述的相同的微生物，进行促生长实验作为阳性对照。温孵培养所有盛放培养基的容器不超过 5天。 如果经过温孵培养，与未加供试品的对照容器目视比较，加供试品的容器中出现了清晰可见的微生物生长，则供试品在检测条件下具有抗生素活性或者是活性被很好的清除。则不需要进行进一步的调整，即可进行无菌检查。 如果经过温孵培养，与未加供试品的对照容器目视比较，加供试

8、品的容器中未出现清晰可见的微生物生长，则供试品在检测条件下具有抗生素活性没有被很好的消除。调整试验条件以清除抗生素活性，重新进行验证试验。 在以下情况进行验证： a) 当一新供试品进行无菌检查时， b)无菌检查的试验条件发生变化时。 方法验证试验可与供试品的无菌检查同时进行。 供试品的无菌检查检查可以使用薄膜过滤法或直接接种法。都需要引入适当的阴性对照。在条件允许时，要采用薄膜过滤法，也就是说要用于可过滤的水溶液，含酒精的或油性溶液，以混于或可溶于水性或油性溶剂（溶剂在检查条件下无抑菌作用）的制剂。薄膜过滤法采用标示孔径不大于 0.45um的滤膜过滤装置，该孔径的滤膜能有效的保留微生物。例如，

9、硝酸纤维素过滤器适用于水溶液、油性溶液以及低醇溶液，醋酸纤维素过滤器适用于高醇溶液。对于特定的供试品(例如抗生素 )需要特殊处理的过滤器。 下面描述的技术基于以下假设，使用的是约50毫米直径膜。如果使用一个不同直径的过滤膜，应对稀释和洗涤的体积做出相应的调整。过滤的设备和膜应通过适当的方式进行灭菌。仪器的设计应能够使溶液在无菌环境下进行过滤；应满足膜转移到培养基的过程中不会引入细菌或仪器本身可以进行在添加培养基后进行孵育。 水溶液如果采用适当的方法转移少量适用的灭菌稀释液例如1克/升的中性肉或酪蛋白胨溶液（pH 7.1 0.2）置过滤装置中的薄膜上并过滤。稀释液中可能包含适宜的中和组分和/或适

10、宜的灭活组分，例如，当供试品为抗生素类。 将容器中的内容物或待检容器转移置薄膜上，必要时，采用方法验证试验中选择的无菌稀释剂稀释供试品至方法验证试验中的体积后，再转移置薄膜，但供试品的取用量不得少于表2.6.1.-2中的供试品量。立即过滤。如果供试品具有抗生素活性，采用方法验证试验中选择的无菌稀释剂体积冲洗薄膜不少于 3次。即使在方法验证过程中表明该冲洗周期不能完全的清除抗生素活性，冲洗周期也不得超过5次200mL 。转移整个薄膜至培养基中或无菌操作剪切薄膜为两等份，并分别转移至独立的培养基中。培养基的体积与方法验证试验中的相同。或可选择将培养基转移至过滤装置的薄膜上。温孵培养不少于14天。

11、可溶性固体每份培养基中的供试品用量不少于表2.6.1.-2中的供试品量，采用适当的溶剂溶解供试品，例如1克/升的中性肉或酪蛋白胨溶液，按照以上水溶液项下的方法同法操作，采用与所选溶剂相对应的薄膜。 油脂以及油性溶液每份培养基中的供试品用量不少于表2.6.1.-2中的供试品量。如果油脂以及油性溶液具有足够低的粘性，则可不需稀释通过一个干燥的薄膜进行过滤。枯稠的油脂必要时可采用适宜的无菌稀释剂进行稀释，例如十四烷酸异丙酯，其在检测条件下不具有抗生素活性。将油脂置于薄膜上，使其通过自身的重量透过薄膜，然后，通过逐渐的加压或抽吸减压进行过滤。采用适宜的无菌溶剂约100mL 例如1克/升的中性肉或酪蛋白

12、胨溶液，冲洗薄膜至少3次(每次均采用过滤的方式冲洗)，该溶剂中包含适量的乳化剂，其浓度在方法验证试验中表明适用，例如浓度为 l0 克/升的聚山梨酯 80,按照以上水溶液项下的方法同法操作，转移薄膜置培养基中，并在相同的温度温孵培养相同的时间。 软膏剂与乳膏剂每份培养基中的供试品用量不少于表2.6.1.-2中的供试品量。具有脂肪性基质并形成水油型乳化液的软膏剂可采用十四烷酸异丙酯(同上)为稀释剂将其稀释到 1% ，必要时加热但不超过 40。在特殊情况下，必要时加热不超过 44。 尽可能快的过滤，然后按照以上油脂以及油性溶液项下的方法同法操作。 直接接种法直接转移一定量的表 2.6.1.-2中的供

13、试品置培养基中，除非有其它说明，供试品的体积不得大于培养基体积的 10% 。 如果供试品具有抗生素活性，则加入中和组分进行中和或采用足够量的培养基进行稀释，然后进行检测。当供试品的取用量必须足够大时，适于采用浓缩的培养基 (考虑到下一步的稀释进行配制)，或者也适于将浓缩的培养基直接加入到供试品容器中。 油状液体采用加入适宜乳化剂的培养基，其浓度在方法验证试验中表明适用，例如浓度为10克 / 升的聚山梨酯800。 软膏荆与乳裔剂采用适宜的无菌稀释剂例如1克/升的中性肉或酪蛋白胨溶液， 为溶剂配制乳化剂， 10倍稀释供试品。转移稀释的供试品置不含乳化剂的培养基中。 温孵培养接种的培养基不少于14天

14、。在培养期间，观测培养基数次。每天，轻微振摇含油脂供试品的培养基。然而，当采用硫乙醇酸盐流体培养基或其它用于厌氧菌检测的相当的培养基时，为了保持厌氧条件，将振摇或混合降到最低限度。 肠线和其它兽用外科缝线每个培养基中的供试品量不少于表2.6.1.-2中的供试品量。无菌操作打开密封的包装，剪切出三段缝线并转移至单一培养基中，每段30cm 长，分别从缝线的开头，中间处，及末尾进行剪切。采用新鲜打开的包装盒中的完整的缝线进行剪切。转移每段缝线置培养基中，并用足够量的培养基包裹住缝线(20mL-150mL)。 结果观测及解释在温孵培养期间的间隔以及培养结束时，目视检测微生物的生长状况。如果供试品使培养

15、基变的浑浊，则目视检测不能轻易的判断微生物否生长。培养14天后，取部分培养基 (每份不少于 1mL) 转种至同种新鲜培养基中，温孵培养最初的与转种后的培养基不少于 4天。 如果未观测到微生物的生长，则供试品符合规定。如果观测到微生物的生长，则供试品不符合规定，除非能充分证明试验无效是由于与供试品非相关的原因造成。当至少符合下列一个或多个条件时，方可判试验无效： a)无菌检查试验所用设备的微生物监控的数据错误， b)讨论中回顾试验过程中的检测步骤，发现了错误， c)阴性对照中观测到微生物的生长， d)试验中分离出的微生物经鉴定后，能确证该菌种(或这些菌种 )是因无菌试验中所使用的物品或无菌操作技

16、术不当引起的。 如果试验确证无效，取同量供试品进行重试。如果未观测到微生物的生长，则判定符合规定，如果观测到微生物生长，则判定不符合规定。 对肠胃外制剂， 眼科以及其他非注射制剂的无菌检查应符合规定当采用薄膜过滤法时，尽可能采用容器中的全部内容物，但不得少于表 2.6.1.-2中的供试品的量，必要时，用适宜的无菌溶剂例如1克/升的中性肉或酪蛋白胨溶液，稀释供试品至约100mL 。 当采用直接接种法时，除非有其它的证明和批准，供试品取用量见表 2.6.1.-2。取同一供试品进行细菌和真菌无菌检查。无菌检查时，当单一容器中的供试品的量与体积不够时，取两个或多个容器中的内容物接种至不同的培养基中。

17、实施无菌检查的准则该无菌检查的目的，例如药典中所有测试，都是为了提供一个独立的控制分析来证明一个特定的材料符合欧洲药典的要求。制造商不会被迫去进行这种测试 ， 也不会被阻止去使用修改或者替代的指定方法，只要制造商确信，当用官方的方法去进行检查时，材料能符合欧洲药典的规定就可以了。微生物污染的预防在B 级的洁净室或隔离器中的一个A 级的层流柜进行检查，就可以达到需要的无菌环境。 制造商的准则通过一个满意的无菌试验所提供的一批次的保证程度，代表着一批次同质性，制造商的生产条件和取样方案的效率。为了达到这个目的，一个批次定义为拥有同质性的来自于密封罐中的单位，这些密封罐在准备过程中里面的单位承受着相

18、同的污染的危险。对于灭菌的终产品，物理的证据，基于生物学的和自动存档的可以证明该批次在灭菌的全过程中处理的正确性比最后的无菌检查更加重要。依据无菌产品的准备（ 5.1.1 ）中要求满足一定参数发布的情况可以认为是适宜的。培养基充填的方法可以用来评价无菌生产的过程。除此以外，无菌检查是唯一的用来检验产品是否在无菌环境下生产的分析方法，在所有情况下，也是当局用来检查某种产品是否无菌的唯一分析方法。 用次无菌检查法检测微生物的可能性随微生物数目的增加以及微生物生产的稳定性的增加而加大。检测到微量微生物的可能性是很低的，就算是产品的同质性很好。无菌测试结果的解释基于以下假设，就是一批次的储存罐中的内容

19、物有着相同的结果。很明显，不可能检查所有的储存罐，所以要有一个好的抽样方案。对于无菌的生产，建议在最开始，最后以及中间出现显著变化时加入的样品都要进行检查。表2.6.1.-3给出了建议的最少检查相以及与之对应的样品数目。建议方法的实施要考虑到每罐中样品的含量，灭菌方法的验证以及其他特殊的需要考虑的与产品无菌相关的内容。 结果观测与解释常规上一般的微生物 /生化技术都可以满足鉴定从无菌检查中恢复的微生物。但是，如果制造商想使用条件（ d）来作为鉴定细菌检查失败的唯一标准，那么就要采用一种敏感的分型方法来证明从检查中分离出的微生物和检测的材料或环境中的微生物相同。当常规的微生物 /生化鉴定技术能够

20、证明2个隔离的种群是不同的，但这些技术不能提供充分的确切的证据来说明 2个隔离的种群是同源的。更加敏感的检测，比如利用 DNA/RNA的同源性的分子分类技术，才能证明微生物是同源关联的并且有一个共同的起源。 表2.6.1.-1 适用于促生长实脸以及方法验证试验的检测徽生物 表2.6.1.-2 单一培养基中供试品的最小检测用量 需氧菌 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538,CIP4.83,NCTC10788,N CIMB9518 枯草杆菌 ATCC6633,CIP52. 62,NCIMB8054 铜绿假单胞菌 ATCC9027,N CIMB8626,CIP82.118 厌氧菌生抱 梭菌 ATCC1

21、9404,CIP79.3,NCTC532或ATCC11437 霉菌白色念珠菌 ATCC10231,IP 48.7 2,N CPF3179 黑曲霉 ATCC16404,IP1431. 83,IMI149007 容器装量 供试品的最小用量 (除非有其它的 证明和批准 ) 掖体(非抗生素类 ) - 少于1ml - 1-40ml - 多于40ml，但不多于 100Ml - 多于100ml 抗生素类液体，以水或十四烷酸异丙酯为溶剂的制剂每个容器中的全部内容物 每个容器中的一半内容物，但不得少于1ml 20ml 容器内容物的 1000，但不少于 20ml 1ml 每个容器中的全部内容物，取用量不得少于20

22、0mg非水溶性制剂 :乳青剂以及混悬型与溶液型的软青剂 每个容器中的内容物，取用量不得少于200mg 固体 - 少于50mg - 等于或多于 50mg ，但少于 300mg - 300mg-5g - 多于5g 每个容器中的全部内容物 每个容器中的一半内容物，但不得少于50mg 150mg 500mg 肠线以及其他兽用外科缝线 一条缝线的 3段(每段30cm 长) 表2.6.1.-3 最低检查项目数 *如果一个容器内的含量足以接种 2个培养基，最后每个菌落得出的结果要相加。 每批项目数 每批最低检查项目数，除非有特定的修订和规定肠外制剂 - 不超过100个容器 - 多于100但少于500个容器 - 多于500个容器 10% 或4个容器，以较大者为准 10个容器 2% 或者20个容器，以较大者为准 眼科和其他非注射制剂 - 不超过200个容器 - 超过200个容器货柜 200个 - 如果产品以单剂量容器的形式存在，使用 以上为肠外制剂的方案 5% 或2% 的容器，以较大者为准 10个容器 兽用外科肠线或其他缝线 2% 或5包，以较大者为准，最多不超过20包 散装固体产品 - 多达4个容器 - 超过4个货柜，但不超过 50个容器 - 超过50个容器 每个容器 20% 或者4个容器，以较大者为准 2% 或者10个容器，以较大者为准 药房货抗生素包（大于 5g） 6个容器