生理指标测定实验方案汇总.doc

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1、预测指标： 1.抗氧化酶系统、MDA 2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基 3.叶绿素、类胡萝卜素 4.可溶性糖 5.游离氨基酸 6.过氧化氢 7. 谷胱甘肽、ASA1.1. 抗氧化酶系统、抗氧化酶系统、MDAMDA A A 酶活测定酶活测定 试剂： PBS 缓冲液 0.05M（pH 7.8）：取 0.663g NaH2PO42H2O 和 16.384g Na2HPO412H2O，加 PVP10g，并加 EDTA 或者 EDTA 盐，使其浓度为 2mM，加蒸馏水定容至 1L。用前冰箱或冰上 预冷。 样品制备 鲜样 0.1-0.5g 加入 1 ml 磷酸缓冲液（0.05M，pH 7.8） ，稍许石英

2、砂，研磨成匀浆；移入 10 ml 离心管中，再用 4ml 磷酸缓冲液分两次洗涤研钵并全部转入离心管中；10000g 4下离心 20 min；上清夜贮于 4冰箱中保存备测。同时称取鲜样一份(0.1g 左右)烘干 称重。SODSOD （=560nm=560nm） 试剂配制： Met1.93973g NBT 氮蓝四唑0.061323gEDTA-Na20.0037224g1LPBS 缓冲 液中 加入核黄素0.00075272g 实验步骤： 2.725mL 反应液250uL 蒸馏水25uL 酶液 【样品管】 2.75mL 反应液250uL 蒸馏水（光照作为 100%CK） 【照光对照管】 2.75mL

3、反应液250uL 蒸馏水（黑暗作为调零） 【空白调零管】 4000lx 日光灯下反应 20 分钟，560nm 比色。反应温度 2535。 已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50为一个酶活性单位表示按下式计算 SOD 活性： SOD 总活性（AckAE）*V/（0.5*Ack*w*Vt） （式中 SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示，Ack 为照光对照管的吸光度，AE 为样品管的吸 光度，V 为样品液的总体积 ml，Vt 为测定时样品用量 ml，w 为样品鲜重 g） 【空白调零管】可在光反应快结束前配制并用黑色纸或铝箔包裹以避光。 【样品管】 和【照光对照管】在光反应快结束后至测定

4、前应避光处理。PODPOD （=470nm=470nm 比色）比色） 试剂配制：1.5%愈创木酚（1.5ml 愈创木酚，用蒸馏水定容到 100 ml） 300uM 的 H2O2：取 30的 H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到 50 ml； 实验步骤： 100ul 酶液+2700ulPBS+100ul 愈创木酚+100ul H2O2，于普通比色皿，轻轻摇匀 2-秒， A470 动力学测定 1 分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为 activity，此后测定均参考该 时间段。结果计算：POD(mmol/g)=activityAVa/(Ew) A 反应液总体积/ml；V 提取液总体积/ml；a

5、测定液体积/ml；w 材料鲜重/g；E 吸光系数 /mMcm-1CATCAT（240nm240nm 比色）比色） 试剂配制： 300uM 的 H2O2：取 30的 H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到 50 ml； 实验步骤： 100ul 酶液+2800ulPBS+100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀 2-秒，A240 动力学测定 1 分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为 activity，此后测定均参考该时间段。 结果计算：CAT (mmol/g)=activityAVa/(Ew)APXAPX（=290nm=290nm 比色）比色） 试剂配制： 7.5mM 的抗坏血酸(AsA)：6

6、6mg AsA 用蒸馏水定容到 50 ml； 300uM 的 H2O2：取 30的 H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到 50 ml； 实验步骤： 100ul 酶液+2700ulPBS+100ul AsA +100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀 2-秒，A290 动 力学测定 1 分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为 activity，此后测定均参考该时间段。结果计算：CAT (mmol/g)=activityAVa/(Ew)B.B.丙二醛（丙二醛（MDAMDA）含量的测定（）含量的测定（=450=450，532532，600nm600nm 比色）比色） 试剂配制： 5%三氯乙酸（T

7、CA）：25g 三氯乙酸定容到 500mL。 MDA 反应液：2.5g 硫代巴比妥酸，先用少量 1M 的氢氧化钠溶解，再用 5%三氯乙酸定容到 500mL。 实验步骤： 0.5mL 酶液2.5mL 反应液，沸水浴反应 15 分钟，立即冰浴，4800rpm 离心 10 分钟，上清 转入新管，波长 450,532 和 600 下比色，MDA 反应液调零。 结果计算：丙二醛含量（nmol.g-1）（D532D600）*A*V/（a*1.55*10-1*w） 式中 A 为反应液总量（mL） ；V 为提取液总量（mL） ；a 为测量用提取液量（mL） ；w 为材料 鲜重（g） 。1.5510-1 为丙二

8、醛的 umol/L 消光系数（nmol/mL 消光系数） 或者：MDA 浓度(umol/L)=6.45(D532D600) 0.56D450 丙二醛含量（umol.g-1）= MDA 浓度提取液总体积(ml)/组织鲜重(g)/1000-植物体可溶性蛋白质含量测定植物体可溶性蛋白质含量测定 比色原理： 染料考马斯亮蓝 G-250 在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者 最大光吸收在 465nm，后者在 595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0100g/ml） ，蛋白质 色素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝 G

9、-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结 合物在室温下 1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较 好的蛋白质定量法。 【试剂】 1、65mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.8)； 如超氧阴离子自由基含量测定用。 称取 K2HPO43H2O(MW=228.22)9.1234g 和 KH2PO4(MW=136.09)3.406g，蒸馏水定容到 1L。 或 K2HPO43H2O 4.562g 和 KH2PO4 1.703g，蒸馏水定容到 0.5L。样品蛋白质含量（mg/g 鲜重）=C*V/W2、考马斯亮蓝 G-250：称取 100mg 考

10、马斯亮蓝 G-250 溶于 50ml 90%乙醇中，加入 85%（W/V）磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容至 1000ml。滤纸过滤后低温储存。常温下可放 置一个月； 3、磷酸（85%，W/V）：也即商业磷酸(浓度85%)。直接用。 4、0.15M 的 NaCl (标准曲线用)：NaCl0.8766g 蒸馏水定容到 100ml。 【方法】1.标准曲线的绘制 血清白蛋白(BSA)先用 0.15M 的 NaCl 配制成 2mg/ml 的原液。 表 1 配制 01000g/ml 血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液(ml) 磷酸钾缓冲液量(ml) 蛋白质含量(g/ml)0 1.0 00.1

11、 0.9 2000.2 0.8 4000.3 0.7 6000.4 0.6 8000.5 0.5 1000 以上各管混匀后，各取 0.1ml 于新的 10ml 离心管内，各加 5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置 2min，在 595nm 下比色，绘制标准曲线。折衷： 表 2 配制 01000g/ml 血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液(ul) 磷酸钾缓冲液量(ul) 蛋白质含量(g/ml)0 100 010 90 20020 80 40030 70 60040 60 80050 50 1000 以上各管混匀后，各加 5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置 2min，在 595nm 下比色，绘

12、制标准 曲线。 2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。取样品上清液 0.1ml 于新的 10ml 离心管内， 各加 5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置 2min，在 595nm 下比色。 3.结果计算式中 C查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg/ml） ；V提取液总体积（ml） ；此为样品提 取液总体积为 3ml；W取样量（g） 。 测定以上 3 项目时，同时取部分同批剩余鲜样称 重后转入纸袋烘干称重。2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基可溶蛋白、超氧阴离子自由基 植物材料 0.1-0.2g 左右(记录准确称量值)65 mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.8)1m

13、l少许石 英砂冰上充分研磨转入离心管磷酸钾缓冲液洗涤研钵 2 次，每次 1ml 全部转入离心 管(样品提取液总体积为 3ml)410000r/min 离心 15min取上清液转入新管标记低温保 存（待测液） 。A. 超氧阴离子自由基（超氧阴离子自由基（=530nm=530nm） 比色原理： 2O2.-+ 盐酸羟胺NO2-+磺胺重氮化磺胺+-萘胺偶氮化合物(粉红色,在波长 530nm 处 有显著的光吸收) 试剂准备： 1、65mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.8)；【不用磷酸钠】 称取 K2HPO43H2O(MW=228.22)9.1234g 和 KH2PO4(MW=136.09)3.406g

14、，蒸馏水定容到 1L。 或 K2HPO43H2O 4.562g 和 KH2PO4 1.703g，蒸馏水定容到 0.5L。 2、10mmol/L 盐酸羟胺；称取盐酸羟胺(MW=69.49)0.06949g 蒸馏水定容到 100mL 3、12mol/L 乙酸：称取冰乙酸(MW=60.05)144.1g 蒸馏水定容到 200mL4、58mmol/L 磺胺（12mol/L 乙酸为溶剂配制） ；称取磺胺(MW=172.21)0.9988g，用 12mol/L 乙酸溶解并定容到 100mL 5、 7mmol/L-萘胺（12mol/L 乙酸为溶剂配制） ；称取 -萘胺(MW=143.19) 0.100233

15、g（0.1g） ，用 12mol/L 乙酸溶解并定容到 100mL 6、三氯甲烷（氯仿） ； 7、NaNO2（30umol/LNaNO2） （用 65mmol/L 磷酸钾缓冲液配制和稀释）：称取 NaNO2（MW=69.00）0.207g 用 65mmol/L 磷酸钾缓冲液定容到 1L(此时 NaNO2 浓度 3mM)，从 中吸取 5ul，加 65mmol/L 磷酸钾缓冲液 495ul 即可(30uM)。其它 25，20，15，10，5umol/LNaNO2，依此。 测定流程图 空白调零组空白调零组：磷酸钾缓冲液 0.5ml盐酸羟胺 0.1ml摇匀25水浴 10min冰浴磷酸 钾缓冲液 0.5

16、ml摇匀25水浴 20min冰浴磺胺 1ml-萘胺 1ml摇匀25水浴 20min冰浴三氯甲烷 3ml410000r/min 离心 3min上层水相测定 A530。 试试 验验 组组：磷酸钾缓冲液 0.5ml盐酸羟胺 0.1ml摇匀25水浴 10min冰浴上清液 0.5ml摇匀25水浴 20min冰浴磺胺 1ml-萘胺 1ml摇匀25水浴 20min 冰浴三氯甲烷 3ml410000r/min 离心 3min粉红色水相(上层)测定 A530。 标准曲线： NaNO2 用 65 mmol/L 磷酸钾缓冲液配置成 30umol/L，再稀释成 25，20，15，10，5 和 0umol/L。 磷酸钾

17、缓冲液 0.5ml盐酸羟胺 0.1ml摇匀25水浴 10min冰浴加各种不同浓度的 NaNO2 各取 0.5ml摇匀25水浴 20min冰浴磺胺 1ml-萘胺 1ml摇匀25水 浴 20min冰浴三氯甲烷 3ml10000r/min 离心 3min粉红色水相(上层)测定 A530。 结果计算： 通过标准曲线生成的 NO2-与 A530 的方程，求出NO2-,乘 2 则得O2.-。O2.- 产生速率 =O2.-/样品 Pr 含量/20min；O2.- 产生总量=O2.-/样品 Pr 含量（25水浴共培养 60min） 。 说明：鲜样测定，不能用于干样品，样品也不宜液氮速冻后超低温冰箱储存后测定。

18、 盐酸羟胺与样品上清液的 25水浴共培养 20min 用于 O2.- 产生速率测定；如果 25水浴 共培养 60min 则用于 O2.-含量测定。25水浴共培养的时间为关键时间，必须掌握好，此 步处理前后样品试剂溶液尽量处于冰浴状态。待测液制备后应尽快测定。 干旱胁迫处理，要同时称量所取用的同一样品烘干至恒重称出烘干重，以便计算单位干重 样品的 O2.- 产生速率；或者用的同一新鲜样品测定蛋白质含量，以便计算单位蛋白质质 量的 O2.- 产生速率。B.B.可溶性蛋白质含量测定可溶性蛋白质含量测定 比色原理： 染料考马斯亮蓝 G-250 在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者

19、 最大光吸收在 465nm，后者在 595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0100g/ml） ，蛋白质 色素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结 合物在室温下 1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较 好的蛋白质定量法。 【试剂】 1、65mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.8)； 如超氧阴离子自由基含量测定用。 称取 K2HPO43H2O(MW=228.22)9.1234g 和 KH2PO4(MW=136.09)3.406g

20、，蒸馏水定容到 1L。 或 K2HPO43H2O 4.562g 和 KH2PO4 1.703g，蒸馏水定容到 0.5L。 2、考马斯亮蓝 G-250：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50ml 90%乙醇中，加入 85%（W/V）磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容至 1000ml。滤纸过滤后低温储存。常温下可放样品蛋白质含量（mg/g 鲜重）=C*V/W置一个月； 3、磷酸（85%，W/V）：也即商业磷酸(浓度85%)。直接用。 4、0.15M 的 NaCl (标准曲线用)：NaCl0.8766g 蒸馏水定容到 100ml。 【方法】1.标准曲线的绘制 血清白蛋白(BSA)先用

21、0.15M 的 NaCl 配制成 2mg/ml 的原液。 表 1 配制 01000g/ml 血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液(ml) 磷酸钾缓冲液量(ml) 蛋白质含量(g/ml)0 1.0 00.1 0.9 2000.2 0.8 4000.3 0.7 6000.4 0.6 8000.5 0.5 1000 以上各管混匀后，各取 0.1ml 于新的 10ml 离心管内，各加 5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置 2min，在 595nm 下比色，绘制标准曲线。折衷： 表 2 配制 01000g/ml 血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液(ul) 磷酸钾缓冲液量(ul) 蛋白质含量

22、(g/ml)0 100 010 90 20020 80 40030 70 60040 60 80050 50 1000 以上各管混匀后，各加 5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置 2min，在 595nm 下比色，绘制标准 曲线。 2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。取样品上清液 0.1ml 于新的 10ml 离心管内， 各加 5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置 2min，在 595nm 下比色。 3.结果计算式中 C查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg/ml） ；V提取液总体积（ml） ；此为样品提 取液总体积为 3ml；W取样量（g） 。 测定以上 3 项目

23、时，同时取部分同批剩余鲜样称 重后转入纸袋烘干称重。3.叶绿素、类胡萝卜素叶绿素、类胡萝卜素 叶绿素、类胡萝卜素测量叶绿素、类胡萝卜素测量 实验步骤： 叶片快速剪取并精确称重 0.1g 左右，重复 3 次。再快速剪成细丝(或用打孔器打成小的叶 圆片)转入洁净离心管，管内加提取液 10 ml，于室温下遮光静置至样品完全发白(期间多 次摇动提取液)，对提取液比色(以不加叶片的提取液调零)，然后据提取液类型按下面公式 计算叶绿素和类胡卜素含量。剪取叶片同时再精确称取 0.1-0.2g 左右叶片，105C 杀青 10min，80C 烘干恒重后称重。 结果计算： 一、采用丙酮、无水乙醇、蒸馏水混合提取液

24、(三者体积比 4.54.51) Chla(mg/L)= 9.784OD6630.990OD645, Chlb(mg/L)= 21.426OD6454.650OD663, Chl(a+b)(mg/L)=5.134OD663+20.436OD645, Car(mg/L)=4.695OD4400.268(Chla+Chlb), 采用波长 663，645 和 440nm。 唐延林,黄敬峰,王人潮.水稻不同发育时期高光谱与叶绿素和类胡萝卜素的变化规律.中国 水稻科学 2004, 18(1) 59-66 二、采用 80%丙酮提取液-采用波长 663，646 和 470nm。(Arnon and Licht

25、enthale) Chla(mg/L) = 12.21D663 2.81D646；Chlb(mg/L)= 20.13D646 5.03D663； Chl(a+b)(mg/L)= Chla + Chlb =17.32D645 + 7.18D663；Car(mg/L)=（1000D470 3.27 Chla 104 Chlb）/ 229 三、采用采用 95%乙醇提取液-采用波长 665，649 和 470nm。(邹琦 等) Chla(mg/L)= 13.95D665 6.88D649；Chlb(mg/L)= 24.96D649 7.32D665； Chl(a+b)(mg/L)= Chla + Ch

26、lb =18.08D645 + 6.63D663； Car(mg/L)=（1000D470 2.05 Chla 114.8 Chlb）/ 245 结果：Chl (mg/g)=浓度(mg/L)提取液体积(ml)/质量(g)1000。4.可溶性糖可溶性糖 蒽酮法测定可溶性糖蒽酮法测定可溶性糖 样品制备测定： 取新鲜植物叶片（或干材料） ，擦净表面污物，剪碎混匀，精确称取 0.05-0.1g 左右，转入 研钵，加少许石英砂，1ml 蒸馏水充分研磨后转入 10ml 离心管，4ml 蒸馏水分次洗涤研钵 后也完全转入离心管内。离心管沸水浴 30min，5000rpm 离心 5min，上清转入新管，原来 离

27、心管残渣再加水 5ml，混匀后沸水浴 10min，5000rpm 离心 5min，上清一并转入新管，并 蒸馏水定容到 10ml 混匀备测。 【原理】 糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽 酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内,颜色深浅与糖含量成正比。用蒽酮法测出的 碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。 【试剂】 1蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮 1g，溶于 50ml 乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗 中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。 2浓硫酸（比重 1.84） 。 标准曲线制备： 100g/ml 蔗糖标准液：将分析纯

28、蔗糖在 80下烘至恒重，精确称取 1.000g。加少量水溶 解，移入 100ml 容量瓶中，加入 0.5ml 浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；精确吸取 1%蔗糖标 准液 1ml 加入 100ml 容量瓶中，加水定容。 表 各试管加溶液和水的量 管 号012345678910 100g/ml 蔗糖液 (ul)04080120160200水(ul)400360320280240200 此时蔗糖浓度 (g/ml)01020304050取 10ml 离心管 11 支，从 010 分别编号，按照上表加入蔗糖标准液和水后，逐管加入蒽 酮乙酸乙酯试剂 0.1ml 并小心加入浓硫酸 1ml，加盖后充分震荡，立即沸

29、水浴 1min，取出 冷却后 630nm 比色，蒸馏水调零。 上清液 0.2ml 加蒸馏水 0.2ml，加入蒽酮乙酸乙酯试剂 0.1ml 并小心加入浓硫酸 1ml，加盖 后充分震荡，立即沸水浴 1min，取出冷却后 630nm 比色，蒸馏水调零。 结果计算： 可溶糖含量（mg/gFW or DW）=C*V/W/1000 C：标曲所得可溶糖含量(ug/ml)；V：样品提取液体积(10ml)；W：样品鲜重或干重(g)。5.游离氨基酸游离氨基酸 游离氨基酸含量测定游离氨基酸含量测定 样品制备测定： 叶片准确称取 0.05-0.1g 于研钵，1ml 的 10%乙酸重复研磨，转入 10ml 洁净离心管，

30、2ml 的 10%乙酸分两次洗涤研钵并完全转入离心管内，加无氨蒸馏水(可以超纯水替代)定容到 10ml(离心管口位置)，摇匀后 5000rpm 离心 10min，上清液转入新管备测。同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。 试剂配制： 1、醋酸钠-醋酸缓冲液(pH=4.9)：9.679g 的醋酸钠(CH3COONa)加 4.924g 的醋酸(CH3COOH)， 蒸馏水定容到 100ml。 2、茚三酮缓冲显色液(1%)：1.05g 茚三酮18ml 正丙醇25ml 正丁醇50ml 乙二醇 12ml 醋酸钠-醋酸缓冲液。 3、ASA(抗坏血酸)(0.1%)：50mg 的 ASA 溶于 50ml

31、 的无氨蒸馏水(可以超纯水替代)。现用 现配。 4、10%乙酸：10ml 冰乙酸加 90ml 蒸馏水。 5、80%乙醇：850ml 的 95%的乙醇（可以组培间大桶酒精替代）加 150ml 蒸馏水。 6、氨基酸标准溶液(5.0ug/ml)：烘干恒重的谷氨酸 0.0536g，先用少量的 10%的异丙醇 (0.5ml 异丙醇加 4.5ml 蒸馏水混匀)溶解后，转入 100ml 洁净容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。从中 取 5ml 用水稀释到 50ml 即可。 标准曲线制备： 离 心 管 号 试剂123456 氨基酸标准溶液（ul）04080120160200无氨蒸馏水（ul）2001601208040

32、0茚三酮缓冲显色液 （ul）700700700700700700抗坏血酸（ul）202020202020氨基酸含量(ug/ml)012345按照上表依次加入各试剂，摇匀后，沸水浴显色 20min，取出后迅速冰浴，并不时摇动离 心管，当溶液呈蓝紫色时各加 80%乙醇 2ml 和蒸馏水 2.08ml，摇匀后，570nm 比色绘制标 曲。 上清液 200ul 加入到 10ml 离心管内加茚三酮缓冲显色液 700ul0.1%抗坏血酸 20ul沸 水浴显色 20min迅速冰浴溶液呈蓝紫色时加 80%乙醇 2ml蒸馏水 2.08ml570nm 比 色。 结果计算： AA 含量（mg/gFW or DW）=

33、C*V/W/1000 C：标曲所得 AA 含量(ug/ml)；V：样品提取液体积(10ml)；W：样品鲜重或干重(g)。6.过氧化氢 植物组织中过氧化氢含量测定（植物组织中过氧化氢含量测定（=415nm=415nm） 样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织 0.2g 左右（视 H2O2 含量多少而定） ，加入 4下 预冷的丙酮 1ml 和少许石英砂研磨成匀浆后转入离心管，再用 2-3ml 冷丙酮分次洗涤研钵 并把洗涤液转入离心管，3000 r/min 下离心 10min（或 8000rpm 离心 5min） ，同时准备新 的离心管并编号标记并称重记录，离心完以后，上清液转入新离心管后，再次称重

34、，两次 称重差值除以丙酮密度（0.792g/ml） ，即为样品提取液总体积。 【原理】 H2O2 与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物钛复合物黄色沉淀，可被 HSO4 溶解后，在 415nm 波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与 H2O2 浓度呈线性关系。 【试剂】 1、100mol/L H2O2 丙酮试剂：取 30%分析纯 H2O2 10.2l，溶于 100ml 的丙酮（此时 H2O2 为 1mmol/L） ，混匀后从中吸取 50l 再加丙酮 450l 混匀（此时 H2O2 为 100mol/L） 。 2、1mol/L 硫酸：浓硫酸 56ml，缓慢加蒸馏水 944ml，混匀冷却。3、5%（

35、W/V）硫酸钛：称取 5g 硫酸钛，加蒸馏水 100ml 溶解。 4、丙酮(冰浴或冰箱预冷)； 5、浓氨水。 【方法】1.制作标准曲线：取 10ml 离心管 7 支，顺序编号，并按表 1 和 2 加入试剂。 表 1 测定 H2O2 浓度标准曲线配置表 离 心 管 号试剂（ml）1234567 100mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min 离心 10min，弃去上清夜，留沉淀1mol/L 硫酸5.05.05.0

36、5.05.05.05.0表 2 测定 H2O2 浓度标准曲线配置表 离 心 管 号试剂（ml）1234567 1mmol/L H2O200.10.20.40.60.81.04下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min 离心 10min，弃去上清夜，留沉淀1mol/L 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入新的 10ml 离心管中，并用蒸馏水少量多次冲洗原来的离 心管，将洗涤液合并后定容至 10ml 刻度，415nm 波长下比色。2.

37、(2)用移液管吸取样品提取液 1ml，按表 1 或 2 加入 5%硫酸钛 0.1ml 和浓氨水 0.2ml，待沉淀形成后 3000rpm/min 离心 10min（或 8000rpm 离心 5min） ，弃去上清液。沉 淀用冷丙酮反复洗涤 35 次，每次 1ml（具体为：沉淀加冷丙酮 1ml，混匀，8000rpm 离 心 1min，弃掉丙酮；重复此步骤三次） ，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入 1mol/L 硫酸 5ml，摇匀，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。 3.结果计算：植物组织中 H2O2 含量(mol/g Fw)=CVt FWV 1式中 C标准曲线上查得样品中

38、 H2O2 浓度（mol） ； Vt样品提取液总体积（ml） ； V1测定时用样品提取液体积（ml） ；即 1ml。 FW植物组织鲜重（g） 。7. 谷胱甘肽、ASA A.A.谷胱甘肽含量的测定谷胱甘肽含量的测定还原型谷胱甘肽(GSH)是植物细胞内另一种重要的抗氧化剂。它含有活性的巯基，极易 被氧化。 本实验利用疏基试剂 DTNB 测定 GSH 的含量。 试剂药品： GSHGSH 的提取的提取( (下面的下面的 ASAASA 测定也使用该提取液测定也使用该提取液) ) 精确称 0.2g 左右叶片，将样品剪碎加入 5mL 10三氯乙酸，研磨，15000g 离心 10 min，留取上清液备测。同时

39、再精确称取 0.2g 左右叶片，105C 杀青 10min，80C 烘干恒 重后称重。1、10三氯乙酸（TCA）溶液（W/V）：10g 三氯乙酸，用蒸馏水配成 100mL 溶液； 2、150 mM 磷酸缓冲液(pH7.5;含有 5mM EDTA):Na2HPO412H2O38.679g 和 NaH2PO42H2O 3.952g 溶于约 1L 水；加入 EDTA 使其浓度为 5mM，搅匀后蒸馏水定容。 3、6mM DTNB(用上面的 150 mM NaH2PO4(pH7.5;含有 5mM EDTA)来配制) 实验步骤： 1、GSH 标推曲线的制作配制浓度分别为 0mM、0.02 mM、0.04m

40、M、0.06 mM、0.08 mM、0.10mM、0.12 mM 的标 淮 GSH 溶液，吸取上述标准液各 0.25mL。分别加入 150 mM NaH2PO4 (pH7.4)2.60mL，混合 均勾后，往各管中加人 DTNB 试剂 0.15mL，摇匀厉，30保温反应 5min，测 A412nm(以加 磷酸缓冲液代替 DTNB 试剂作空白对照)。将测定结果以 GSH 浓度为横坐标、光密度值为纵 坐标制作标淮曲线。 2、GSH 的提取(下面的 ASA 测定也使用该提取液) 精确称 0.2g 左右叶片，将样品剪碎加入 5mL 10三氯乙酸，研磨，15000g 离心 10 min，留取上清液备测。同

41、时再精确称取 0.2g 左右叶片，105C 杀青 10min，80C 烘干恒 重后称重。 3、总 GSH 含量的测定 分别取上述样品提取液 0.25mL，各加入磷酸缓冲液 2.6mL、DTNB 试剂 0.15mL，以加磷酸缓 冲液代替 DTNB 试剂作空白。摇匀后，于 30保温反应 5min，测定 412nm 波长下的光吸收 值。根据标准曲线计算样品的 GSH 含量。 折衷：分别取上述样品提取液 83uL，各加入磷酸缓冲液 867uL、DTNB 试剂 50uL 于 1.5ml 离心管中(总体积 1ml)，以加磷酸缓冲液代替 DTNB 试剂作空白。摇匀后，于 30保温反应 5min，使用微量比色

42、皿测定 412nm 波长下的光吸收值。重复 3 次。 实验结果： GSH 含量用 g/gDW 表示。 ASAASA 含量的测定含量的测定 试剂药品： 1、150mM 磷酸缓冲液(pH7.4) :Na2HPO412H2O38.679g 和 NaH2PO42H2O3.952g 溶于约 1L 水；加入 EDTA 使其浓度为 5mM，搅匀后蒸馏水定容。 2、10三氯乙酸（TCA）溶液；10g 三氯乙酸，用蒸馏水配成 100mL 溶液； 3、44H3PO4：分析纯磷酸(含量 85%)取 44ml 加水 45ml 混匀。 4、4的 2，2-二联吡啶（溶于 70%乙醇） ；4g 二联吡啶用 70%乙醇溶解并

43、定容到 100ml。 5、3FeCl3：3g FeCl3 蒸馏水溶解并定容到 100ml。 实验步骤： 1、ASA 标推曲线的制作称取 17.613mg 的 ASA，溶解并定容至 100mL，得到 1mmol/L 的标准母液，利用该母液 配制浓度分别为 0mM、0.1 mM、0.2mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5mM、0.6 mM、0.7 mM 的标淮 ASA 溶液，吸取上述标准液各 0.2mL。分别加入 150 mM NaH2PO4 (pH7.4) 0.2mL，H2O0.2mL，混合均勾后。超过 30s 后再分别往各管中加入 10TCA 溶液 0.4mL、44H3PO40.4mL，4

44、 2，2-二联吡啶 0.4mL、3FeCl30.2mL，混匀后在 37水浴 中保温 60min，然后测 525nm 处的 OD 值。将测定结果以 ASA 浓度为横坐标、光密度值为纵 坐标制作标淮曲线。 2、ASA 的提取（使用前面的 GSH 提取液）称 0.2g 叶片，将样品剪碎加入 5mL 10三氯乙酸，研磨，15000g 离心 10 min。 重复 3 次。同时再精确称取 0.2g 左右叶片，105C 杀青 10min，80C 烘干恒重后称重。 3、ASA 含量的测定 分别取上述样品提取液 0.1mL，分别加入 150 mM 磷酸缓冲液(pH7.4) 0.1mL，H2O(蒸馏水) 0.1mL，混合均匀后，至少 30s 后再分别往各管中加入 10TCA 溶液 0.2mL、44H3PO40.2mL，4 2，2-二联吡啶 0.2mL、3FeCl30.1mL(总体积 1ml)，混匀 后在 37水浴中保温 60min，然后用微量比色皿测 525nm 处的 OD 值。重复 3 次。 实验结果：ASA 含量用 g/gDW 表示。