DNA和质粒抽提.ppt

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1、DNADNA抽取和质粒抽取和质粒DNADNA制备制备第一部分第一部分DNA提取总论提取总论一、提取一、提取DNADNA总的原则：总的原则：1 1 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子分子的污染应降低到最低程度；的污染应降低到最低程度；3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也应尽量去除。也应尽量去除。二、样本来源：二、样本来源：w理论上所有有核真核细

2、胞、细菌、病毒都可理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取以提取DNAw样本选择取决于样本选择取决于试验目的试验目的w全血是基因组提取最常见的样本全血是基因组提取最常见的样本w血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上DNA提取前样本采集、预处理和保存：提取前样本采集、预处理和保存：（一）全血（一）全血1.抗凝剂EDTA-Na2或枸橼酸钠或枸橼酸钠作为抗凝剂作为抗凝剂不宜使用肝素不宜使用肝素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80保存2个月，第10天收率90%4第四天收率9

3、0%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差mRNAmRNA逆转录后逆转录后RT-PCRRT-PCR结果（结果（0 0、3 3、6 6个月）个月）A B C DA B C D（二）血浆和血清（二）血浆和血清w血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测中w血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是游离的单链、双链DNA或DNA-蛋白质的混合物w它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景w血浆DNA成分的来源分为内源

4、性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的成分血浆血浆DNADNA内源性循环内源性循环DNADNA外源性循环外源性循环DNADNA自身基因组来源自身基因组来源DNADNA入侵的病毒、细菌等病原体入侵的病毒、细菌等病原体死亡细胞死亡细胞活细胞释放活细胞释放（三（三）体液体液w尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本离心后取沉淀提取体液中细胞的核酸w对释放入体液中的病毒或细菌的游离核酸，采用超高速离心或体液浓缩后再提取核酸（四）分泌物（四）分泌物（以痰液为例）w痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前应先漱口，以避免

5、混入大量的口腔脱落的上皮细胞和唾液等影响检测结果 w结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸，使用生理盐水后取上清液 w痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率三、三、DNA的收率的收率样本类型样本类型基因组基因组DNA收率收率20mg肝脏组织肝脏组织8 g100mg豆苗豆苗10 g100 l全血全血2 g2 106培养细胞培养细胞10 g四、四、DNA提取的基本步骤提取的基本步骤1、核酸的释放：核酸的释放：破裂细胞破裂细胞 释放核酸释放核酸 机械法与非机械法机械法与非机械法 （非机械法中（非机械法中溶胞法溶胞法是应最广

6、泛的方法）是应最广泛的方法）各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母破裂细胞破裂细胞、释放核酸、释放核酸2、核酸的分离与纯化：、核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子）、非需要的核酸分

7、子、试剂和溶液3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用少数盐类可使用70-75%70-75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤4、DNA鉴定鉴定DNA的鉴定的鉴定浓度鉴定浓度鉴定纯度鉴定纯度鉴定完整性鉴定完整性鉴定浓度鉴定浓度鉴定1 1）紫外分光光度法：测定）紫外分光光度法：测定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。如计算如计算DNADNA浓度浓度A A26026

8、0稀释倍数稀释倍数5050 g/mlg/ml紫紫外外分分光光光光度度法法只只用用于于测测定定浓浓度度大大于于0.25ug/ml的的核核酸酸溶液。溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱2 2）荧光光度法）荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）EB与DNA的结合500 l全血提取的基

9、因组全血提取的基因组DNA电泳电泳动物组织提取基因组动物组织提取基因组DNA纯度鉴定纯度鉴定紫外分光光度法：紫外分光光度法：在在260260nmnm和和280280nmnm处测定处测定DANDAN溶液的光吸收，纯的溶液的光吸收，纯的DNADNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有高于此值表明有RNARNA的残留量。的残留量。A A260260与与A A280280之比应在之比应在1.801.80；纯的；纯的RNA ARNA A260260与与A A280280之比之比应在应在2.02.0。A260/A280A260/A280比值是纯度检测的重

10、要指标。比值是纯度检测的重要指标。完整性鉴定完整性鉴定凝胶电泳法：凝胶电泳法：基因组基因组DNADNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；可出现电泳图谱脱尾现象；总总RNARNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNARNA降解；如加样槽中存在条带，可能是降解；如加样槽中存在条带，可能是DNADNA污染。污染。5 5、核酸的贮存、核酸的贮存DNADNA保存保存1 1）短期贮存：）短期贮存：4 4或或-20-20存放于存放于TETE（tristris和和EDTAEDTA）缓冲液中。缓冲液中。TETE

11、缓缓冲冲液液的的PHPH与与DNA DNA 贮贮存存有有关关，PHPH为为8 8时时，可可减减少少DNADNA脱氨反应，脱氨反应，PHPH低于低于7.07.0时时DNADNA容易变性。容易变性。2 2）长期贮存：）长期贮存：TETE缓冲液中缓冲液中-70-70保存数年；在保存数年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。第二部分第二部分 基因组基因组DNADNA的分离与纯化的分离与纯化一、一、DNADNA样品准备样品准备 常见的标本：常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织：生物组织

12、：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70 70或液氮或液氮二、二、DNADNA提取提取（一）酚抽提法：（一）酚抽提法：先先用用EDTAEDTA、SDS SDS、蛋蛋白白酶酶K K破破碎碎细细胞胞，消消化化蛋蛋白白，然然后后用用pH8pH8的的TrisTris饱饱和和酚酚或或酚酚-氯氯仿仿抽抽提提DNADNA，最最后后乙乙醇醇或或异异丙丙醇醇进进行行沉淀。获沉淀。获DNADNA大小为大小为100100150150kbkb。DNA酚抽提法示意图主要试剂的作用：主要试剂的作用：EDTAEDTA：1 1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2

13、 2 降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性SDSSDS的作用：的作用：1 1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂2 2溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来释放出来3 3 对对RNARNA、DNADNA酶有抑制作用酶有抑制作用4 4 与蛋白质形成与蛋白质形成R-O-SO3.RR-O-SO3.R蛋白质复合物，蛋白质复合物，使蛋白质变性使蛋白质变性蛋白酶蛋白酶K K：w水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化DNADNA酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质w蛋白酶蛋白酶K K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白

14、酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在力，而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可 同时使用同时使用苯酚的特点：苯酚的特点：w蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制DNADNA酶活性酶活性w苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水w提取提取DNADNA前苯酚用前苯酚用TrisTris-HclHcl饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多DNADNA，降低降低DNADNA的损失率的损失率w氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏DNADNA为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNADNA的分离？的分离？苯酚在空气中经常被氧化生成醌

15、，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。wPH8.0PH8.0的的TrisTris溶液可以似的抽提出的溶液可以似的抽提出的DNADNA进入进入水相，减少在蛋白质层滞留。水相，减少在蛋白质层滞留。w在酚或酚在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。保持分相的稳定性。DNADNA的沉淀的沉淀1）无水乙醇沉淀）无水乙醇沉淀沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等盐离子

16、，作用是中和核酸分子表面等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。的损伤。2）异丙醇沉淀）异丙醇沉淀除了使除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子分子（二）（二）甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法：w破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与质与DNADNA的结合

17、，再透析获得的结合，再透析获得DNADNA。高浓度甲酰高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与胺可以裂解蛋白质与DNADNA的复合物，可以使蛋的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤白质变性。减少了酚多次抽提的步骤w甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。（三）（三）玻璃棒缠绕法：玻璃棒缠绕法：w用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或上，然后用带钩或U U型玻璃棒在界面轻搅，型玻璃棒在界面轻搅，DANDAN沉淀液绕于玻棒。生成沉淀液

18、绕于玻棒。生成DNADNA约约8080kbkbDNA玻棒缠绕法示意图（四）（四）表面活性剂快速制备法：用表面活性剂快速制备法：用Triton Triton X-100X-100或或NP40NP40表面活性剂破碎细胞，然后用表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶蛋白酶K K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。二、二、DNADNA的浓缩的浓缩1 1、固固体体聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）浓浓缩缩：用用透透析析袋袋 外敷外敷PEGPEG至合适量至合适量2 2、丁丁醇醇抽抽提提浓浓缩缩：DNADNA溶溶液液中中水水可可分分配配到到正正丁丁醇醇或或仲仲丁丁醇醇，但但DNADNA不不会

19、会。因因此此重重复复几次可显著减少几次可显著减少DNADNA体积体积三、三、DNADNA回收回收主要是从电泳中分离回收主要是从电泳中分离回收DNADNA片段片段回收原则：尽量提高回收率回收原则：尽量提高回收率 去除回收去除回收DNADNA样品中的污染物样品中的污染物（二）从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法2.电泳洗脱法3.冷冻挤压法4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段电泳到电泳到DEAE-DEAE-纤维素膜纤维素膜 ：DEAEDEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有是一种阴离子交换纤维素，可以吸

20、附带有负电荷的负电荷的DNADNA分子分子 在所需条带前插入在所需条带前插入DEAT-DEAT-纤维素膜，继续电泳纤维素膜，继续电泳至条带至条带DNADNA都到膜上，取出洗下都到膜上，取出洗下 500 500bpbp-5kb-5kb的的DNADNA片段回收率较好，纯度高。片段回收率较好，纯度高。但但不适用于分子量超过不适用于分子量超过1010kbkb和单链和单链DNADNA透析袋电洗脱透析袋电洗脱 ：切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，继续电泳，DNADNA出胶后进行抽提出胶后进行抽提DNADNA回收。回收。低熔点琼脂糖凝胶：低熔点

21、琼脂糖凝胶：切下胶，加热到切下胶，加热到6565熔化胶，然后抽提回收熔化胶，然后抽提回收DNADNA。方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。水解酶等。琼脂水解酶：将含琼脂水解酶：将含DNADNA的凝胶进行消化，琼脂糖的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放水解成二糖，释放DNADNA，后使用酚抽提方法回后使用酚抽提方法回收收DNA DNA（二）从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。w至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回

22、收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。DNA提取试验中常遇到的问题提取试验中常遇到的问题w基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞破裂不够充分，DNA释放不完全离心力偏小两相分离不完全wDNA降解的原因降解的原因样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶w提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未清除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素w提取基因组提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因有时加入蔗糖的原因加入多糖，保护加入多糖，保护DNA长度长度质质 粒粒 DNA DNA 制制 备备plasmidplasmid extractio

23、n extraction质粒简介质粒简介质粒质粒(plasmidplasmid)是细菌内独立于染色体并能是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状自我复制的小环状DNADNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 制和遗传的辅助性遗传单位。制和遗传的辅助性遗传单位。ChromosomeDNAgenomePlasmidDNA 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要

24、媒介物，这种基因运载工具表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术本的实验技术 质粒特性质粒特性1.1.分子相对小分子相对小 2.2.含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分 3.3.不相容性不相容性(incompatibility)(incompatibility)4.4.转移性转移性5.5.选择的标记选择的标记(selective markers)(selective markers)6.6.限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口质粒的结构特点质

25、粒的结构特点w分子量相对较小分子量相对较小w共价闭合分子共价闭合分子w双链环状结构双链环状结构具有更强的抗切割和抗变性能力具有更强的抗切割和抗变性能力超超螺旋螺旋DNA分子分子 线性线性DNA分子分子 半开环半开环DNA分子分子Plasmidvectors表达载体表达载体载体含有载体含有tac启动子、启动子、Lac操纵基因、操纵基因、SD序列、序列、LacI阻遏蛋白基因等阻遏蛋白基因等Exprssionvector细菌收集纯化质粒DNA细菌培养细菌裂解质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 一、细菌的培养一、细菌的培养 (bacterial

26、culture)(bacterial culture)l l 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素数生长后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白质的合成抑制宿主蛋白质的合成和染色体和染色体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复制不受的复制不受影响而大

27、量扩增影响而大量扩增l所所以以使使用用氯氯霉霉素素的的主主要要目目的的，是是在在不不减减低低质质粒粒产产量量的的前前提提下下，减减少少细细菌菌的的培培养体积和细菌的数量养体积和细菌的数量 有有时时质质粒粒在在细细菌菌中中的的扩扩增增状状况况很很差差，常常是是由由于于质质粒粒携携带带外外源源基基因因或或质质粒粒分分子子量量过大所致。过大所致。二、细菌的收集二、细菌的收集(bacterial collection)(bacterial collection)w细细胞胞生生长长过过程程中中，排排出出大大量量代代谢谢产产物物，为为了了提提高高质质粒粒DNADNA的的纯纯度度，离离心心弃弃上上清清，细细

28、菌菌沉沉淀淀最最好好用用STESTE或或生生理理盐盐水水悬悬浮浮，漂漂洗洗l-2l-2次次，离离心心管管壁壁上上的的液液体体也也应应该该仔仔细细去去除干净。除干净。三、细菌裂解w细细胞胞的的裂裂解解方方法法很很多多，如如去去污污剂剂法法，沸沸水水热热裂裂法法、碱碱变变性性法法，有有机机溶溶剂剂法法和和溶溶菌菌酶酶法法等等。不不同同方方法法各各有有利利弊弊，一一般般要要根根据据质质粒粒性性质质、宿宿主主菌菌的的特特性性及及后后继继的的纯纯化化方方法法等等多多种种因因素素综综合合后后加以选择加以选择。质粒提取的方法质粒提取的方法w碱裂解法碱裂解法(Alkaline)w煮沸裂解法煮沸裂解法wSDS裂

29、解法裂解法w其他其他质粒质粒DNADNA提取方法的选择提取方法的选择 l常常用用的的煮煮沸沸法法，碱碱法法,SDSSDS法法均均可可获获得得较较满满意意效效果果至至于于有有人人采采用用碱碱法法提提取取小小量量细细菌菌培培养养物物的的质质粒粒，用用煮煮沸沸法法或或SDSSDS法法进进行行质质粒粒DNADNA的的大大量量分分离离，只只是是各各个个实实验室的习惯问题验室的习惯问题.l选选择择哪哪种种方方法法制制备备质质粒粒DNADNA，应应考考虑虑以以下下因素：因素：1 1菌株类型（菌株类型（typetype）2 2质粒的大小质粒的大小(size)size)3 3细菌染色体细菌染色体DNADNA变性

30、条件强弱的控制变性条件强弱的控制 (denaturationdenaturation condition)condition)质粒质粒DNA的小量制备的小量制备2-5ml质粒质粒DNA的大量制备的大量制备500mlw大质粒（大质粒（15kb）的处理方法：的处理方法：采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再后再使用使用SDS裂解，使裂解，使plasmid损伤减少损伤减少w小质粒（小质粒（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。（四）其它方法（四）其它方法2、牙签少量制备法1、小量一步提取法1、小量一步提取法 直

31、接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。（二）牙签少量制备法 用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA。由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。质粒质粒DNADNA的纯化的纯化.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱层析法EBCsCl密度梯度离心法wEB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。wCsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。超速离

32、心将介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中间，由于不同结构的DNA与EB结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开。EBCsCl密度梯度离心法示意图l转基因动物，真核细胞转染及转基因动物，真核细胞转染及DNADNA外切酶酶切外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链缺失等实验，对闭合环状双链DNADNA的要求较高，的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。一般还是用超速离心法纯化质粒。对于对于DNADNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记

33、等实验，直菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的接用小量或中量提取的DNADNA样品，并不需要超样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。速离心纯化，一般可满足实验要求。2 2 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法 分级沉淀，首先利用分级沉淀，首先利用LiClLiCl沉淀大分子沉淀大分子RNARNA，用用RnaseRnase酶消化小分子酶消化小分子RNARNA；在利用乙在利用乙二醇选择性沉淀大质粒二醇选择性沉淀大质粒DNADNA，再利用酚再利用酚-氯仿抽提。氯仿抽提。方法简单实用，但是不能区分环状或开方法简单实用，但是不能区分环状或开链质粒链质粒DNADNA3 3 柱层析法

34、柱层析法w以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多盐的条件下，盐的条件下，DNADNA与硅基质可逆性的结合与硅基质可逆性的结合进行纯化。进行纯化。w多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用50%50%的乙醇洗去的乙醇洗去RNARNA和糖类物质，再加入和糖类物质，再加入TETE或或水，离心洗脱。水，离心洗脱。RNARNA的分离与纯化的分离与纯化RNA isolation and purificationRNA isolation and purification每个细胞的每个细

35、胞的RNA量约为量约为10-5g80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA组织材料起始样品量TotalRNA提取量blood1ml1520glecukocytes1107个约100gLivertissue1g约5000gCulturecells1107个约100gRenaltissue1g约3000gSkeletontissue1g约1500gCerebraltissue1g约1500g一、关于一、关于RNaseRNase酶酶wRNA易被RNase水解，RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中wRNa

36、se具有水解核糖残基和磷酸二酯键wRNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。wRnase不需要二价阳离子激活w去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。w必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。1.内源性内源性RNA酶酶（intrinsic RNase）2.外源性外源性RNA酶酶(extrinsicRNase)主要来源：w被污染的缓冲液细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶，必须丢弃w自动移液装置3.实验室采取避免实验室采取避免RNA酶污染的措施酶污染的措施w设置专门设置专门RNA移液装置移

37、液装置w小份保存缓冲液小份保存缓冲液w设置专门的设置专门的RNA电泳装置电泳装置w准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶的器皿、酶的器皿、DEPC处理水等处理水等w分离分离RNA过程中使用过程中使用RNA酶抑制剂酶抑制剂1.1.变性剂变性剂(denaturant)(denaturant)w选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）w使用蛋白酶K(proteinase K)w使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠二、二、RNARNA酶抑制剂和变性剂酶抑制剂和变性剂w胍类变性剂胍类变性剂(carbamidine)：胍盐是破坏蛋白：胍盐是破坏

38、蛋白质三维结构的离液剂。质三维结构的离液剂。w蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。酸胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。w盐酸胍抑制盐酸胍抑制RNA酶作用强，变性作用较异硫氰酶作用强，变性作用较异硫氰酸胍弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键，在还原酸胍弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键，在还原剂存在下断裂氢键。剂存在下断裂氢键。w联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。2.2.RNARNA酶抑制剂酶抑制剂(RNaseRNase inhibitor)inhibitor)（1

39、）DEPC（焦碳酸二乙酯）w高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC。（2 2）RNARNA酶的蛋白抑制剂酶的蛋白抑制剂w许多RNA酶可以与该类蛋白质结合形成非共价复合物从而是RNA酶失活。wRNA酶蛋白抑制剂与靶蛋白的亲和力大。w商品化的RNA酶蛋白抑制剂的名称各

40、异（如RNAsin等）。3.3.还原剂还原剂w加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。RNA提取实验前的准备提取实验前的准备【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用0.1%DEPC水溶液在37处理12h，后120高压30min，去除残留DEPC【试剂配制】无菌水须用0.1%DEPC处理后高温高压灭菌 RNA实验试剂应RNA提取专用，避免其他试剂交叉污染【其他】实验过程中使用一次性手套，并经常更换；在RNA专用区操作，操作过程中避免交谈 三、酸性异硫氰酸胍三、酸性异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法w首先以

41、含异硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞。w然后在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液。w最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。w本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个标本。w总RNA产量取决于标本的起始量，每mg组织大约能制备47g总RNA，每106个细胞大约为410g。四、商品化的单相裂解试剂法分四、商品化的单相裂解试剂法分RNARNAw本法是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案。w以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。w变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉

42、淀出来。w保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。四、商品化的单相裂解试剂法分四、商品化的单相裂解试剂法分RNARNAw目前，该法已成为实验室最常用的总RNA提取法，其产量及质量与前法相当。Trizol五、五、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化w除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴。w利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。1.oligo（dT）-纤维素柱层析法2.oligo（dT）-纤维素柱离心法3.oligo（dT）-纤

43、维素液相结合离心法4.磁性球珠分离法（1 1）oligooligo(dTdT)-)-纤维素层析柱法纤维素层析柱法（2 2）oligooligo(dTdT)-)-纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法（3 3）磁珠分离法）磁珠分离法实验步骤实验步骤1每每mg组织中加入组织中加入1mlTrizol试剂，高速破碎试剂，高速破碎组织（使用高速组织捣碎器）组织（使用高速组织捣碎器）2加入氯仿加入氯仿0.2ml,轻轻颠倒混匀，室温静置轻轻颠倒混匀，室温静置分层。分层。3.高速离心高速离心12000rpm，4-8C，10分钟分钟4.吸上清液至新离心管中，约吸上清液至新离心管中，约600ul5加入加入500

44、ul异丙醇，混匀，室温静置异丙醇，混匀，室温静置10分钟分钟6.高速离心高速离心12000rpm，4-8C，10分钟分钟7.弃上清液，沉淀为弃上清液，沉淀为RNA8.加入加入1mlDEPC处理的处理的75%乙醇，混匀，乙醇，混匀，7500rpm离心，离心，4-8C，5分钟分钟9.加入加入DEPC处理水处理水30ul，混匀，混匀，55-60C水浴水浴10.3ul加入加入297ulDEPC水，测定浓度和纯度水，测定浓度和纯度RNA浓度（g/ml）=A26040 1/光径稀释倍数RNA纯度=A260/A280 比值为2.0表明RNA较纯RNA鉴定w浓度鉴定浓度鉴定w紫外吸光光度法紫外吸光光度法:A

45、A260260稀释倍数稀释倍数4040 g/mlg/ml(OD260-OD320)(OD260-OD320)稀释倍数稀释倍数4040 g/mlg/mlw纯度鉴定纯度鉴定wOD260/OD280(1.82.0)Ratio2.2:RNA可能已可能已经水解成水解成单核苷酸核苷酸注：注：测定吸光定吸光值，稀，稀释液液应使用使用正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示RNA的降解的降解完整性鉴定：完整性鉴定：w如何避免含量较低？w.时可能存在的问题？核酸的贮存核酸的贮存RNARNA保存保存wRNARNA可溶于可溶于0.30.3mol/Lmol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，的醋酸钠溶液或双蒸水，在在-70-70保存。保存。wRNARNA可溶于可溶于70%70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在液中，可在-20-20 保存。保存。wRNARNA如果以如果以DEPCDEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制焦碳酸二乙酯）可以抑制RNARNA酶对酶对RNARNA的降解的降解