半定量技术.pdf

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1、高等生物基因表达的变化是调控细胞生命活动的核心机制，正是由于基因的差异表达才决定 了生物体的所有生命过程。因此，研究不同类型细胞或同一类细胞在不同发育时期或不同发育状态下基因表达的变化，已成为当今生物学的研究热列无关的管家基因，如一肌动蛋白（）和甘油一一磷酸脱氢酶（）等，因为这些基因的转录比较稳定，含量相对丰富。将逆转录为后，使靶基因和“管家基因”在同管或异管中一起扩增，在对扩增产物进行分析时，首先根据各样本间“管家基因”扩增条带密度是否一致，粗略地判断各样本抽提的效率、质量和扩增效率是否一致，然后以“管家基因”扩增产物条带的密度作为标准，计算出靶基因扩增条带密度与其之点之。半定量逆转录多聚合

2、酶链式反应（，）技术是近年来发展起来的探讨基因转录水平的有效手段】。与传统的法比较，它具有灵敏、简捷、特异性高等优点，因此在检测基因的表达水平上得到了广泛的应用。比值，并通过观察各样本扩增产物的比值，得出靶基因的表达量的相对变化【】。原理反应参数半定量 技术的核心即，是世纪年代末出现的一种相对定量的技术。当人们的质量在运用半定量方法检测特异基因表达量的差异时，总的质量至关重要，只有在总未被降解的情况下，才能保证其中的完整性，从而真实反映起始模板中基因表达量的差异。因此，每个样品须检查其完整性和纯度，可以通过琼脂糖或甲醛变性电泳分析证明总的完整性，一般在电泳图上会出现两条欲利用该技术研究并揭示某

3、一基因的表达产物量的改变时，利用相同量的进行反转录后，再扩增，然后将扩增产物进行电泳判断量的差异。为避免样本间模板质量和扩增效率的差异而导致最终结果的差异，在反应体系中引人了内对照系统。在一般情况下大多选用与靶基因序收稿日期：修订期：作者简介：金凤媚（一），女，天津人。助理研究员，主要从事番茄分子育种研究。万方数据第期金凤媚等：半定量 技术的研究及应用带和，且的亮度应是的两倍【】。半定量 检测体系必须防止混在中的基因组带来的假阳性，所以在抽提后一定要用酶消解残存在样品中的。逆转录（）逆转录酶或能有效地逆转录，合成模板，加（酶抑制剂），可获得最高产量。实验证明，合成后残留的完整模板干扰，因为它与

4、竞争作为模板【，而和反转录酶的内在活性足以降解残存的大多数模板。但使用缺乏活性的反转录酶时，则必须用处理。在逆转录过程中另一个需要考虑的情况是低拷贝的反转录效率要低于高拷贝，尤 其是在反转录过程中存在大量非特异和背景时，这种情况更为明显，因此反转录过程中基因表达的实际情况。矛 浓度对扩增效率的影响 是影响酶扩增效率的重要因素，浓度范围在，但扩增效率视序列而定。徐春兰等【】的研究表明：对细胞谷胱甘肽过氧化物酶基因扩增的影响较大，浓度在 时，扩增效率不理想，条带较淡，进一步应用分析软件对电泳条带值进行分析时发现，在时扩增效率及特异性良好。而对于小 麦硫蛋白基因的检测结果，能同时稳定扩增目的基因和内

5、参的浓度分别为和叭引物的影响引物问的竞争利用 技术对进行检测时一般要在同一管中对内参照和目的基因进行扩增。要在同一管中有效扩增出内参照和目的基因产物，并在凝胶电泳上清晰显现，同时消除引物对间可能的竞争，在设计引物时，除满足引物设计的基本要求外，还应考虑引物扩增的预期退火温度，特异基因和内参照引物的预期退火温度尽量相符；引物序列进行比对时，二者应无同源性；产物长度应有一定差异，以免电泳时重叠。如果目的基因与内参基因的扩增动态曲线表明，二者处于线性期的循环次数相差过大，却直接同管扩增，则两者的产物量受到竞争，扩增效率降低，这时可选用同批异管扩增，并在不同循环次数下 分别取出二产物【】。引物的设计在

6、选择引物时，尽量使上游和下游引物跨越不同外显子，这样能把从 得到的扩增产物和从任何污染的包含内含子 序列的基因组得到的产物区分开（图）。最 佳的序列引物是完全精确与模板互补，在序列中，定位模板引物的重要理由是：（）它确定产物长度，应选择扩增的线性问题应该认真考虑。解决该问题的方法是每个反应进行重复，看每次重复的变化程度，如果每次重复的结果变化很大，说明可能发生了不稳定随机现象【。模板量和反应循环数设计相对定量实验方案时必须注意预先确定最佳模板量和反应的循环数。扩增反应是酶促反应，遵循酶促反应定律，开始的循环内扩增产物呈指数累积，产物与模板呈线性关系。半定量 技术【】正是利用产物与模板量的这一线

7、性关系，通过扩增产物来对比总中目的基因的表达。但经过一定的循环后，产物不再呈指数累积而进入平台期，因此，为避免平台效应的影响，合适的循环数是半定量方法的关键因素之一。循环次数因扩增目的条带不同而不同，陈昕等【在建立小麦硫蛋白基因半定量 检测方法时，目的基因和内参的循环次数分别为和次。石艳丽等人【在用此方法测定链球菌透明质酸合酶的水平时，实验结果目的基因和内参的循环次数分别为和次。卢建雄等 在检测生脂基因时则均确定为次。【】在研究垂体瘤细胞时循环次数为次。在逆转录之前，总的定量也是实验的关产物的模板引物位点，因为小于的扩增产物，需要高分辨率的特殊琼脂糖凝胶区分，并且引物和引物假象可导致模糊不清；

8、大于的产物，受酶作用性能的限制，难以有效扩增，如聚合酶，延伸长链则完全无效，而且易于脱离模板【】。此外，引物序列与其它转录基因完全同源时，会产生更多的伪假产物。计算机软件程序和实践经验很便利于引物设计【】，但也必须多次试验，才能确定最适引物。键步骤，用等量的作为起始模板，从而保证随后的扩增条带亮度的差异，能够真实反映万方数据天津农业科学第卷中的表达量的差异，结果表明 茎 和 根 的 表 达 要 高 一 口 口 一 由 一 厂 产物一一一 卜口口基因组产物于叶片组织，这使人们能有目的的以烟草为生物反应器为人类服务。张鸿来等用半定量方法检测乳腺癌细胞一 的应用获日其它因素的影响电池得成功，其简便、

9、快速的特点更适合于临床应用。综上所述，我们可以看出半定量 是一种粗略地估计基因表达的相对变化的方法，若 要精确地计算基因的表达量还需利用实时荧光等技术，但多数研究的焦点并不是检测转录水平微小的变化或确切的分子数目，而是检测其表达水平变化是否显著。所以，半定量分析水平的方法在各个研究领域都有着非常广泛的应图区别内含子的除了对上述所提到的几种关键因素进行选择外，还要相应的调整、酶浓度等其它的一些参数来提高反应的特异性及灵敏度，最大限度的提高方法本身的可靠性。技术的应用用，随着该技术的日趋成熟和完善，它将成为研究者的强有力的研究手段。参考文献：对动物和植物基因表达变化的分析在动植物表达分析中，常常用

10、到的是实时定量、基因芯片等半定量技术，但 这些方法费时费力，且需要特殊的仪器，而半定量 技术操作相对简便，近年来被广泛地应用于此类研究中。陈昕等（）在研究小麦硫转运蛋白基因的表达时建立了半定量 方法。徐春兰和汪以真（）用半定量 法评定了不同生长阶段猪抗菌肽卜基因表达差异，结果显示，不同生长阶段猪卜基因表达有差异，从出生到断奶前，一表达量呈增加趋势，断奶时表达【】刘中成，赵锦，刘孟军差异显示技术评述【】分子植物育种，（）：【】，：眈【】，（）：【】，（）：林仁勇丁剑冰，温浩，等半定量检测细胞因子表达的研究 新握医科大学学报，（）：【】谷守芹解灵君，范永山植物组织总提取的常用方法及优化策略】保定师

11、范专科学校学报，（）：【】，粕一，：量下降，断奶后随日龄增加一表达量再逐渐增加。因此，在断奶期通过添加某些养分，促进卜了基因的表达，对于提高仔猪的抗病能力具有重要意义。石艳丽等用半定量 法测定链球菌透明质酸合酶的水平，这对于深入探讨透明质酸发酵有重要意义。在医学上的应用半定量 技术自建立以来，在医学领】，：”【】，（）：【】，（）：【】陈昕，王保莉，曲东，等小麦硫转运蛋白基因半定量 检测方法的建立【】西北植物学报。，（）：【】石艳丽，郭学平王凤山，等半定量法测定链球菌透明质酸合成酶的水平【】食品与药品，（）：,域得到了广泛的应用与发展。周林福等四对荧光定量与半定量检测做了对 比分析，结果证明，

12、临床基因检测实验室可用半定【卢建雄臧荣鑫，潘和平半定量 法检测原代培养脂肪细胞生脂基因转录表达【】中兽医医药杂志，（）：【】，丑 量法替代荧光定量法检测血清的载量，这为临床基因检测实验室提供了方法学选择依据。等【唰用该方法确定了人类重组的骨格形成素基因一在烟草不同组织 万方数据第期金凤媚等：半定量 技术的研究及应用【】，（）：（）：【】，【】徐春兰，汪以真半定量法分析猪肌肉组织细胞谷胱甘肽过氧化物酶表达水平【】中国兽药杂志，（）：【】蔡马研究基因转录的技术【】生物学杂志，（）：【】，吡 ，（）：【】，（）（）：，【】，（）：【】周林福，陈离伟，姜云水，等荧光定量与半定量检测的对比分析【中国病理

13、生理杂志，（）：，（）：【。【】，【，（）：【，（）：【】张鸿平，吴秉铨，张卫国，等半定量方法的建立及其在病理学中应用【】中华病理学杂志，（）：【】，天津农业科学稿约天津农业科学是天津市农业科学院信息研究所主办的综合性学术期刊。主要报道农林、植保、土壤肥料、园艺、畜牧兽医、农产品贮藏加工、水产、花卉、生物技术等方面的基础理论、试验报告、实用技术和专题综述类文章及农业区划、科研管理等软科学论文。适合各级农业科技人员、农技推广人员、农业行政管理干部、农业大中专院校师生参阅。来稿注意事项（）文稿应为作者创作，并为首发稿。作者享有文稿的著作权，文责由作者自负。来稿请提供作者真实姓名及联系地址、邮编、电

14、话号码和，同时注明第一作者简历（包括出生年、性别、籍贯、学位、职称和主要从事的研究）及基金资助项目的名称和编号。（）来稿请提供打印稿及文档，并请自留底稿。文稿务求论点明确，论据可靠，数字准确，图表清晰，内容注意保守国家机密，并附中英文文题、摘要、关键词（个）以及图题、表题。摘要内容应包括研究目的、方法、结果、结论，字左右。文中引用他人文献，请在文后顺序列出，并在文中相应位置用方括号标出。（）本刊作为中国科技论文统计源期刊已被中国学术期刊（光盘版）、万方数据库数字化期刊群收录并全文上网，如作者不同意收录，请在投稿时申明，否则视为同意收录。（）依照著作权法规定，本刊可以对来稿作文字修改、删节，涉及

15、内容的修改应征得作者同意。（）来稿请勿一稿多投。如该稿曾在学术会议上宣读或用其他文种发表过，请在投稿时说明。真诚期待您的来稿！投稿地址：天津市南开区白堤路号邮编：电舌矸专真：万方数据半定量RT-PCR 技术的研究及应用作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：金凤媚，薛俊，郏艳红，刘仲齐，JIN Feng-mei，XUE Jun，JIA Yan-hong，LIU Zhong-qi 天津市农业生物技术研究中心,天津,300192 天津农业科学TIANJIN AGRICULTURAL SCIENCES 2008，14(1)2 次 参考文献(22 条)1.刘中成.赵锦.刘孟军mRNA

16、 差异显示技术评述 期 刊 论 文-分 子 植 物 育 种2004(06)2.Cottrez F.Auriault C.Apron A Quantitative PCR:validation of the use of multispecific internal control 1994(01)3.Wang A M.Doyle M V.Mark D F Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction 2000(02)4.林仁勇.丁剑冰.温浩半定量 RT-PCR 检测细胞因子表达的研究期刊论文-新疆医科大学学报2003(05)5.谷守

17、芹.解灵君.范永山植物组织总RNA 提取的常用方法及优化策略期刊论文-保定师范专科学校学报2005(02)6.Wiuslow S G.Henkart P A Polyinosinlc acid as a carrier in the micrescale purifcation of total RNA 1991 7.Bustin S A.Nolan T Pitfalls of quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction 2004(03)8.May J.Costa M.Ojeda S R Deve

18、lopmental expression of the genes encoding transforming growth factor alpha and its receptor in the by pothalamus of female rhesus macaques 1994(01)9.陈昕.王保莉.曲东小麦硫转运蛋白基因半定量 RT-PCR 检测方法的建立期刊论文-西北植物学报2006(02)10.石艳丽.郭学平.王凤山半定量RT-PCR 法测定链球菌透明质酸合成酶mRNA的水平 期刊论文-食品与药品2005(02)11.卢建雄.臧荣鑫.潘和平半定量RT-PCR 法检测原代培养脂

19、肪细胞生脂基因mRNA 转录表达 期刊论文-中兽医医药杂志 2005(06)12.Kim S W.Harney J W.Larsen P R Studies of the hormonal regulation of type 25-iodothyronine deiodinase messenger ribonucleic acid in pituitary tumor cells using semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction 1998(12)13.徐春兰.汪以真半定量 RT-PCR 法分析猪肌肉

20、组织细胞谷胱甘肽过氧化物酶 mRNA 表达水平 期刊论文-中国兽药杂志 2005(08)14.蔡马研究基因转录的RT-PCR技术 期刊论文-生物学杂志2002(06)15.Pallansch L.Beswick H.Talian J Use of an RNA folding algorithm to choose regions for amplification by the polymerase chain reaction 1990(01)16.Mathias C.Martine B.Anne V C A semi-quantitative RT-PCR method to readi

21、ly compare expression levels within Botrytis cinerea multigenic families in vitro and in planta 2003(01)17.Rolland V G Semi-quantitative analysis of gene expression in cultured chondrocytes by RT-PCR 2004(01)18.Kuddus R H.Lee T H.Valdivea L A A semi-quantitative PCR technique for detecting chimerism

22、 in hamster-to-rat bone marrow xenotransplantation 2004(01)19.Fellenr M D.Durand K.Correa M A semi quantitative PCR method(SQ-PCR)to measure Epstein-Barr virus(EBV)load:its application in transplant patients 1997(01)20.周林福.陈离伟.姜云水荧光定量 PCR 与半定量PCR 检测 HBV DNA 的对比分析 期刊论文-中国病理生理杂志2005(05)21.Gao Yuan.Suo

23、 Guangli.Han Jin Expression of human BMP-2 Gene in different tissues of tobacco plants期刊论文-Acta Genetica Sinica 2006(01)22.张鸿平.吴秉铨.张卫国半定量PCR 方法的建立及其在病理学中应用1994(05)引证文献(2 条)1.劳荃蘅.黄锡霞.田可川.徐新明.贺三刚.张廷虎.吴伟伟.刘祯用半定量RT-PCR 法检测 BB4 基因在绵羊皮肤组织中的 mRNA 表达 期刊论文-新疆农业科学2009(2)2.杨红兰.张道远.马瑞.刘燕齿肋赤藓中半定量 RT-PCR 方法的探讨 期刊

24、论文-生物技术2010(2)高等生物基因表达的变化是调控细胞生命活动 的核心 机 制，正是 由于基 因的差异 表 达 才 决 定了生物 体 的所有 生 命 过 程。因此，究 不 同类型细研 胞 或 同一类 细 胞 在 不 同发育 时 期 或 不 同 发 育 状 态下 基 因表 达 的变化，已成为 当今生 物 学 的 研 究 热点 之 一 。半 定 量 逆 转录 多 聚 合 酶 链 式 反 应（，列 无 关 的管家 基 因，如 肌 动 蛋 白（和一 ）甘 油 一 一 酸 脱 氢 酶（等，为 这 些 基 因磷 ）因的转录 比较稳 定，量 相 对 丰 富。将 逆转 录含 为 后，使靶基 因和“管家基

25、 因”同管或异在 管 中一起 扩增，对 扩 增 产 物 进 行分 析时，在 首先根据 各样本间“家基因”增条带密度是否一致，管扩粗 略地判 断 各样本 抽 提 的 效 率、质 量 和 扩 增 效 率是 否 一 致，后以“家 基 因”扩增产 物 条 带 的 密然 管 度 作 为标准，计算 出 靶 基 因扩 增 条 带 密 度 与 其 之比值，并通过 观 察 各样本 扩 增 产 物 的 比值，出靶得 基 因 的表 达 量 的相对 变 化。反应 参 数 的质量 技 术是近年来发展起 来的探讨基因 转 录水平）的有效手段【与传统的 法 比较，。它具 有灵敏、简捷、特异性高等优点，因此在检测基因的表 达

26、水 平 上 得 到 了 广 泛 的 应 用。原半定量 技术 的 核心 即 ，是 世纪 代 末 出现的一种 相 对 定 量 的技术。年当人们欲利用该 技术研究并 揭示某一基因 的表达产物量的改变 时，利 用 相 同 量 的 进行 反 转 录后，再 扩增，然 后将 扩 增 产 物 进 行 电泳判 断 量 的差 异。为 避 免 样 本 间模板 质 量和 扩 增 效 率 的差异 而导 致 最 终 结 果 的差异，反应 体 系 中 引人 了在 内对照 系统。在 一 般 情 况 下 大 多 选 用 与靶基 因 序在运用 半 定 量 方 法 检 测 特 异 基 因 表 达量 的差 异 时，的 质 量 至 关

27、 重 要，总 只有在总 未被降解的情况下，才能保证其 中 的完整 性，从而 真 实 反 映 起 始 模 板 中基因 表达 量的差异【。因此，个 样品 须 检 查 其 完 整 性引 每 和 纯度，可 以通过 琼 脂 糖 或 甲醛变 性 电 泳 分 析 证明 总 的完整 性，般 在 电泳图 上 会 出 现 两 条 一 收 稿 日期：修 订 日期：作 者 简介：金凤媚（，一）女 天津人，理研究员，要从事番茄分子育种研究。助 主第 期金凤媚等：半定量 技术 的研究及应 用带 和，且 的亮度 应 是 的两 倍【。基 因表达 的 实 际 情况【。浓 度 对 扩 增 效 率 的 影 响半定量 检测体 系必须

28、防止混在 中 的基因组 带来 的假阳性，以 在 抽 提 后 一 定 所 要用酶消解残存在样品中的 。逆 转 录（）是 影 响 酶扩 增 效 率 的 重 要 因素，浓度范围在但扩增效率视序列而定。，徐 春 兰 等【的研 究 表 明 细 胞 谷 胱 甘 肽过 氧 对化物 酶 基 因扩增 的 影 响 较 大，度 在 浓 逆 转 录酶 或 能 有 效 地 逆 转 录，合成 模 板 ，加 （酶 抑 制 剂）可获 得 最 高 产 量。实验证明，合成 后 残，留 的 完 整 模 板 干 扰 ，因 为 它 与 竞 争 作 为 模板【，而 和 时，增效率不理想，带较淡，一步应用分扩 条 进析软 件 对 电 泳

29、条 带 值 进 行 分 析 时 发 现，在 时扩 增 效 率 及 特 异 性 良好。而 对 于 小麦 硫 蛋 白基因 的检测 结 果，能同 时稳定 扩 增 目的基 因和 内 参 的 浓 度 分 别 为 和。反转 录酶的内在 活性足以降解残存 的大多数 模板。但使用缺乏 活性的反转录酶时，必 须 用 处 理 则 。在 逆 转 录 过 程 中另一 个 需 要 考 虑 的情况 是 低拷 贝 的 反 转 录 效 率 要 低 于 高 拷 贝 。尤 引 物 的影 响引物 间 的竞争 利 用 技术 对 进 行 检 测 时一般 要 在 同一管 中 对 内参照 和 目的基因进行 扩 增。要在 同一管 中有效 扩

30、 增出 内参照 和目的基因产物，在 凝 胶 电泳上 清晰显现，时 消并 同 除 引物对 间 可 能 的竞争，设 计 引物时，在 除满足 引物 设 计 的基本 要 求 外，还应 考 虑 引 物 扩 增 的 预 期其 是 在反 转 录 过 程 中存在 大 量 非特 异 和 背 景 时，种 情 况 更为 明显，此 反 转 录 过 程 中 这 因 的线性问题应该认真考虑。解决该问题的方 法是每 个 反应 进 行 重 复，看每 次 重 复 的 变 化 程度，如果 每 次重复 的结果 变 化很大，明 可 能发生说了不稳 定 随 机 现 象【。模板 量 和 反 应 循 环 数 退火温度，特异基因和内参照引物

31、的预期退火温度尽量相符；引物序列进行比对时，二者应无同源性；物长度应有一定差异，产 以免电泳时 重 叠。如果 目的基因与内参 基 因的扩增动 态 曲线表 明，二者处于线性期的循环次数相差过大，却 直接同管扩增，两 者的产物量受到竞争，增效率降低，则 扩这时可选用同批异管扩增，并在不同循环次数下分 别 取 出二产 物【。设 计相对定量 实验方案 时必须注意 预先确 定 最 佳 模 板量和 反应 的循环 数。扩增 反 应 是 酶 促 反 应，循 酶 促 反 应 定 律，始 的遵 开 循 环内扩增 产 物 呈 指 数 累 积，物 与 模 板 呈 线 性产 关 系。半 定 量 技术【是 利 用 产 物

32、 与 模。正 板 量 的 这 一 线 性 关 系，通 过 扩 增 产物 来 对 比 总中 目的基因 的 表 达。但经 过 一 定 的循 环 后，产物 不 再 呈 指 数 累 积 而 进 入 平 台期，因此，为避免 平 台 效 应 的影响，适 的循环 数 是 半合 定 量 方 法 的关 键 因素之 一。循 环 次 数 因扩增 目的条 带 不 同 而 不 同，昕 等【建立 小 麦 硫 蛋白 基陈 在 因半定量 检测 方 法 时，目的基 因和内 参的循环次数分别为 和次。石艳丽等 人在 引物的设计在选择 引物时，尽量使上 游 和 下 游引 物 跨 越 不 同外显 子，这样 能 把 从 得到 的 扩

33、增 产 物和 从 任 何 污 染 的 包 含 内含子序 列 的基因组 得 到 的产物 区分开（。最 图）佳 的序列引物是完 全精确与 模板互补，在 序列中，位模板引物的重要理由是：）定（它 确 定 产物 长 度，选 择 扩 增 应 产物 的模板 引 物位 点，因 为 小 于 的扩 增 产物，要 高 分 辨 率 的 特 殊 琼脂 糖 凝 胶 区分，且 引需 并 物 和 引 物假象 可 导 致 模 糊 不 清；大于的产 物，受 酶 作 用 性 能 的 限制，难 以 有 效 扩 增，如用此方 法测定链球 菌透明 质酸合 酶 的水平时，实验结果目的基因和内参的循环次数分别为 和 次。卢 建 雄 等【在

34、检 测 生 脂 基因时则 均确定为 次。【在研究垂体瘤细胞时循环 次数为次。在 逆转 录之前，的定量 也 是 实 验的 关总 聚合酶，延伸长链则完全无效，而且易于脱离模板【。外，此】引物序列与其它转录基因完全同源 时，产 生 更 多 的 伪 假 产物。计算 机 软会 件 程序和实践经验很便利于引物设计，也必但 须 多次试验，才能确定最适引物。键步骤，用等量的 作为起始模板，而保证 从 随后的 扩增 条 带 亮 度 的 差 异，够 真 实 反 映能 天 津农业科学第卷中 的表达 量 的差异，结果 表 明 茎 和 根 的表 达 要 高 卜 口 一一于 叶 片 组 织，这 使 人 们 能 有 目的的

35、以 烟 草 为 生物反 应 器 为 人 类 服 务。张鸿来等 半 定 量 方用 法 检 测 乳 腺 癌 细 胞 一 的应 用 获 厂 产物 基 因组产物 卜 皿,电池日图 区别内含子的 得成功，其简便、快速的特点更适合于临床应用。综上所述，我们可以看出半定量 是一种 粗略 地 估计 基 因 表达 的 相对变 化 的方法，若 要 精 确 地 计 算 基 因 的 表 达 量 还 需 利 用 实 时 荧光其它 因素的 影 响 除 了对上 述 所 提 到 的几种 关键因 素 进行 选 择外，还 要 相 应 的 调 整 酶浓 度 等 其 它 的、等 技术，但多数研究的焦点并不是检测转录 水 平 微 小

36、的变化 或 确切 的分子 数 目，而 是 检 测 其表 达 水 平 变 化 是 否显著。以，定 量 分析 所 半 些参数来提高反应的特异性及灵敏度，最 大限度 的提高方法本身的可靠性。一 水平的方法在各个研究领域都有着非常广泛的应用，着该 技 术 的 日趋成 熟 和 完 善，将 成 为研究随 它 者 的强有 力 的研究手 段。技 术 的 应 用参考 文献：对动 物和植物 基 因表达 变 化 的 分 析【】刘 中成，锦，赵 刘孟军 差异显示 技 术评述 子 植物分育种，）（：在动植 物 表 达 分 析 中，常 常 用 到 的是实 时 定量、基因芯片 等 半 定 量 技 术，、但这些方 法 费 时

37、 费 力，需 要 特 殊 的 仪 器，半 定 量且 而 技术 操 作 相 对 简 便，近 年 来 被 广 泛 地 应用 于 此类研 究 中。【】，：，【，（），：【】，：，（）陈 昕 等（）研 究 小麦 硫 转 运 蛋 白基因在【仁 勇，林丁剑 冰，温浩，半 定量 等 检测细胞因子表达的研究 疆医科 大学学报，（：新，）的表达时建立了半定量 方法。徐春兰和汪 以真（用 半 定 量 ）法评 定 了 不 同生长 阶 段 猪 抗 菌 肽 一基因 表 达 差 异，果 显 示，结不 同生长 阶段猪 一 基因 表 达 有 差 异，从 出生到 断奶 前 表达 量 呈 增 加 趋 势，断 奶 时 表 达卜量

38、下 降，断奶后 随日龄增 加 一表 达 量 再 逐 渐增 加。因此，在 断奶期 通 过 添 加某 些 养 分，促 进一基 因 的表达，对 于 提 高 仔 猪 的 抗 病 能 力 具【】谷守芹，解灵君，范永山 物组织 总 提取 的常用方法及植 优 化 策略 定量和半定量 PCR 技术及其临床意义北 京 医 科 大 学 学 报 J OURNAL OF BEIJ IN G M EDICAL UN IV ERSIT Y Vol.31 .5 .1999 No Oct?469?定量和 半定量 PCR 技术及其临床意义张捷(北京医科大学第三医院检验科,北京 100083)1 半定量 和定量 PCR 及定量核

39、酸的方法 1.1 内对照法床需要,则不必一律采用 PCR 技术。对于目前还没有其它诊断 技术可以检测的疾病 (如基因 缺失、易位、),需要培养时间较长或培养难度大的病原突变 体的检测 ,则可考虑应用 PCR 方法。(HIV2Ab)的检测结果难以判断时 ,可用 PCR 技术作为确认将已知的目的 DNA 及内对照 DNA 混合,加入两对引物同时进行 PCR 扩增,最后将 PCR 产物转膜 ,用特异性探针杂交,目的 DNA 扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较即可确定 1 。1.2 PCR 杂交法(PCR2Hyb 法)1.3 分枝 DNA 法(b2DNA 法 1.5 连续荧光检测 PCR

40、 产物 手段。合成的引物5 端连有生物素 ,所带有生物素的 PCR 产 期诊断和治疗监测的临床价值,已被国内外医学界所公认。物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合。另一端与酶标板上包被的特异性探针杂交。然后加入底物显色 ,呈色 的程度与 PCR 产物浓度呈正比。2 交检测试剂盒 ,也批准了 HPV 的过筛检测 ,对于 HPV 各型 的检测 ,目前尚未批准。M TB 的靶序列是 16 SDNA 的 584 bp,其最后带有杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒是 1993)两种特异性探针与待测的 RNA 杂交,其中一种探针的年通过 FDA 批准,目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法进行检测。但在美国

41、通过CAP 检查的某些教学医院实验室也可适量检测其它项目。另一端与酶标板上的探针杂交。另一种探针的另一端与分枝 DNA 杂交,分枝 DNA 的另一端再与放入的酶标记的探针杂交。最后放入化学发光底物 ,底物在酶的作用下 ,产生光 的强度与待测 DNA 或 RNA 浓度成正比。此方法有放大和定量的作用。1.4 PCR2 杂交定量的荧光检测人体内存在 ,称条件致病病原体 ,所以检测这些病毒、支原 体、细菌最好用定量 PCR,复制数量要达到一定程度才考虑 标本进行细菌培养结果和 DNA 结果不一致尚难以解释时,NA 的检测结果呈阳性 ,应考虑体内的细菌在致病 4 。有临床意义。据国外文献报道 ,在严格

42、的实验条件下 ,一些 PCR 产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后,首先 给第一个荧光团激发光 ,使它的发射光去激发第二个荧光团,荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算 PCR 产物。此方法的特异性很高。在进行 PCR 扩增的同时 ,荧光染料SYBPR Green 结合 1 刘陶文 .定量PCR 技术.国外医学临床生物化学与检验学分册,1998,19:(1)15 到双链DNA 产物上 ,在一定温度下 ,连续监测荧光发射的最高峰,则可计算出 PCR 产物的量。1.6 5 核酸酶分析 (荧光定量 PCR)探针的 5 端标有荧光团,3 端标有淬灭团。荧光团与淬灭团在一定距离内 ,淬灭团控制荧

43、光团的发光。此探针杂交在待测的 DNA 上,然后放引物进行 PCR 扩增,当引物延伸 到探针的5,切断探针5 端 端的荧光团 ,淬灭团失去控制荧光团的作用 ,则荧光团发出荧光。连续检测荧光的强度与待测的 DNA 浓度呈正比。2 PCR 技术 检测病原微生物的临床意义如果原有检测 技术 的灵敏度和特异性基本上已达到临 2 Gilliiand G,Perrin S,Blanchard K,et al.Analysis of cytokine mR2 NA and DNA:Detection and quantitation by competitive polymerase 3 Storch GA

44、,Ballei RS,Bailey TC,et al,Comparison of PCR and 4 Rayner M G,Zhang y,Gorry MC.Evidence of bacterial metabolic activity in culture2negative otitis media wit h effusion.J AMA,1998,279(4):296 chain reaction1 Proc Natl Acad Sci USA,1998,87:272522729 recipients1 J Clin Microbiol,1994,32(4):99721003 tion

45、 of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant PP65 antigenemia assay wit h quantitative shell viral culture for detec2 但对有临床症状病人的标本某些细菌培养结果是阴性,mR2 参 考文 献(本文编辑 :景霞 周传敬)(1998210212 收稿)如人类免疫缺陷病毒 (HIV)的抗原 (HIV2Ag)或抗体 用 PCR 和杂交方法对丙型肝炎(HCV)的基因分型、早 美国 FDA 已批准 HIV、TB、M 沙眼衣原体的 PCR 或杂(某些病毒、如 CMV 3 、EBV 等)支原体、细菌可在普通