抑制pkcβ 2fp66shc信号通路对肠缺血再灌注多器官损伤保护作用.pdf

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1、独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：邀签字日期：2 坐年二月三二E t关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关

2、数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“4”)：1 保密口，在一年解密后适用本授权书。2 不保密口。作者签名：导师签名：3 萝越日期纱伴年9 月卯日日期：年月日目录一、摘要1(一)中文摘要1(二)英文摘要8二、正文1 5前言。1 5月I J 吾“。)动物、材料与主要仪器17(一)L Y 3 3 3 5 31 抑制P K C l 3 磷酸化对肠缺血再灌注远隔肝肺损伤的保护作用材料和方法2 11 实验动物2 12 实验分组2 13 小鼠肠缺血损伤再灌注损伤模型的建立2 14 检测指标2 14 1 组织病理学检测2 24 2 血清

3、丙氨酸氨基转移酶(A L T)、天冬氨酸氨基转移酶(A S T)、白细胞介素。6(I L 6)、T N F 0【检测2 34 3 肝肺组织H 2 0 2 含量测定2 34 4 肝肺组织还原型谷胱甘肽(G S H)、谷胱甘肽过氧化物酶(G S H P X)、髓过氧化物酶(M P O)活性测定2 34 5 肝肺组织丙二醛(M D A)检测2 44 6 肝肺组织脱氧核糖核酸转移酶原位末端标记(n 烈E L)凋亡检测2 44 7W e s t e mB l o t 检测肝和肺组织P K C 家族蛋白、p h o s p h o P K C I)I I、锰超氧化物歧化酶(M n S O D)、c l e

4、 a v e d c a s p a s e 一3 蛋白水平变化2 45 统计学处理2 5结果2 61 P K C l 3 I I 在小肠I 瓜后肝肺组织中激活2 62 L Y 3 3 3 5 3 1 抑制P K C l 3 I I 的膜转位及磷酸化2 73 组织病理学分析2 84 L Y 3 3 3 5 31 预处理改善血清A L T、A S T、T N F 0 c 和I L 6 水平及肝肺M P O 活性2 95 L Y 3 3 3 5 31 预处理改善肝肺组织G S H、G S H-P X 活性316 L Y 3 3 3 5 3 1 预处理改善肝肺组织H 2 0 2、M D A 水平31

5、7 L Y 3 3 3 5 31 预处理降低小肠I R 引起的肝肺组织的细胞凋亡3 28 L Y 3 3 3 5 31 预处理改善小肠I R 相关抗氧化因子和促凋亡因子的表达3 3讨 仑3 4结论3 6(二)抑制P K CJ 3 依赖的p 6 6 s h c 磷酸化保护肠缺血再灌注远隔器官损伤材料和方法3 81 实验材料381 1 实验用细胞株381 2 实验动物及分组3 82 实验方法3 82 1 细胞培养及H 2 0 2 损伤模型构建3 82 2W e s t e r nb l o t 检测肝肺组织磷酸化p 6 6 s h c、总p 6 6 s h c、磷酸化P K C p I I、总P

6、K C p I I、细胞色素C 蛋白水平变化3 92 3R N A 干扰及P M A 处理4 02 4 流式细胞仪测定L 0 2 和A 5 4 9 细胞凋亡4 02 5C a s p a s e 一3 活性检测4 12 6 免疫共沉淀法检测p 6 6 s h c 和细胞色素C 相互作用4 13 统计学处理4 2结果4 21 L Y 3 3 3 5 3 1 对小肠I 瓜后肝肺组织p 6 6 s h c 激活的影响4 22 R N A 干扰P K C D I I 表达对p 6 6 s h c 磷酸化的影响4 23 R N A i 对p 6 6 s h c 表达对c a s p a s e 3 活性

7、及细胞凋亡的影响4 34 L Y 3 3 3 5 3 1 预处理对p 6 6 s h c 的线粒体转位的影响4 45 L Y 3 3 3 5 31 预处理对p 6 6 s h c 与细胞色素C 的结合的影响4 56 L Y 3 3 3 5 3 1 预处理对细胞色素C 释放的影响4 5讨 仑4 6结论4 8(三)原儿茶酸调控p 6 6 s h c 磷酸化对小肠缺血再灌注多器官损伤的保护作用材料和方法5 01 实验动物5 02 实验方法5 02 1 实验分组及小鼠小肠I R 模型的建立5 02 2 小肠和肝组织病理学检测5 02 3 血清指标检测5 02 4 小肠和肝组织还原型谷胱甘肽(G S H

8、)、谷胱甘肽过氧化物酶(G S H P X)活性测定5 12 5W e s t e r nb l o t 测定小肠和肝脏组织中p 6 6 s h c、N F-v B、F o x 0 3 a、M n S O D、c l e a v e d c a s p a s e 一3、B c l x L 蛋白表达水平512 6 反转录-聚合酶链式反应(r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n，R T P C R)测定p 6 6 s h cm R N A 水平5 13 统计学处理5 2结果

9、511 组织病理学检测5 22 血清A L T 和A S T 水平检测5 43 血清I L 6 和T N F 0【水平检测5 44 小肠和肝脏组织N F K Bp 6 5 蛋白表达水平检测5 55 小肠和肝脏G S H 和G S H P X 酶活力检测5 56 小肠和肝脏p 6 6 s h c 表达水平的检测5 67 小肠和肝脏氧化应激及细胞凋亡相关因子表达水平检测5 7讨 念5 8结论6 0参考文献6 1三、综述6 7(一)综述6 7(二)参考文献7 5四、附录8 5五、攻读学位期间发表文章情况8 6六、致谢8 7大连医科大学博士学位论文抑制P K C p p 6 6 s h c 信号通路对

10、肠缺血再灌注多器官损伤的保护作用博士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：马灵斐田晓峰教授姚继红教授外科学摘要小肠缺血再灌注(i s c h e m i ar e p e r f u s i o n，I R)是一种临床上常见的伴随着危重病症的病理生理过程，可以引起小肠屏障功能受损、肠内细菌移位和全身炎症介质激活等一系列级联反应，最终导致全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭综合征，具有较高的发病率和死亡率。在发生损伤的多种器官中，肝脏由于直接收集肠道回流的血液，在其他器官损伤之前即可发生急性肝损伤；肺脏由于急性肺损伤(a c u t el u n gi n j u r y，A L l)常进展为凶险

11、的急性呼吸窘迫综合征(a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e，A R D S)，死亡率较高。小肠1 爪引发多器官损伤的发病机制复杂，新近研究发现，小肠1 爪引起的活性氧自由基(r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s，R O S)释放以及细胞凋亡的诱导是引起多器官损伤的重要原因，此过程受体内复杂而精密的信号传导网络调控，具体机制不明。又有研究指出，蛋白激酶C(p r o t e i nk i n a s eC，P K C)p 依赖的衔接蛋白p 6 6 s h c(p 6 6

12、s h c)的磷酸化参与R O S 的生成和细胞凋亡的诱导过程。P K C 家族包括一组多功能的蛋白激酶，它们通过磷酸化修饰，在细胞应激反应的信号转导中发挥重要作用。研究表明，在机体受到I R 损伤后，P K C 蛋白可以由胞浆转位至胞膜，并发生磷酸化激活，进而调控体内的氧化应激及细胞凋亡信号。P 6 6 s h c 是S h c A 蛋白家族的成员，其他成员包括p 4 6 s h c 和p 5 2 s h c。内源或外源性的应激反应可以导致p 6 6 s h c 在丝氨酸3 6 的位点发生磷酸化，进而导致细胞氧化应激和细胞凋亡。我们作出如下假设：抑制P K C l 3 可以进一步抑制p 6

13、6 s h c 介导的氧化应激和细胞凋亡，进而保护由小肠I R 引起的多器官损伤。首先，为证明P K C l 3 在小肠I R大连医科大学博士学位论文引起的远隔肝肺损伤中的作用，我们构建了小鼠小肠I 瓜模型，并使用P K C 3 特异性抑制剂L Y 3 3 3 5 3 1 抑制小鼠体内P K C p 的激活。再灌注结束后，收集血清和组织进行后续实验分析。实验结果发现，小肠I R 对肝肺造成严重损伤，包括组织病理学改变，炎性细胞浸润，氧化应激损伤和细胞凋亡等。应用P K C t 3 抑制剂L Y 3 3 3 5 3 1后，以上损伤均得到不同程度的减轻，表现为减轻组织学损伤，减少炎性介质释放，减轻

14、肝肺组织的氧化应激和细胞凋亡。其次，为证明L Y 3 3 3 5 3l 可以抑制P K C l 3 的激活，进而抑制p 6 6 s h c 的磷酸化来减轻小肠I R 后A L l 和急性肝损伤，我们进一步在体内外检测了P K C l 3 和p 6 6 s h c之间的关系、p 6 6 s h c 在细胞凋亡中的作用及L Y 3 3 3 5 3 1 能否通过减少p 6 6 s h c 的激活在小肠I R 后的远隔肝肺损伤中发挥保护作用。数据表明，小肠I R 引起p 6 6 s h c在肝肺组织中显著激活，若体内抑制P K C l 3 I I 或体外P K C l 3 I I R N A 干扰均可

15、抑制p 6 6 s h c 的诱导激活，并进一步减少p 6 6 s h c 的线粒体转位及其与细胞色素C 的结合，减少细胞色素C 和H 2 0 2 的释放，增加了G S H 和G S H P X 的活性。以上数据表明P K C l 3 抑制剂对肠缺血再灌注引起的远隔脏器损伤的保护作用可能和P K C l 3 I I-p 6 6 s h c-细胞色素C 轴相关，而应用P K C 3 抑制剂来预防小鼠肠缺血再灌注引起的远隔肝肺损伤是可靠而有效的。最后，为证明天然植物中存在的抗氧化活性成分在小肠I R 引起的多器官损伤中是否发挥保护作用，以及保护作用与p 6 6 s h c 通路的关系。我们使用原儿

16、茶酸(p r o t o c a t e c h u i ca c i d，P C A)进行预处理，检测小鼠小肠I R 后肠道及肝脏损伤及p 6 6 s h c 通路相关蛋白的表达。研究发现，P C A 预处理可显著减轻小肠I R 引起的小肠原位器官损伤和急性肝损伤，表现为改善组织学损伤、肝功能和全身炎症，减轻p 6 6 s h c 相关的氧化应激和细胞凋亡。综上所述，P K C I B 依赖的p 6 6 s h c 激活在小肠I R 引起的多器官损伤中发挥重要作用，特异性抑制P K C 3 可减轻p 6 6 s h c 介导的多器官损伤。另外多酚化合物P C A可抑制p 6 6 s h c

17、的激活，在小肠I R 致多器官损伤中发挥保护作用。本研究为小肠I R 损伤所致的多器官损伤提供了新的作用靶点，同时也为开发多酚化合物P C A以预防小肠I 瓜致多器官损伤的提供了有利的依据。大连医科大学博士学位论文第一部分L Y 3 3 35 31 抑制P K C O 磷酸化对肠缺血再灌注远隔肝肺损伤的保护作用目的：探讨P K C 家族在肠缺血再灌注肝肺损伤中的变化及特异性抑制P K C D磷酸化在此病理生理过程中所发挥的保护作用。方法：健康成年雄性I C R 小鼠4 0 只，随机分为4 组：假手术组(S h a m 组)、模型组(I R 组)、假手术给药组(S h a m+L Y 3 3 3

18、 5 3 1)、模型给药组(I R+L Y 3 3 3 5 3 1)。各I R 组行肠系膜上动脉夹闭4 5 分钟，再灌注4 5 分钟、9 0 分钟或1 8 0 分钟以构建小肠I R 模型；各S h a m 组行假手术处理。假手术给药组及模型给药组于术前3天连续灌胃给1 0m g 尔g 的L Y 3 3 3 5 3 1，每天1 次。观察小肠、肝脏、肺脏组织病理学变化，检测血清中丙氨酸氨基转氨酶(a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e，A L T)、天冬氨酸氨基转氨酶(a s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e

19、 r a s e，A S T)、肿瘤坏死因子伐(t u m o rn e c r o s i sf a n t o r-a，下N F 0【)及白细胞介素6(i n t e r l e u k i n 6，I L 6)水平。检测肝、肺组织匀浆H 2 0 2、谷胱甘肽(g l u t a t h i o n e，G S H)、谷胱甘肽过氧化物酶(g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e，G S H-P X)、丙二醛(m a l o n d i a l d e h y d e，M D A)、髓过氧化物酶(m y e l o p e r o x i d a s

20、e，M P O)水平。采用脱氧核糖核酸转移酶原位末端标记技术(T d T m e d i a t e dd U T PN i c k E n dL a b e l i n g，n J N E L)检测肝、肺组织细胞凋亡情况。采用W e s t e r nB l o t法检测肝、肺组织P K C l 3 I、P K C l 3 I I、P K C?、P K C 8、P K C a、p h o s p h o P K C I j I I、锰超氧化物歧化酶(m a n g a n e s es u p e r o x i d ed i s m u t a s e，M n S O D)、c l e a

21、 v e d c a s p a s e-3 蛋白表达水平。结果：1 与S h a m 组相比，I R 组：肝和肺组织P K C I I 膜蛋白及磷酸化P K C 3 I I 蛋白表达水平明显升高，而其他P K C 家族膜蛋白表达无明显变化：小肠组织病理示小肠绒毛排列明显紊乱，固有层崩解并形成明显溃疡，肝组织病理示肝索排列紊乱肝细胞核固缩，伴有胞浆嗜伊红细胞增多，肺组织病理示大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚并伴有肺泡出血；血清T N F 0【、I L 6、A L T、A S T 水平显著升高：肝、肺大连医科大学博士学位论文组织H 2 0 2、M D A 和M P O 水平显著增高，G S H 和G

22、 S H P X 水平降低；肝和肺组织T U N E L 凋亡检测显示凋亡细胞显著增多；肝和肺组织M n S O D 蛋白表达水平明显降低，c l e a v e d c a s p a s e 3 表达水平显著升高；S h a m+L Y 3 3 3 5 3 l 组未见显著变化。2、与I R 组相比，I R+L Y 3 3 3 5 3l 组：肝和肺组织P K C 3 I I 膜蛋白及磷酸化P K C l 3 I I 蛋白表达水平明显降低：小肠、肝脏和肺脏组织病理示损伤均有所减轻：血清T N F c【、I L 6、A L T、A S T 水平明显下降；肝、肺组织H 2 0 2、M D A 和M

23、 P O水平显著降低，G S H 和G S H P X 水平升高，肝肺组织T U N E L 凋亡检测显示凋亡细胞显著减少；肝和肺组织M n S O D 蛋白水平表达明显升高，c l e a v e d c a s p a s e 3 蛋白表达水平明显降低。结论：1 小肠I R 可引起肝、肺组织中P K C 3 I I 的激活。2 利用L Y 3 3 3 5 31 特异性抑制P K C 3 I I 的激活可对小肠I 爪致远隔肝肺损伤有保护作用，可以有效减少肠肝肺组织学损伤、肝脏和肺脏的氧化应激和细胞凋亡。第二部分抑制P K C l 3 依赖的p 6 6 s h c 磷酸化保护肠缺血再灌注远隔器

24、官损伤目的：探讨P K C l 3 依赖的p 6 6 s h c 磷酸化在小肠I R 远隔器官损伤中的作用，阐明L Y 3 3 3 5 31 预处理能否通过调控P K C p p 6 6 s h c 通路在肠l R 致肝肺损伤中发挥保护作用。方法：体内实验分组及模型构建如第一部分所述，采用免疫共沉淀及W e s t e r nB l o t 法检测肝、肺组织中p 6 6 s h c、磷酸化p 6 6 s h c、P K Q 3、磷酸化P K C l 3、细胞色素C 的蛋白表达。体外实验分为两部分：1 人肝L 0 2 细胞和肺A 5 4 9 细胞，分为以下4 组：对照组(C o n t r o

25、l 组)、模型组(P M A 组)、模型+干扰P K C 3 组(P M A+s i P K C 3 组)、模型+L Y 3 3 3 5 31 组(P M A+L Y 3 3 3 5 31 组)。采用W e s t e r nB l o t 法检测p 6 6 s h c、磷大连医科大学博士学位论文酸化p 6 6 s h c、P K C 3、磷酸化P K C p 蛋白表达水平变化。2 人肝L 0 2 细胞和肺A 5 4 9 细胞，分为以下4 组：对照组(C o n t r o l 组)、干扰p 6 6 s h c 组(s i p 6 6 s h c 组)、模型组(H 2 0 2 组)、模型+干扰

26、p 6 6 s h c 组(H 2 0 2+s i p 6 6 s h c组)。采用c a s p a s e 3 活性试剂盒检测c a s p a s e 3 活性、流式细胞术检测细胞凋亡。结果：1 体内实验：与s h a m 组相比，I R 组肝肺组织中p 6 6 s h c 磷酸化显著增高，且呈再灌注时间依赖性；肝肺组织线粒体蛋白中p 6 6 s h c 含量显著增高；肝肺组织中p 6 6 s h c 和细胞色素C 结合增多；肝肺组织中线粒体释放细胞色素C 增多。2 体内试验：与I 爪组相比，I 爪+L Y 3 3 3 5 3 1 组肝肺组织中p 6 6 s h c 磷酸化显著降低；肝肺

27、组织线粒体蛋白中p 6 6 s h c 含量显著降低：肝肺组织中p 6 6 s h c 和细胞色素C 结合减少；肝肺组织中线粒体释放细胞色素C 减少。3 体外实验第一部分：与C o n t r o l 组相比，P M A 组p 6 6 s h c 磷酸化显著增高，而P M A+s i P K C l 3 组和P M A+L Y 3 3 3 5 31 组磷酸化p 6 6 s h c 较P M A 组显著降低。4 体外实验第二部分：与C o n t r o l 组相比，H 2 0 2 组c a s p a s e 3 活性显著增强，凋亡细胞比例增高，而H 2 0 2+s i p 6 6 s h c

28、 组c a s p a s e 3 活性和细胞凋亡比例较H 2 0 2组显著降低。结论：1 小肠1 爪组引起肝肺组织p 6 6 s h c 发生磷酸化，使p 6 6 s h c 发生线粒体转位，增强其与细胞色素C 的结合，并促进细胞色素C 的释放。2 L Y 3 3 3 5 31 可以抑制p 6 6 s h c 蛋白的磷酸化，进而抑制其线粒体转位、与细胞色素C 的结合及诱导细胞色素C 释放，对肠I R 后的肝肺损伤发挥保护作用。3 P 6 6 s h c 的磷酸化依赖于P K C 3 的激活。第三部分原儿茶酸调控p 6 6 s h c 磷酸化对小肠缺血再灌注多器官损伤的保护作用目的：探讨多酚化

29、合物P C A 调控p 6 6 s h c 磷酸化信号通路在小肠l 瓜损伤和继大连医科大学博士学位论文发性肝损伤中的作用。方法：健康成年雄性I C R 小鼠5 0 只随机分为以下5 组，每组1 0 只：(1)假手术组(S h a m 组)；(2)模型组(1 R 组)；(3)假手术+P C A 组(S h a m+P C A8 0m g k gg r o u p)；(4)模型+P C A 低剂量组(I R+P C A4 0m g k gg r o u p)；(5)模型+P C A 高剂量组(I R+P C A8 0m g k gg r o u p)。各模型组采用M e g i s o n 法构建

30、小肠I R 模型，行肠系膜上动脉夹闭4 5m i n，再灌注9 0m i n；各P C A 处理组于模型建立前3 天给予P C A 相应剂量腹腔注射，每天一次。再灌注结束后，收集血清标本以检测T N F 扒I L 6、A L T 和A S T 水平，收集小肠和肝脏组织标本进行病理组织学评分和G S H、G S H P X 水平检测；利用R T-P C R 法检测组织中p 6 6 s h cm R N A表达水平：利用W e s t e r n b l o t 方法检测组织中p 6 6 s h c、磷酸化p 6 6 s h c、核因子r Bp 6 5(N F r d 3p 6 5)、F o x

31、0 3 a、磷酸化F o x 0 3 a、M n S O D、c l e a v e d c a s p a s e 3 和B c l x L 的蛋白表达水平。结果：1 与S h a m 组相比，I R 组：小肠组织病理示肠绒毛排列紊乱，部分区域肠绒毛脱落，上皮下间隙增宽，毛细血管淤血；肝脏组织病理示肝索排列紊乱，可见大量炎性细胞浸润，汇管区和肝血窦淤血现象严重，出现大量核固缩，核溶解；血清T N F 0 1、I L 6、A L T、A S T 水平显著升高；N F r,Bp 6 5 蛋白表达水平显著增加；G S H 含量和G S H P X 酶活力显著下降；小肠和肝脏组织p 6 6 s h

32、cm R N A 水平和磷酸化水平显著增加：F o x 0 3 a 磷酸化表达水平明显增加；M n S O D 水平显著下降；c l e a v e d c a s p a s e 3 表达水平上调，B c i x L 的表达下调。S h a m+P C A 组未见显著变化。2 与I 瓜组相比，I R+P C A(4 0m g k g，8 0m g k g)组：小肠组织病理示肠绒毛排列整齐，上皮与固有层轻度分离，损伤程度明显减轻：肝脏组织病理示肝细胞排列相对规则，炎性细胞浸润程度减轻，肝细胞分叶核形态正常，核固缩及核溶解现象减轻。血清T N F Q、I L 6、A L T、A S T 水平显著

33、降低：N F r,Bp 6 5 蛋白表达水平显著下降；G S H 含量和G S H P X 酶活力显著增加：小肠和肝脏组织p 6 6 s h cm R N A 水平和磷酸化显著降低；F o x 0 3 a 磷酸化表达水平明显降低：M n S O D 水平显著增加：c l e a v e d c a s p a s e 3 表达降低，B c l x L 的表达升高。结论：1 P C A 对小肠I R 损伤和继发性肝脏损伤有保护作用。大连医科大学博士学位论文2 P C A 的保护作用与抑制p 6 6 s h c 的磷酸化及调控下游抗氧化和抗凋亡因子的表达相关。关键词：肠缺血再灌注多器官损伤蛋白激酶

34、C 1 3 衔接蛋白p 6 6 s h c 原儿茶酸大连医科大学博士学位论文S u p p r e s s i o no fP K C p p 6 6 s h cs i g n a l i n gp a t h w a ya t t e n u a t e sJm u l t i p l eo r g a nl n l u r yi n d u c e db yi n t e s t m a l1 S C h e m l ar e p e r t u s l o nl一，-。一D o c t o rd e g r e ec a n d i d a t e：L i n g f e iM aS u

35、 p e r v i s o r：P r o f e s s o rX i a o f e n g T i a nV i c e-s u p e r v i s o r：P r o f e s s o rJ i h o n gY a pM a jo r：G e n e r a ls u r g e r yA b s t r a c tI n t e s t i n a li s c h e m i a-r e p e r f u s i o n(I R)i sas e r i o u sc l i n i c a ld i l e m m aw i t hh i g h m o r b i d

36、 i t ya n dm o r t a l i t y I n t e s t i n a lI Ro f t e ni n d u c e dt h ei m p a i r e di n t e s t i n a lb a r r i e rf u n c t i o n，i n t e s t i n a lb a c t e r i a lt r a n s l o c a t i o na n da c t i v a t i o no fs y s t e m i ci n f l a m m a t o r ym e d i a t o r s，a n ds u c hac

37、a s c a d eo fr e a c t i o n sw i l lu l t i m a t e l yl e a dt os y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e(S I R S)a n dm u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m e(M O D S)R e m o t eo r g a nd a m a g e，e s p e c i a l l ya c u t el u n gi n j u r y(A L

38、 I)a n dl i v e ri n j u r ya r ec o m m o nc o m p l i c a t i o n st h a tc o n t r i b u t et ot h eh i g hm o r t a l i t yr a t e T o x i cr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s(R O S)i n d u c e db yi n t e s t i n a lI Ra n ds u b s e q u e n ta p o p t o s i sa r ek n o w nt op r o m o t er

39、 e m o t eo r g a nd a m a g e P r o t e i nk i n a s eCD(P K C 3)d e p e n d e n ta d a p t o rp r o t e i np 6 6 s h c(p 6 6 s h c)p h o s p h o r y l a t i o ni si n v o l v e di nt h eg e n e r a t i o no fR O Sa n di n d u c t i o no fa p o p t o s i s T h ep r o t e i nk i n a s eC(P K C)f a m

40、 i l yc o m p r i s e sag r o u po fm u l t i-f u n c t i o n a lp r o t e i nk i n a s e st h a t p l a y i m p o r t a n tr o l e sa ss i g n a lt r a n s d u c e r so fc e l l u l a rs t r e s sb yp h o s p h o r y l a t i o no ft h es e r i n ea n dt h r e o n i n er e s i d u e s A c t i v a t

41、i o no fP K C，i n d i c a t e db yt r a n s l o c a t i o no ft h ep r o t e i nf r o mt h ec y t o p l a s mt ot h em e m b r a n ew i t hs u b s e q u e n tp h o s p h o r y l a t i o n，o c c u r si nr e s p o n s et om a n yc o n d i t i o n s，s u c ha sI Ri n j u r ya n dh e m o r r h a g i cs h

42、 o c k，t or e g u l a t et h eo x i d a t i v es t r e s sa n da p o p t o s i ss i g n a lp a t h w a y 大连医科大学博士学位论文A d a p t o rp r o t e i np 6 6 s h c(p 6 6 s h c)i sam e m b e ro ft h eS h c Ap r o t e i nf a m i l y，a n di sc o m p r i s e do ft w oo t h e rp r o t e i n s，p 4 6 s h ca n dp 5

43、2 s h c P h o s p h o r y l a t i o no ft h et y r o s i n er e s i d u e so fp 4 6 s h ca n dp 5 2 s h cp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h e i ri n t e r a c t i o nw i t ht h ee p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r I nc o n t r a s tt op 4 6 s h ea n dp 5 2 s h c，p 6 6 s h

44、ch a sau n i q u eN t e r m i n a lp r o l i n e-r i c hd o m a i nw i t has e r i n ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e(s e r i n e3 6)E n d o g e n o u so re x o g e n o u ss t r e s s，s u c ha sf r e e r a d i c a l sa t t a c k，r e s u l t si ns e r i n e3 6p h o s p h o r y l a t i o no ft h

45、ep 6 6 s h c，c o n t r i b u t i n gt oc e llo x i d a t i v es t r e s sa n da p o p t o s i s T h u s，w eh y p o t h e s i z e dt h a tt h eP K C 3i n h i b i t o rL Y 3 3 3 5 31w o u l ds u p p r e s sp 6 6 s h c-m e d i a t e do x i d a t i v es t r e s sa n da p o p t o s i sa n dp r o t e c ta

46、 g a i n s tA L la n dl i v e ri n j u r yi n d u c e db yi n t e s t i n a lI R F i r s t，t op r o v et h er o l eo fP K C l 3i nr e m o t eo r g a n si n j u r yi n d u c e db yi n t e s t i n a lI R，w ec o n s t r u c t e dam u r i n ei n t e s t i n a lI Rm o d e la n du s e dP K C 3i n h i b i

47、t o rL Y 3 3 3 5 31t os u p p r e s st h ea c t i v a t i o no fP K C N nm i c e P K C I Bi n h i b i t o rL Y 3 3 3 5 31w a sa d m i n i s t r a t e d3d a y sp r i o rt oI Rs u r g e r y A tt h ee n do fr e p e r f u s i o n，b l o o da n dt i s s u e sw e r ec o l l e c t e df o ra n a l y s i s I

48、n t e s t i n a lI Rc a u s e ds e v e r ei n j u r yt Ot h el u n ga n dl i v e r,i n c l u d i n gh i s t o p a t h o l o g i c a lc h a n g e s，i n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o n，o x i d a t i v es t r e s sa n da p o p t o s i s P K C l 3s u p p r e s s i o nb yL Y 3 3 3 5 31s

49、 i g n i f i c a n t l ya t t e n u a t e dI R-i n d u c e dh i s t o l o g i cd a m a g e，i n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o n，o x i d a t i v es t r e s s，a n da p o p t o s i si nt h el u n ga n dl i v e r，a n da l s oa l l e v i a t e ds y s t e m i ci n f l a m m a t i o n S e

50、c o n d l y，i no r d e rt Op r o v et h a tL Y 3 3 3 5 31c a ni n h i b i tP K C l 3a c t i v a t i o n，a sw e l la si n h i b i t i n gt h ep h o s p h o r y l a t i o no fp 6 6 s h ct oa l l e v i a t et h ei n t e s t i n a lI Ri n d u c e dA L la n da c u t el i v e ri n j u r y，w ef u r t h e r