补体溶血实验.ppt

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1、补体溶血体溶血实验补体溶血实验l补体：一组存在于人和脊椎动物血清补体：一组存在于人和脊椎动物血清中及组织液中具有酶样活性，不耐热中及组织液中具有酶样活性，不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，在发挥溶细胞作用的必要补充条件，在正常情况下，血清中的补体大多以正常情况下，血清中的补体大多以无无活性酶前体活性酶前体形式存在。形式存在。l物理性质：不稳定，易受各种理化因物理性质：不稳定，易受各种理化因素的影响，加热，紫外线照射，机械素的影响，加热，紫外线照射，机械震荡，酸碱和酒精等因素均可破坏补震荡，酸碱和酒精等因素均可破坏补体。体。l灭活

2、：灭活：5656加热加热30min30min即可灭活即可灭活补体系统的生物学功能补体系统的生物学功能（1 1）溶菌和溶细胞作用：补体系统激活溶菌和溶细胞作用：补体系统激活后，在靶细胞表面形成后，在靶细胞表面形成MACMAC，从而导致靶，从而导致靶细胞溶解。细胞溶解。（2 2）调理作用：补体激活过程中产生的）调理作用：补体激活过程中产生的C3bC3b、C4bC4b、iC3biC3b都是重要的调理素，可都是重要的调理素，可结合中性粒细胞或巨噬细胞表面相应受结合中性粒细胞或巨噬细胞表面相应受体，因此，在微生物细胞表面发生的补体，因此，在微生物细胞表面发生的补体激活，可促进微生物与吞噬细胞的结体激活，

3、可促进微生物与吞噬细胞的结合，并被吞噬及杀伤。合，并被吞噬及杀伤。（3 3）引起炎症反应：在补体活化过程中）引起炎症反应：在补体活化过程中产生的炎症介质产生的炎症介质C3aC3a、C4aC4a、C5aC5a。它们又。它们又称为过敏毒素，与相应细胞表面的受体称为过敏毒素，与相应细胞表面的受体结合，激发细胞脱颗粒，释放组胺之类结合，激发细胞脱颗粒，释放组胺之类的血管活性物质，从而增强血管的通透的血管活性物质，从而增强血管的通透性并刺激内脏平滑肌收缩。性并刺激内脏平滑肌收缩。C5aC5a还是一种还是一种有效的中性粒细胞趋化因子。有效的中性粒细胞趋化因子。（4 4）清除免疫复合物：机制为：）清除免疫复

4、合物：机制为：补体补体与与IgIg的结合在空间上干扰的结合在空间上干扰FcFc段之间的作用，段之间的作用，抑制新的抑制新的ICIC形成或使已形成的形成或使已形成的ICIC解离。解离。循环循环ICIC可激活补体，产生的可激活补体，产生的C3bC3b与抗体共价与抗体共价结合。结合。ICIC借助借助C3bC3b与表达与表达CR1CR1和和CR3CR3的细胞结的细胞结合而被肝细胞清除。合而被肝细胞清除。l（5 5）免疫调节作用：）免疫调节作用：C3C3可参与捕捉可参与捕捉固定抗原，使抗原易被固定抗原，使抗原易被APCAPC处理与递呈。处理与递呈。补体可与免疫细胞相互作用，调节补体可与免疫细胞相互作用，

5、调节细胞的增殖与分化。细胞的增殖与分化。参与调节多种参与调节多种免疫细胞的功能。免疫细胞的功能。补体激活的途径：补体激活的途径：l经典途径经典途径l旁路途径旁路途径lMBL途径途径 相同点：三条途径有共同的末端通路，即相同点：三条途径有共同的末端通路，即形成膜攻击复合物溶解细胞。形成膜攻击复合物溶解细胞。1 1、补体经典途径补体经典途径(classical pathway)(classical pathway)：是：是指以指以抗原抗体复合物抗原抗体复合物为主要刺激物，使补体为主要刺激物，使补体固有成分以固有成分以C1C1、C4C4、C2C2、C3C3、C5C5C9C9顺序发顺序发生酶促连锁反应

6、，产生一系列生物学效应和生酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。l2、替代途径（旁路途径）替代途径（旁路途径）:是指不经是指不经C1C1、C4C4、C2C2活化，而是在活化，而是在B B因子、因子、D D因子和因子和P P因子因子参与下，直接由参与下，直接由C3bC3b与激活物结合启动补体与激活物结合启动补体酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。在感染早期可为机体提供有效的防御机制。在感染早期可为机体提供有效的防御机制。

7、其激活物是其激活物是病原微生物病原微生物等提供接触表面等提供接触表面l3 3、MBLMBL途径：在感染早期，体内分泌甘露途径：在感染早期，体内分泌甘露聚糖结合凝集素聚糖结合凝集素(MBL)(MBL)和和C C反应蛋白。反应蛋白。MBLMBL与与细菌表面的甘露糖残基结合，然后与丝氨细菌表面的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合形成酸蛋白酶结合形成MASPMASP（MBLMBL相关的丝氨酸相关的丝氨酸蛋白酶），蛋白酶），MASPMASP继而水解继而水解C4C4和和C2C2启动后序启动后序的的酶促连锁反应，产生一系列生物学效应酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。

8、和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。激活物（或激活剂）是激活物（或激活剂）是炎症期产生的蛋白炎症期产生的蛋白和病原体和病原体。三条途径的区别见下表 区别点区别点经典途径经典途径旁路途径旁路途径MBLMBL途径途径激活物激活物IgG1IgG13 3或或IgMIgM与与AgAg复合物复合物脂多糖、酵母多糖、脂多糖、酵母多糖、凝聚的凝聚的IgAIgA和和IgG4IgG4MBLMBL（甘露聚糖结甘露聚糖结合凝集素合凝集素）参与成分参与成分C1C1C9C9C3C3，C5C5C9C9，B B、P P、D D因子因子同经典途径同经典途径C3C3转化酶转化酶C4b2bC4b2bC3bBbC3bBb同经典途径

9、同经典途径C3C3转化酶转化酶C4b2b3bC4b2b3bC3bnBbC3bnBb同经典途径同经典途径所需离子所需离子CaCa2 2 Mg Mg2 2MgMg2 2同经典途径同经典途径作用作用参与特异性免疫在参与特异性免疫在感染后期发作用感染后期发作用参与非特性免疫，在参与非特性免疫，在感染后期发挥作用感染后期发挥作用同经典途径同经典途径补体的来源、采集l实验室常用豚鼠、兔的新鲜血清作为补体实验室常用豚鼠、兔的新鲜血清作为补体的来源。的来源。l补体的采集：一般选用补体的采集：一般选用3-5只健康未妊娠的只健康未妊娠的豚鼠或兔子，以无菌操作采集血液，采集豚鼠或兔子，以无菌操作采集血液，采集好的血

10、液置好的血液置4冰箱过夜，次日离心分离血冰箱过夜，次日离心分离血清即可分离到补体。清即可分离到补体。l溶血素（抗绵羊红细胞抗体）：是以溶血素（抗绵羊红细胞抗体）：是以SRBCSRBC作为抗原免疫家兔所得到的兔抗血清，无作为抗原免疫家兔所得到的兔抗血清，无需进一步提纯，但试验前应先需进一步提纯，但试验前应先5656加热加热30min30min或者或者60 3min60 3min灭活灭活补体。补体。l溶血反应：由于抗原（红血球）和抗体溶血反应：由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性的结合，在电解质（溶血素）进行特异性的结合，在电解质存在时能发生凝集，若再有补体参与，红存在时能发生凝集，若再有

11、补体参与，红血球则被溶解。血球则被溶解。实验目的实验目的l掌握补体测定方法掌握补体测定方法l加深了解补体的作用和激活条件加深了解补体的作用和激活条件材料与试剂材料与试剂l试剂试剂1.1.抗原：抗原：2%2%绵羊红细胞绵羊红细胞2.2.抗体：溶血素抗体：溶血素3.3.补体：实验室常以补体：实验室常以健康豚鼠健康豚鼠血清作为补体血清作为补体l材料材料:小试管，生理盐水，水浴箱小试管，生理盐水，水浴箱实验方法l取试管取试管4 4支，按下表加入各物支，按下表加入各物试管号试管号溶血素溶血素补体补体2%SRBC2%SRBC生理盐水生理盐水结果结果1 10.50.50.50.50.50.50.50.52

12、20.50.5-0.50.51.01.03 3-0.50.50.50.51.01.04 40.50.50.50.5（灭活）（灭活）0.50.50.50.5实验方法实验方法l将上述试管放在将上述试管放在3737水浴箱内水浴箱内3030分钟观察分钟观察有无溶血现象。有无溶血现象。l将不溶血试管离心，将不溶血试管离心，3000rpm3000rpm，5min5min，使红，使红细胞沉淀。细胞沉淀。l将将2 2、3 3号管上清液分别移入号管上清液分别移入5 5、6 6管，按下管，按下表加入试剂表加入试剂实验方法实验方法试管号试管号内容物内容物溶血素溶血素补体补体2%2%SRBCSRBC生理生理盐水盐水结

13、果结果2 2管管2 2沉淀物沉淀物-0.50.5-2.52.53 3管管3 3沉淀物沉淀物0.50.5-2.52.54 4管管4 4沉淀物沉淀物-0.50.5-2.52.55 5管管2 2上清上清液液-0.50.50.50.5-6 6管管3 3上清上清液液0.50.5-0.50.5-l将上述将上述5 5支试管放入支试管放入3737水浴箱内水浴箱内30min30min观察有无溶血现象，观察有无溶血现象，并解释原因并解释原因实验结果实验结果l溶血：液体呈红色透明溶血：液体呈红色透明l不溶血：呈红细胞混悬液不溶血：呈红细胞混悬液思考题l根据所给的条件，请预测哪几管会溶血？哪几管不会溶血？请你详细分析溶血和不溶血的原因。谢谢观赏谢谢观赏