实验二经口急性毒性试验AcuteOralToxicity.ppt

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1、实验二经口急性毒性试验AcuteOralToxicity目的要求目的要求 掌握实验动物的常用染毒途径和方法。掌握实验动物的常用染毒途径和方法。掌握半数致死浓度的测定方法和结果评定。掌握半数致死浓度的测定方法和结果评定。实习内容实习内容 试验动物的选择和性别鉴定。试验动物的选择和性别鉴定。试验动物的称重、编号以及随机分组方法。试验动物的称重、编号以及随机分组方法。急性毒性试验常用染毒途径和方法。急性毒性试验常用染毒途径和方法。急性毒性反应的观察和急性毒性反应的观察和LD50计算。计算。实验材料实验材料(一一)实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。(二二)器材器材

2、 注射器注射器(O.25，1，2，5ml)、吸管、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，10m1)、容量瓶、容量瓶(10，25，50ml、烧杯、烧杯(10，25，50ml)、滴管、滴管、灌胃针灌胃针(大鼠、小鼠适用大鼠、小鼠适用)、电子天平、电子天平(感应量感应量1/10000g)、动物、动物体重秤、外科剪刀、镊子。体重秤、外科剪刀、镊子。(三三)试剂试剂 受试化学物为氟化钠受试化学物为氟化钠(NaF，分析纯，分析纯)，苦味酸酒精饱和液，苦味酸酒精饱和液或其它染色剂。或其它染色剂。实验动物的选择实验动物的选择(提问提问)实验动物的性别鉴定实验动物的性别鉴定小鼠（小鼠（Mouse）大鼠（大鼠（R

3、at）实验动物的称重实验动物的称重 大、小鼠秤的感应量需在大、小鼠秤的感应量需在0.1g以下。以下。同一组内、同性别动物体重差异应同一组内、同性别动物体重差异应小于平均体重的小于平均体重的10%。不同组间同性别动物体重均值差异不同组间同性别动物体重均值差异应小于应小于5%。急性毒性实验一般使用体重为急性毒性实验一般使用体重为18-22g的小鼠或的小鼠或/和和180-220g大鼠。大鼠。实验动物编号的标记方法实验动物编号的标记方法颜料涂擦被毛编号法（常用于大小鼠）：颜料涂擦被毛编号法（常用于大小鼠）：红色：红色：0.5%中性红或品红溶液中性红或品红溶液 黄色：黄色：黄色：黄色：3-5%3-5%苦

4、味酸溶液（水苦味酸溶液（水苦味酸溶液（水苦味酸溶液（水）80-90%80-90%苦味酸酒精饱和溶液苦味酸酒精饱和溶液苦味酸酒精饱和溶液苦味酸酒精饱和溶液 咖啡色：咖啡色：2%硝酸银硝酸银 黑色：煤焦油的酒精溶液黑色：煤焦油的酒精溶液 大小鼠标记方法（单色法大小鼠标记方法（单色法n10）单色法标记原则：单色法标记原则：单色单色法编大于法编大于1010的号码时，的号码时，我们规定顺时针旋转，我们规定顺时针旋转，后一位必需大于前一位后一位必需大于前一位数，数，例如：可以编，例如：可以编，1212，1313，14191419，但不，但不能编能编1010，1111，2020，2121，2222，3030

5、，3131，3232，3333，等，以此类推。等，以此类推。100100以以内最大能编内最大能编8989号。号。大小鼠标记方法（双色法大小鼠标记方法（双色法n10）红色表示十位数：红色表示十位数：头部染红色为头部染红色为10 10 左前肢为左前肢为20 20 左腰部为左腰部为30 30 黄色表示个位数黄色表示个位数。其它标记方法其它标记方法烙印编号法：烙印编号法：体内埋号编号法：体内埋号编号法：耳孔编号法：耳孔编号法：挂牌编号法：挂牌编号法：表表1 动物随机分组表动物随机分组表动物号动物号123456789101112131415随机数字随机数字977424676242811457264253

6、323732除除6余数余数120120323205212分组分组ABFABFCBCBFEBAB动物号动物号161718192021222324252627282930随机数字随机数字2773675124517989731676622766除除6余数余数310130315144230分组分组CAFACFCAEADDBCF实验动物的随机分组实验动物的随机分组规定：规定：余数：余数：1、2、3、4、5、6分别对应分别对应A、B、C、D、E、F 组组 实验动物调配实验动物调配按上法分组后，按上法分组后，A组有动物组有动物7只，只，B组组7只，只，C组组6只，只，D组与组与E组各组各2只，只，F组组6只

7、。为了使每组动物数均为只。为了使每组动物数均为5只，需要根据随机分配的原则再选出只，需要根据随机分配的原则再选出2只只A组和组和1只只C组动物给组动物给D组。组。B组选出组选出2只，只，F组选出组选出1只给只给E组。组。组组 别别鼠鼠 号号A141417192325B25810131528C7916202229D2627E1224F3611182130表表2 初步分组结果初步分组结果表表3 调配后调配后30只动物随机分组只动物随机分组组别组别鼠号鼠号组别组别鼠号鼠号A114171923D49252627B58101315E26122428C716202229F311182130具体方法如下：继

8、续抄下随机数字分别除以具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的组的现有动物数现有动物数，即：，即：56/7(7为为A组现动物数组现动物数)整除，余数为整除，余数为0，将，将A组第组第7只动物只动物(25号号)调配给调配给D组；下一个：组；下一个：50/6(6为为A组现有动物数组现有动物数)余余2，将，将A组第组第2只动物只动物(4号号)调配给调配给D组；接下来组；接下来26/6(6为为C组组现有动物数现有动物数)余余2，将，将C组第组第2只动物只动物(9号号)给给D组。余类推，最后调整分组成表组。余类推，最后调整分组成表3所所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试

9、验。示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试验。实验动物染毒途径和方法（示教）实验动物染毒途径和方法（示教）常用的染毒途径：常用的染毒途径：常用的染毒途径：常用的染毒途径：经口染毒经口染毒经口染毒经口染毒经呼吸道染毒经呼吸道染毒经呼吸道染毒经呼吸道染毒经皮染毒经皮染毒经皮染毒经皮染毒注射途径染毒注射途径染毒注射途径染毒注射途径染毒吸收速率：吸收速率：吸收速率：吸收速率：静脉注射静脉注射静脉注射静脉注射 吸入染毒吸入染毒吸入染毒吸入染毒 肌肉注射肌肉注射肌肉注射肌肉注射 腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射 皮下注射皮下注射皮下注射皮下注射 经口染毒经口染毒经口染毒经口染毒 皮内注射皮内

10、注射皮内注射皮内注射 其他染毒途径如经皮等其他染毒途径如经皮等其他染毒途径如经皮等其他染毒途径如经皮等 受试物的配制受试物的配制1、受试化学物的量取、受试化学物的量取(1)、称量法、称量法-固体化学物固体化学物(2)、吸量法、吸量法-液体化学物液体化学物2、受试化学物的稀释、受试化学物的稀释(1)、等浓度稀释法、等浓度稀释法(2)、等容量稀释法、等容量稀释法n nKarberKarber法或平均致死量法，是依据剂量对数与死亡率呈法或平均致死量法，是依据剂量对数与死亡率呈法或平均致死量法，是依据剂量对数与死亡率呈法或平均致死量法，是依据剂量对数与死亡率呈S S型型型型曲线所包括的面积推导出死亡率

11、为曲线所包括的面积推导出死亡率为曲线所包括的面积推导出死亡率为曲线所包括的面积推导出死亡率为50%50%的剂量；的剂量；的剂量；的剂量；n n 此法简单，准确率高，但实验设计要求每个染毒组实验动此法简单，准确率高，但实验设计要求每个染毒组实验动此法简单，准确率高，但实验设计要求每个染毒组实验动此法简单，准确率高，但实验设计要求每个染毒组实验动物数相同，各计量组距呈等比级数，死亡率呈常态分布，最物数相同，各计量组距呈等比级数，死亡率呈常态分布，最物数相同，各计量组距呈等比级数，死亡率呈常态分布，最物数相同，各计量组距呈等比级数，死亡率呈常态分布，最低剂量组死亡率低剂量组死亡率低剂量组死亡率低剂量

12、组死亡率20%80%80%。寇氏法寇氏法预实验预实验 n n目的是为了确定正式实验的剂量范围。目的是为了确定正式实验的剂量范围。目的是为了确定正式实验的剂量范围。目的是为了确定正式实验的剂量范围。n n一般是采用少量动物一般是采用少量动物一般是采用少量动物一般是采用少量动物(23(23只为一组只为一组只为一组只为一组)，拉大组距，逐渐，拉大组距，逐渐，拉大组距，逐渐，拉大组距，逐渐缩小，找出受试物缩小，找出受试物缩小，找出受试物缩小，找出受试物0%0%和和和和100%100%死亡剂量。死亡剂量。死亡剂量。死亡剂量。正式试验正式试验经预试验求出受试化学物的致死剂量范围经预试验求出受试化学物的致死

13、剂量范围(即死亡率即死亡率10%-90%的剂量范围的剂量范围)，再以下式求出正式试验的剂量组距，再以下式求出正式试验的剂量组距(i)值。值。i表示相邻的两个剂量组，剂量对数之差或相邻两组剂表示相邻的两个剂量组，剂量对数之差或相邻两组剂量比值的对数值；量比值的对数值；n为设计的剂量组数；为设计的剂量组数；求得值后以最低剂量组的剂量值加上一个即是第二个剂量求得值后以最低剂量组的剂量值加上一个即是第二个剂量组的对数剂量，依次推至最高剂量组，查各自反对数及得组的对数剂量，依次推至最高剂量组，查各自反对数及得出各组剂量的真实值。出各组剂量的真实值。啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容啮齿类动物急性毒性中毒

14、主要观察内容啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容（1 1）小鼠氟化钠经口急性毒性测量小鼠氟化钠经口急性毒性测量 系统器官系统器官观察及检查项目观察及检查项目中毒后一般表现中毒后一般表现中枢神经系统及神经肌肉系统中枢神经系统及神经肌肉系统植物神经系统植物神经系统呼吸系统呼吸系统行为动作对各种刺激的反应大脑及脊髓反射肌肉紧张力瞳孔大小分泌鼻孔呼吸性质和速率改变姿态、叫声异常、不安、安静震颤、运动失调、麻痹、惊撅、强制性动作易兴奋、被动、缺乏知觉、知觉过敏减弱、缺乏强直、弛缓扩大或缩小流泪、出汗流鼻涕弛缓、困难、潮式呼吸啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容啮齿类动物急性

15、毒性中毒主要观察内容啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容（2 2）系统器官系统器官观察及检查项目观察及检查项目中毒后一般表现中毒后一般表现泌尿生殖系统泌尿生殖系统皮毛皮毛眼睛眼睛其他其他阴户、乳腺阴茎会阴部颜色、张力、完整性眼硷眼球透明度直肠或皮肤温度一般情况肿胀脱垂、遗精污秽、有分泌物皮肤充血、紫组、皮毛松弛、污秽上睑下垂突出，充血，震颤混浊降低、升高姿态不正常、消瘦小鼠氟化钠经口急性毒性测量小鼠氟化钠经口急性毒性测量 表表表表4 4 4 4 急性毒性症状记录表急性毒性症状记录表急性毒性症状记录表急性毒性症状记录表受试物名称:实验日期:实验动物种系：结构式：室

16、 温：组别剂量(mg/m3)动物编号性别体重(g)症状出现时间死亡时间小鼠氟化钠经口急性毒性测量小鼠氟化钠经口急性毒性测量 计算公式计算公式计算公式计算公式:LD50的计算的计算寇氏法寇氏法 其中：其中：其中：其中：m:1ogLD m:1ogLD5050;Sm:Sm:标准差标准差标准差标准差;p:p:各组死亡率总和各组死亡率总和各组死亡率总和各组死亡率总和;p:p:各组死亡率各组死亡率各组死亡率各组死亡率;q:1 q:1p p i i：相邻两组对数值之差：相邻两组对数值之差：相邻两组对数值之差：相邻两组对数值之差 n n：每组动物数每组动物数每组动物数每组动物数;X Xk k ：最大剂量的对数

17、值：最大剂量的对数值：最大剂量的对数值：最大剂量的对数值 表表5 某化学物质小鼠经口染毒死亡情况某化学物质小鼠经口染毒死亡情况组别组别剂量剂量动物数动物数 死亡数死亡数 死亡率死亡率 存活率存活率p.qmg/kg对数对数（只）（只）（只）（只）（p）（q）1151.17611000102181.25611020.20.80.16321.71.33611050.50.50.25426.11.41611070.70.30.21531.31.49611090.90.10.09i=0.08p=2.3 举例：举例：举例：举例：LDLD5050的计算的计算的计算的计算寇氏法寇氏法寇氏法寇氏法lgLD50

18、及其及其95%可信限为可信限为1.35211.960.02131.35210.0417lgLD50 及其及其95%可信区间范围为可信区间范围为22.50mg/kg(20.4424.76mg/kg)举例：举例：举例：举例：LDLD5050的计算的计算的计算的计算寇氏法寇氏法寇氏法寇氏法外源化学物急性毒性分级（外源化学物急性毒性分级（外源化学物急性毒性分级（外源化学物急性毒性分级（WHOWHO）1mg/kg 22.50mg/kg 50mg/kg1mg/kg 22.50mg/kg 50mg/kg该化合物大鼠急性经口毒性为高毒该化合物大鼠急性经口毒性为高毒该化合物大鼠急性经口毒性为高毒该化合物大鼠急性

19、经口毒性为高毒举例：举例：举例：举例：LDLD5050的计算的计算的计算的计算寇氏法寇氏法寇氏法寇氏法注意事项注意事项灌胃染毒时要求动物保持空腹状态，因此染毒前应禁食灌胃染毒时要求动物保持空腹状态，因此染毒前应禁食（不禁水）（不禁水）610小时。灌胃后至少小时。灌胃后至少23小时后才能喂食。小时后才能喂食。油剂比水溶液要求限制喂食的时间更长些。油剂比水溶液要求限制喂食的时间更长些。相同剂量的受试物，若以不同浓度给药，死亡情况会有所相同剂量的受试物，若以不同浓度给药，死亡情况会有所不同。常用的方法是将受试物体积固定，根据实验设计的不同。常用的方法是将受试物体积固定，根据实验设计的剂量将受试物配制成不同浓度的溶液进行灌胃。剂量将受试物配制成不同浓度的溶液进行灌胃。通常灌胃体积以体重的通常灌胃体积以体重的1%2%计算，最多不超过计算，最多不超过3%，即，即每每100g体重溜胃体重溜胃l2m1，最多不超过，最多不超过3ml。根据实际经验得。根据实际经验得出的各种实验动物灌胃量的极限是：小鼠出的各种实验动物灌胃量的极限是：小鼠O.51ml，大鼠，大鼠45m1。谢谢大家！结结 语语