目的基因获取.ppt

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1、第四章第四章 目的基因的获得目的基因的获得目的基因目的基因准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构和研究某基因结构和功能的关系功能的关系研究某基因与疾研究某基因与疾病的关系病的关系一、基因的基本结构特征一、基因的基本结构特征 一个能转录、翻译的结构基因依次包括一个能转录、翻译的结构基因依次包括以下几部分：以下几部分：转录启动区转录启动区、核糖体识别区核糖体识别区、编码区编码区(包括起始密码子包括起始密码子ATG、开放阅读框、开放阅读框、终止密码子终止密码子TAG、TAA或或TGA)和和转录终止转录终止区区。（一）原核生物

2、基因的组成（一）原核生物基因的组成操纵子操纵子启动子启动子启动子启动子：RNARNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段；聚合酶识别、结合和开始转录的片段；聚合酶识别、结合和开始转录的片段；聚合酶识别、结合和开始转录的片段；SDSD区区区区：糖体：糖体：糖体：糖体16S rRNA16S rRNA识别、结合识别、结合识别、结合识别、结合mRNAmRNA的位置；的位置；的位置；的位置；转录终止子和终止因子转录终止子和终止因子转录终止子和终止因子转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子：分别指基因或操纵子：分别指基因或操纵子：分别指基因或操纵子3 3 端提端提端提端提供转录终止信号的供转录终止信号的供转

3、录终止信号的供转录终止信号的DNADNA序列；协助序列；协助序列；协助序列；协助mRNAmRNA聚合酶识别聚合酶识别聚合酶识别聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。终止信号的辅助蛋白。终止信号的辅助蛋白。终止信号的辅助蛋白。原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹成茎环发夹成茎环发夹成茎环发夹 。基因区基因区基因区基因区：ATG+extrons+introns+TAAATG+extrons+introns+TAA（TGATGA或或或或TAGTAG）转

4、录启动区转录启动区转录启动区转录启动区：编码蛋白的启动子：编码蛋白的启动子：编码蛋白的启动子：编码蛋白的启动子(RNA(RNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶识别识别识别识别)可寻找三个保守区：可寻找三个保守区：可寻找三个保守区：可寻找三个保守区：TATAA/TATATAA/TA区（区（区（区（HognessHogness框框框框）、）、）、）、CAATCAAT框、框、框、框、GCGC框框框框。转录终止区转录终止区转录终止区转录终止区:真核生物转录的终止信号并不清楚。真核生物转录的终止信号并不清楚。真核生物转录的终止信号并不清楚。真核生物转录的终止信号并不清楚。（二）真核生物基因的组成（二）真核生物基

5、因的组成二、目的基因的获得方法二、目的基因的获得方法目前克隆目的基因常用的方法有四种方法：目前克隆目的基因常用的方法有四种方法：化学合成法、化学合成法、cDNA文库法、文库法、PCR法和法和RT-PCR法法。将将已知序列已知序列的目的基因利用化学合成的方法直的目的基因利用化学合成的方法直接合成。接合成。特点：特点：只能合成小于只能合成小于100个碱基特定序列；个碱基特定序列；自动化程度较高；自动化程度较高；合成速度较快。合成速度较快。方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷固相亚磷酸三酯法酸三酯法（一）化学合成法（一）化学合成法化学合成法的用途化学合成法的用途合成天

6、然基因：合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等修饰改造基因：修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基因、如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等尿激酶原基因等设计新型基因设计新型基因制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头（二）（二）cDNA文库法文库法cDNA(complementary DNA，互补，互补DNA)：由：由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNA。cDNA文库：文库：利用某种生

7、物的总利用某种生物的总mRNA合成合成cDNA，再将这些，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库文库。基因组DNA文库cDNA文库基因组基因组DNA文库与文库与cDNA文库的比较文库的比较构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤1.总总RNA（total RNA）提取）提取提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。mRNA约占总约占总RNA的的15，所以应选用，所以应选用目目的基因的基因mRNA表达最丰富的组织细胞表达最丰富的组织细胞为材料为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛来源，如获

8、胰岛素基因，由应以胰岛细胞为细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料2.mRNA的分离纯化的分离纯化原理：利用原理：利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，将将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中等）中分离纯化。分离纯化。方法：亲和层析。分离方法：亲和层析。分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱纤维柱。3.cDNA第一链的合成第一链的合成Oligo dT法法：用：用Oligo dT作引物，合成作引物，合成cDNA的第一链。的第一链。反转录酶反转录酶

9、mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物不适用于大分子量的不适用于大分子量的mRNA随机引物法随机引物法：随机合成：随机合成6-10bp的多种引物，的多种引物，从从mRNA的多个位点开始合成的多个位点开始合成cDNA。基因特异性引物法基因特异性引物法：mRNA序列已知，设计序列已知，设计基因特异性引物，在反转录酶的作用下合成基因特异性引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。第一链。4.降解降解mRNA模板模板用碱处理或用用碱处理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂杂交分子中的交分子中的mRNA。3 引物引物mRNAmRNAcDNA3 3 5 5

10、 反转录酶反转录酶引物引物cDNA第一链第一链3 5 5 cDNA第一链第一链3 5 引物引物或或RNaseH碱碱5.cDNA第二链的合成第二链的合成自身引导法自身引导法用用RnaseH 消化后，消化后，cDNA单链的单链的3末端一末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。链的引物。用用DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链DNA。S1核酸酶消化会使获得的双链核酸酶消化会使获得的双链cDNA 5端端有几对碱基缺失有几对碱基缺失置换合成法置换合成法 以第一链合成产物以第一链合成产物cDNA-mR

11、NA杂交杂交体作为切口平移的模板，体作为切口平移的模板，RNA酶酶H在杂交在杂交体的体的mRNA链上造成切口和缺口链上造成切口和缺口,产生一系产生一系列列RNA引物，在引物，在DNA聚合酶聚合酶I的作用下合的作用下合成成cDNA的第二链的第二链.置换合成法置换合成法6.cDNA与载体连接与载体连接在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头，即可与载，即可与载体连接，转入受体菌。体连接，转入受体菌。或借助或借助末端转移酶末端转移酶给载体和双链给载体和双链cDNA的的3端分别加上几个端分别加上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC

12、末端转移酶末端转移酶cDNA文库的查询文库的查询用目的基因探针与文库中的重组载体进行用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。杂交。文库文库文库文库载体载体载体载体探针探针探针探针电泳后杂交放射电泳后杂交放射电泳后杂交放射电泳后杂交放射自显影自显影自显影自显影测序分析测序分析测序分析测序分析（三）（三）PCR法法目前实验室最常用。目前实验室最常用。扩增时容易突变：高保真的扩增时容易突变：高保真的PCR引物，引物，DNA序列测定。序列测定。1.直接从基因组中扩增直接从基因组中扩增提取基因组提取基因组DNA作模板；作模板；根据目的基因序列设计引物；根据目的基因序列设计引物

13、；PCR扩增。扩增。适合扩增原核生物基因。适合扩增原核生物基因。原核基因组部分原核基因组部分原核细胞原核细胞提取基因组提取基因组DNAPCR扩增扩增2.从从mRNA中扩增中扩增:RT-PCR提取基因组总提取基因组总RNA；反转录合成总反转录合成总cDNA作模板；作模板；根据目的基因序列设计引物；根据目的基因序列设计引物；PCR扩增。扩增。适合扩增真核生物基因。适合扩增真核生物基因。目的基因目的基因 的引物的引物1反转录成目的基因反转录成目的基因cDNA第一链第一链目的基因目的基因 的引物的引物2目的目的 基因基因cDNA第二链第二链PCRmRNA获取目的基因方法的选择策略获取目的基因方法的选择

14、策略类类类类型型型型已知的信息已知的信息已知的信息已知的信息获得目的基因的方法获得目的基因的方法获得目的基因的方法获得目的基因的方法1 1已知目的基因的部分序列或其他物已知目的基因的部分序列或其他物已知目的基因的部分序列或其他物已知目的基因的部分序列或其他物种中同源基因的保守序列种中同源基因的保守序列种中同源基因的保守序列种中同源基因的保守序列PCRPCR相关的技术简便、快速地获得全长的目的相关的技术简便、快速地获得全长的目的相关的技术简便、快速地获得全长的目的相关的技术简便、快速地获得全长的目的基因基因基因基因已知的目的基因部分片段为探针从基因文库中筛已知的目的基因部分片段为探针从基因文库中

15、筛已知的目的基因部分片段为探针从基因文库中筛已知的目的基因部分片段为探针从基因文库中筛选。选。选。选。2 2已知基因表达的蛋白产物已知基因表达的蛋白产物已知基因表达的蛋白产物已知基因表达的蛋白产物制备抗体通过免疫学方法筛选表达型制备抗体通过免疫学方法筛选表达型制备抗体通过免疫学方法筛选表达型制备抗体通过免疫学方法筛选表达型cDNAcDNA文库文库文库文库对蛋白对蛋白对蛋白对蛋白N N端测序后端测序后端测序后端测序后,以氨基酸序列反推核昔酸序列以氨基酸序列反推核昔酸序列以氨基酸序列反推核昔酸序列以氨基酸序列反推核昔酸序列,或标记为寡聚核昔酸探针筛选基因文库或设计简或标记为寡聚核昔酸探针筛选基因文库或设计简或标记为寡聚核昔酸探针筛选基因文库或设计简或标记为寡聚核昔酸探针筛选基因文库或设计简并引物通过并引物通过并引物通过并引物通过PCRPCR相关技术获得目的基因相关技术获得目的基因相关技术获得目的基因相关技术获得目的基因