克隆生物技术论文.docx

《克隆生物技术论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《克隆生物技术论文.docx（7页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、克隆生物技术论文猪USF1基因克隆与序列分析 摘要：争论克隆了猪USF1基因1 382 bp的cDNA序列(登录号：EF 219407)和5 516 bp的DNA序列(登录号：EF 625885)。序列分析发觉猪USF1基因编码区序列与人、小鼠的同源性分别为99%和98%。基因组序列分析发觉猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子，内含子的剪接方式均符合“GT-AG”法则。 关键词：猪;USF1基因;克隆;序列分析 中图分类号：S828;Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2013)24-6175-03 上游刺激因子1(Upstream stimulatory facto

2、r 1，USF1)是螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(HLH- LZIP)转录因子家族成员之一1，可以与USF2形成二聚体，并能识别DNA的E-box序列，调整基因转录2。人类USF1基因位于1q22-q233，并广泛表达于机体的各个组织，调控糖和脂肪代谢基因的表达4，此外USF1基因还具有调整免疫反应和细胞周期的功能5。争论发觉USF1基因可以作为调整治疗人的胰岛素抵抗葡萄糖不耐症、II型糖尿病和向心型肥胖易感症的候选基因6-9。本争论利用EST信息和测序的方法克隆了猪USF1基因并进行了序列分析，为进一步争论该基因对猪生长发育的调控机理具有重要的意义。 1 材料与方法 1.1 试验材料 采集4月龄

3、大白猪(湖北省农业科学院畜牧兽医争论所原种猪场)的肌肉组织，用液氮速冻置于 -70 中，利用TRizol法提取总RNA，反转录得到cDNA。利用DNA提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司提取DNA，贮存于-20 。 pMD-18T vector system、DH5购自宝生物工程(大连)有限公司;Gel Extraction Kit购自生工生物工程(上海)股份有限公司。 1.2 引物设计 以人的基因序列为探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank数据库中搜寻同源序列，筛选猪的同源性EST(标准：长度200 bp，相像性80%)，用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序

4、列拼接，参照拼接的.contig(重叠群)接受Primer5.0软件设计引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R等3对引物扩增USF1基因的cDNA序列。参照USF1基因的cDNA序列设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R，U9F/U9R等6对引物(表1)扩增USF1基因的序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 1.3 PCR扩增与测序 PCR扩增体系为25 L，包括50 ng 模板DNA、2.5 mmol/L 1Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、0.5 mmol/L P

5、CR primers、2 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：94 预变性4 min; 94 变性45 s，退火(温度、时间依据引物来确定)，72 延长90 s，35个循环;最终72 延长10 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，与pMD-18T vector system连接，并转化大肠杆菌DH5，将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序。 2 结果与分析 2.1 RT-PCR扩增USF1基因 以大白猪cDNA为模版，利用引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R均扩增出了特异带，RT-PCR扩增产物结果如图

6、1所示。将PCR产物回收、纯化、克隆测序，测序结果显示引物U1F/U1R扩增产物长度为613 bp(图1a)，引物U2F/U2R扩增产物长度为312 bp(图1b)，引物U3F/U3R扩增产物长度为520 bp(图1c)。 2.2 猪USF1基因的cDNA序列同源性分析 利用DNAStar软件的SeqMan程序将RT-PCR扩增得到的片段进行拼接，得到一条长1 382 bp的 cDNA序列。将获得的猪USF1基因的cDNA序列分别与人USF1基因cDNA序列(NM_007122)和小鼠序列(NM_009480)进行比对。结果表明，猪与人、小鼠的同源性分别为99%和98%，确定所猎取的序列为猪的

7、USF1基因，提交到GenBank，得到登录号为EF 219407。 2.3 猪USF1与部分物种USF1的进化关系 利用GenBank已有的USF1蛋白质序列： NP_001001161(USF1，Cattle)，NP_001007486(USF1， Gallus)，NP_009053(USF1，Human)，NP_033506 (USF1， Mouse)， NP_113965(USF1，Rat)以及猪USF1基因编码的氨基酸序列， 利用ClustalW软件对6个物种的USF1氨基酸序列进行了序列比对，结果发觉猪与人和牛的同源性达到了99%，与小鼠和大鼠的同源性达到了98%，并构建了系统进化

8、树(图2)。 2.4 猪USF1基因组序列的克隆和序列分析 依据人的cDNA序列和人的基因组序列比对结果，猜想的猪USF1基因内含子，参照分别得到的基因序列，设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R和U9F/U9R等6对引物，以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增猪USF1基因的10个内含子序列，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图3。 引物U4F/U4R在猪基因组中的扩增片段长度是2 094 bp，其中第1内含子的长度为2 007 bp;引物U5F/U5R在猪基因组中的扩增片段长度740 bp，其中第2，3内含子的长度分别为363 bp和1

9、57 bp;引物U6F/U6R在猪基因组中的扩增片段长度783 bp，其中第4，5内含子的长度分别为301 bp和241 bp;引物U7F/U7R在猪基因组中的扩增片段长度600 bp，其中第6，7内含子的长度分别为249 bp和135 bp;引物U8F/U8R在猪基因组中的扩增片段长度656 bp，其中第8，9内含子的长度分别为153 bp和249 bp;引物U9F/U9R在猪基因组中的扩增片段长度690 bp，其中第10内含子的长度为192 bp。利用DNAStar软件的SeqMan程序将扩增得到的片段进行拼接，得到一条5 516 bp的DNA序列，将序列拼接提交到GenBank收录号为E

10、F 625885。基因组序列分析发觉猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子，内含子的剪接方式都符合“GT-AG”法则。 3 小结与争辩 本争论中猪USF1基因的cDNA序列与人和小鼠的同源性分别为99%和98%;编码区的高度保守性证明白所分别基因的正确性，同时也为利用小鼠等模式动物的基因信息来进行畜禽基因组学的争论供应依据。 脊椎动物间的基因序列具有高度的保守性，依据已知物种的基因组序列，可以猜想其他物种同源基因的基因序列。本争论利用人USF1基因序列，猜想了猪USF1基因序列，并通过试验获得了相应的基因组序列。测序结果表明，所获得的候选基因的内含子和外显子组成及相对位置与猜想结果全都，

11、且内含子的剪接方式均符合“GT-AG”法则。 参考文献： 1 GREGOR P D， SAWADOGO M， ROEDER R G， et al. The adenovirus major late transcription factor USF is a member of the helix-loop-helix group of regulatory proteins and binds to DNA as a dimerJ. Genes Dev，1990，4(10)：1730-1740. 2 SIRITO M， WALKER S， LIN Q， et al. Members of t

12、he USF family of helix-loop-helix proteins bind DNA as homo- as well as heterodimersJ. Gene Expression，1992，2(3)：231-240. 3 SHIEH B H， SPARKES R S， GAYNOR R B， et al.Localization of the gene-encoding upstream stimulatory factor (USF) to human chromosome 1q22-q23J. Genomics，1993，16(1)：266-268. 4 LEE

13、J C， LUSIS A J， PAJUKANTA P. Familial combined hyperlipidemia： Upstream transcription factor 1 and beyondJ. Current Opinion in Lipidology，2007，17(2)：101-109. 5 TERRAGNI J， NAYAK G， BANERJEE S， et al.The E-Box binding factors Max/Mnt， MITF and USF1 Act coordinately with FoxO to regulate expression of

14、 Pro-apoptotic and cell cycle control genes by phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/GSK3 signalingJ. Journal of Biological Chemistry，2011，286(42)：36215-36227. 6 PAJUKANTA P， LILJA H E， SINSHEIMER J S， et al.Familial combined hyperlipidemia is associated with upstream transcription factor 1(USF1)J.Natur

15、e Gene，2004，36(4)：371-376. 7 KOMULAINEN K， ALANNE M， AURO K， et al.Risk alleles of USF1 gene predict cardiovascular disease of women in two prospective studiesJ. Plos Genetics，2006，2(5)：672-681. 8 COON H， XIN Y， HOPKINS P N， et al.Upstream stimulatory factor 1 associated with familial combined hyperlipidemia， LDL cholesterol， and triglyceridesJ. Humman Genet，2005，117(5)：444-451. 9 SANCHEZ A P， ZHAO J H， YOU Y， et al. Role of the USF1 transcription factor in diabetic kidney diseaseJ. American Journal of Physiology-Renal Physiology，2011，301(2)：271-279.7