原位分子杂交组织化学概要.ppt

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1、原位分子杂交组织化学InIn Situ Hybridization Situ Hybridization HistochemistryHistochemistry(ISHH)ISHH)一、概念 用已知碱基顺序并带有标记物的用已知碱基顺序并带有标记物的核核酸探针酸探针与组织、细胞中与组织、细胞中待测的核酸待测的核酸按碱按碱基配对的原则进行基配对的原则进行特异性结合特异性结合，形成杂，形成杂交体，然后再用与标记物对应的检测系交体，然后再用与标记物对应的检测系统，通过统，通过组织化学或免疫组织化学方法组织化学或免疫组织化学方法在核酸在核酸原有位置原有位置进行进行细胞内定位细胞内定位。二、原位杂交的基

2、本原理二、原位杂交的基本原理三、原位杂交组织化学技术的应用 1.1.1.1.细胞特异性细胞特异性细胞特异性细胞特异性mRNAmRNAmRNAmRNA转录的定位；转录的定位；转录的定位；转录的定位；2.2.2.2.癌癌癌癌基基基基因因因因、抑抑抑抑癌癌癌癌基基基基因因因因及及及及各各各各种种种种功功功功能能能能基基基基因因因因在在在在转转转转录录录录水水水水平的表达平的表达平的表达平的表达 及其变化的研究；及其变化的研究；及其变化的研究；及其变化的研究；3.3.3.3.病原微生物检测；病原微生物检测；病原微生物检测；病原微生物检测；4 4 4 4.基因在染色体上的定位；基因在染色体上的定位；基因

3、在染色体上的定位；基因在染色体上的定位；5.5.5.5.检测染色体的变化；检测染色体的变化；检测染色体的变化；检测染色体的变化；6 6 6 6.分裂间期细胞遗传学的研究。分裂间期细胞遗传学的研究。分裂间期细胞遗传学的研究。分裂间期细胞遗传学的研究。四、核酸探针的种类根据探针的根据探针的根据探针的根据探针的核酸性质核酸性质核酸性质核酸性质不同不同不同不同 DNADNADNADNA探针、探针、探针、探针、RNARNARNARNA探针、探针、探针、探针、cDNAcDNAcDNAcDNA探针、探针、探针、探针、cRNAcRNAcRNAcRNA探针、探针、探针、探针、寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针

4、寡核苷酸探针根据探针的根据探针的根据探针的根据探针的标记方法标记方法标记方法标记方法不同不同不同不同 放射性探针：放射性探针：放射性探针：放射性探针：32323232P P P P、3 3 3 3H H H H、35353535S S S S 非放射性探针：生物素标记非放射性探针：生物素标记非放射性探针：生物素标记非放射性探针：生物素标记 地高辛标记地高辛标记地高辛标记地高辛标记 荧光标记荧光标记荧光标记荧光标记 DNA DNA探针探针1.1.1.1.克隆在质粒载体中，可以无限增殖，制备简便。克隆在质粒载体中，可以无限增殖，制备简便。克隆在质粒载体中，可以无限增殖，制备简便。克隆在质粒载体中，

5、可以无限增殖，制备简便。2.2.2.2.不易降解。不易降解。不易降解。不易降解。3.3.3.3.标记的方法较成熟多样（切口平移等）标记的方法较成熟多样（切口平移等）标记的方法较成熟多样（切口平移等）标记的方法较成熟多样（切口平移等）cDNA cDNA 探针探针1.1.1.1.互补于互补于互补于互补于 mRNA mRNA mRNA mRNA 的的的的DNA DNA DNA DNA 分子。分子。分子。分子。2.2.2.2.逆转录合成，不含内含子序列，适宜基因表达的检测。单链比双逆转录合成，不含内含子序列，适宜基因表达的检测。单链比双逆转录合成，不含内含子序列，适宜基因表达的检测。单链比双逆转录合成

6、，不含内含子序列，适宜基因表达的检测。单链比双链灵敏度高，且不需变性，使能与靶链灵敏度高，且不需变性，使能与靶链灵敏度高，且不需变性，使能与靶链灵敏度高，且不需变性，使能与靶mRNAmRNAmRNAmRNA结合的探针浓度提高。结合的探针浓度提高。结合的探针浓度提高。结合的探针浓度提高。cRNAcRNA探针探针1.1.1.1.单链分子，杂交反应效率高。单链分子，杂交反应效率高。单链分子，杂交反应效率高。单链分子，杂交反应效率高。2.2.2.2.可控制转录方向，得到同义可控制转录方向，得到同义可控制转录方向，得到同义可控制转录方向，得到同义RNA RNA RNA RNA 探针（与探针（与探针（与探

7、针（与mRNAmRNAmRNAmRNA同序列），或反义同序列），或反义同序列），或反义同序列），或反义RNA RNA RNA RNA 探针（探针（探针（探针（cRNAcRNAcRNAcRNA，与与与与mRNAmRNAmRNAmRNA 互补）。互补）。互补）。互补）。3.3.3.3.可检测可检测可检测可检测DNA DNA DNA DNA 和和和和mRNAmRNAmRNAmRNA，还可观察基因的转录状况。还可观察基因的转录状况。还可观察基因的转录状况。还可观察基因的转录状况。4.4.4.4.易于降解，标记方法复杂。易于降解，标记方法复杂。易于降解，标记方法复杂。易于降解，标记方法复杂。寡核苷酸探针

8、寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针1.1.1.1.链短、分子量小、序列复杂度低，杂交时间比克隆探针短。链短、分子量小、序列复杂度低，杂交时间比克隆探针短。链短、分子量小、序列复杂度低，杂交时间比克隆探针短。链短、分子量小、序列复杂度低，杂交时间比克隆探针短。2.2.2.2.可识别靶序列中一个碱基的变化，故成套探针用于碱基点突变的检测。可识别靶序列中一个碱基的变化，故成套探针用于碱基点突变的检测。可识别靶序列中一个碱基的变化，故成套探针用于碱基点突变的检测。可识别靶序列中一个碱基的变化，故成套探针用于碱基点突变的检测。3.3.3.3.一次可大量合成，价格低廉，易于标记。一次可大量合成，价格低廉

9、，易于标记。一次可大量合成，价格低廉，易于标记。一次可大量合成，价格低廉，易于标记。4.4.4.4.缺点：与克隆探针比较，特异性差，杂交信号弱。缺点：与克隆探针比较，特异性差，杂交信号弱。缺点：与克隆探针比较，特异性差，杂交信号弱。缺点：与克隆探针比较，特异性差，杂交信号弱。设计筛选寡核苷酸探针的原则设计筛选寡核苷酸探针的原则1.1.1.1.长长长长30-50bp30-50bp30-50bp30-50bp，长探针则杂交时间长，短则特异长探针则杂交时间长，短则特异长探针则杂交时间长，短则特异长探针则杂交时间长，短则特异性差。性差。性差。性差。2.2.2.2.碱基成分：碱基成分：碱基成分：碱基成分

10、：G G G GC C C C含量为含量为含量为含量为 40%40%40%40%-60%-60%-60%-60%。3.3.3.3.探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针种类探针种类探针种类探针种类 优点优点优点优点 缺点缺点缺点缺点 cDNAcDNAcDNAcDNA 1.1.1.1.制制制制备简单备简单备简单备简单 2.2.2.2.放射比活性高放射比活性高放射比活性高放射比活性高 3.3.3.3.信号特异性信号特异性信号特异性信号特异性强强强强 4.4.4.4.杂交体较稳定杂交体较稳定杂交体较稳定杂交体较稳定 1.1.1.1.变变变

11、变性后才能使用性后才能使用性后才能使用性后才能使用 2.2.2.2.要基因克隆要基因克隆要基因克隆要基因克隆 3.3.3.3.组织组织组织组织穿透力差穿透力差穿透力差穿透力差 4.4.4.4.易于退火易于退火易于退火易于退火 cRNAcRNAcRNAcRNA 1.1.1.1.信号特异性信号特异性信号特异性信号特异性强强强强 2.2.2.2.不需不需不需不需变变变变性性性性 3.3.3.3.杂杂杂杂交后可用交后可用交后可用交后可用RNaseRNaseRNaseRNase除去除去除去除去 未未未未杂杂杂杂交的探交的探交的探交的探针针针针 4.4.4.4.杂杂杂杂交体非常交体非常交体非常交体非常稳稳

12、稳稳定定定定 5.5.5.5.不会退火不会退火不会退火不会退火 1.1.1.1.易被易被易被易被RnaseRnaseRnaseRnase降解降解降解降解 2.2.2.2.易吸附于器皿上易吸附于器皿上易吸附于器皿上易吸附于器皿上 3.3.3.3.组织组织组织组织穿透力差穿透力差穿透力差穿透力差 4.4.4.4.需做亚克隆需做亚克隆需做亚克隆需做亚克隆寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸 1.1.1.1.易制备易制备易制备易制备 2.2.2.2.使用方便使用方便使用方便使用方便 3.3.3.3.组织组织组织组织穿透力穿透力穿透力穿透力强强强强 4.4.4.4.不需做克隆不需做克隆不需做克隆不需

13、做克隆 5.5.5.5.不会退火不会退火不会退火不会退火 6 6 6 6.只要知道氨基酸顺序便只要知道氨基酸顺序便只要知道氨基酸顺序便只要知道氨基酸顺序便 可制备探针可制备探针可制备探针可制备探针 1.1.1.1.需核酸合成仪需核酸合成仪需核酸合成仪需核酸合成仪 2.2.2.2.需明确需明确需明确需明确mRNAmRNAmRNAmRNA顺顺顺顺序序序序 3.3.3.3.单单单单碱基碱基碱基碱基错误错误错误错误将影响将影响将影响将影响杂杂杂杂交交交交 4.4.4.4.杂交体不太稳定杂交体不太稳定杂交体不太稳定杂交体不太稳定 五五.探针标记探针标记 探针的标记物分为放射性标记和非放射探针的标记物分为

14、放射性标记和非放射性标记两大类：性标记两大类：放射性标记物一般为放射性标记物一般为125125I I、3535S S或或3232P P；非放射性标记有生物素或地高辛的间接非放射性标记有生物素或地高辛的间接标记，也有标记，也有FITCFITC或者罗丹明对探针分子或者罗丹明对探针分子的直接标记。的直接标记。探针标记方法比较探针标记方法比较1.1.敏感性：放射性探针地高辛探针生物素探敏感性：放射性探针地高辛探针生物素探敏感性：放射性探针地高辛探针生物素探敏感性：放射性探针地高辛探针生物素探针针针针2.2.对人危害性：放射性探针、生物素探针对人危害性：放射性探针、生物素探针对人危害性：放射性探针、生物

15、素探针对人危害性：放射性探针、生物素探针3.3.放射性探针受半衰期限制，不可长期保存。放射性探针受半衰期限制，不可长期保存。放射性探针受半衰期限制，不可长期保存。放射性探针受半衰期限制，不可长期保存。4.4.生物素探针受内源性生物素影响，可致假阳性；生物素探针受内源性生物素影响，可致假阳性；生物素探针受内源性生物素影响，可致假阳性；生物素探针受内源性生物素影响，可致假阳性；地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。探针标记方法探针标记方法 探针标记方法很多，大致分为：探针标记方法很多，大致分为：探针标记方法很多，大致分为：探针标记方法很多，大致分为

16、：引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。*引入法：运用标记好的核苷酸来合成探针；引入法：运用标记好的核苷酸来合成探针；引入法：运用标记好的核苷酸来合成探针；引入法：运用标记好的核苷酸来合成探针；*化学修饰法：采用化学方法将标记物掺入已化学修饰法：采用化学方法将标记物掺入已化学修饰法：采用化学方法将标记物掺入已化学修饰法：采用化学方法将标记物掺入已合成的探针分子中去，或改变探针原有的结合成的探针分子中去，或改变探针原有的结合成的探针分子中去，或改变探针原有的结合成的探针分子中去，或改变探针原有的结构，使之产生特定的化学基团。构，使之产生特定的化学基团。构

17、，使之产生特定的化学基团。构，使之产生特定的化学基团。引入法较化学修饰法更常用，按其整合的方法不同，引入法分为：*缺口平移法 *随机引物法 *末端标记法 *PCR扩增标记法 *RNA体外转录法缺口平移法缺口平移法 原理：利用原理：利用原理：利用原理：利用DNADNADNADNA酶酶酶酶I I I I在双链在双链在双链在双链DNADNADNADNA的各股单链的不同位的各股单链的不同位的各股单链的不同位的各股单链的不同位 置上造成随机切口，再利用大肠杆菌置上造成随机切口，再利用大肠杆菌置上造成随机切口，再利用大肠杆菌置上造成随机切口，再利用大肠杆菌DNADNADNADNA聚合酶进聚合酶进聚合酶进聚

18、合酶进 行行行行53535353修复，将已标记修复，将已标记修复，将已标记修复，将已标记dNTPdNTPdNTPdNTP 掺入到新合成的掺入到新合成的掺入到新合成的掺入到新合成的DNADNADNADNA 链中。链中。链中。链中。随机引物法随机引物法 原理：将长原理：将长原理：将长原理：将长6 6 6 6个核苷酸的寡核苷酸片段（随机引物）与个核苷酸的寡核苷酸片段（随机引物）与个核苷酸的寡核苷酸片段（随机引物）与个核苷酸的寡核苷酸片段（随机引物）与 单链单链单链单链DNADNADNADNA或变性的双链或变性的双链或变性的双链或变性的双链DNADNADNADNA随机互补结合（退火），在随机互补结合（

19、退火），在随机互补结合（退火），在随机互补结合（退火），在 引物的引物的引物的引物的3333羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物，羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物，羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物，羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物，即形成标记的即形成标记的即形成标记的即形成标记的DNADNADNADNA探针。探针。探针。探针。末端标记法末端标记法 原原理理：将将标标记记物物导导入入线线性性DNADNA或或RNARNA的的55端端或或33端端的的一一类类 标记方法。主要分为：标记方法。主要分为：5 5末端标记法，末端标记法，3 3末端标记末端标记 法，法，T4T4聚合酶替代法。聚合酶

20、替代法。五、ISHH基本程序（以检测组织细胞内的mRNA为例）(一）杂交前处理一）杂交前处理 玻片预处理（灭活玻片预处理（灭活玻片预处理（灭活玻片预处理（灭活RnaseRnaseRnaseRnase)切片处理（增强组织通透性和探针穿透性）切片处理（增强组织通透性和探针穿透性）切片处理（增强组织通透性和探针穿透性）切片处理（增强组织通透性和探针穿透性）1.1.玻片预处理（灭活玻片预处理（灭活Rnase)Rnase)玻片置于热肥皂水浸泡玻片置于热肥皂水浸泡玻片置于热肥皂水浸泡玻片置于热肥皂水浸泡4 4 4 4小时以上小时以上小时以上小时以上 自来水自来水自来水自来水 清洗干净置于酸缸中浸泡过夜清洗

21、干净置于酸缸中浸泡过夜清洗干净置于酸缸中浸泡过夜清洗干净置于酸缸中浸泡过夜 清水洗净烘清水洗净烘清水洗净烘清水洗净烘 干干干干 烘箱温度最好在烘箱温度最好在烘箱温度最好在烘箱温度最好在150150150150或以上烤干或以上烤干或以上烤干或以上烤干4 4 4 4小时小时小时小时 以上。以去除任何以上。以去除任何以上。以去除任何以上。以去除任何RNARNARNARNA酶酶酶酶.盖玻片在有条件时盖玻片在有条件时盖玻片在有条件时盖玻片在有条件时 最好用硅化处理最好用硅化处理最好用硅化处理最好用硅化处理,锡箔纸包裹无尘存放锡箔纸包裹无尘存放锡箔纸包裹无尘存放锡箔纸包裹无尘存放.粘附剂粘附剂粘附剂粘附剂

22、:常用的粘附剂多聚赖氨酸溶液。常用的粘附剂多聚赖氨酸溶液。常用的粘附剂多聚赖氨酸溶液。常用的粘附剂多聚赖氨酸溶液。2.2.2.2.切片处理：增强组织通透性和探针穿透性切片处理：增强组织通透性和探针穿透性切片处理：增强组织通透性和探针穿透性切片处理：增强组织通透性和探针穿透性1 1 1 1）充分脱蜡）充分脱蜡）充分脱蜡）充分脱蜡2 2 2 2）防止探针与组织中碱性蛋白静电结合，降低背景）防止探针与组织中碱性蛋白静电结合，降低背景）防止探针与组织中碱性蛋白静电结合，降低背景）防止探针与组织中碱性蛋白静电结合，降低背景 稀酸处理（稀酸处理（稀酸处理（稀酸处理（0.2 0.2 0.2 0.2 mol/

23、l HCL 10minmol/l HCL 10minmol/l HCL 10minmol/l HCL 10min）乙酰化（乙酰化（乙酰化（乙酰化（0.25%0.25%0.25%0.25%乙酸酐乙酸酐乙酸酐乙酸酐10101010minminminmin）3 3 3 3）去污剂：增加组织通透性，利于探针进入）去污剂：增加组织通透性，利于探针进入）去污剂：增加组织通透性，利于探针进入）去污剂：增加组织通透性，利于探针进入 0.01%0.01%0.01%0.01%-0.3%-0.3%-0.3%-0.3%Triton X-100 Triton X-100 Triton X-100 Triton X-10

24、0 15min15min15min15min4 4 4 4）酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露）酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露）酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露）酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露 蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K、链酶蛋白酶、胃蛋白酶链酶蛋白酶、胃蛋白酶链酶蛋白酶、胃蛋白酶链酶蛋白酶、胃蛋白酶 1 1 1 1ugugugug/ml/ml/ml/ml蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K，37373737，15-30min15-30min15-30min15-30min 5 5 5 5）杂交缓冲液孵育：阻断非特异性结合位点）杂交缓冲液孵育：阻断非特异性结合位

25、点）杂交缓冲液孵育：阻断非特异性结合位点）杂交缓冲液孵育：阻断非特异性结合位点 3.3.防止防止RNARNA酶的污染酶的污染 由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNARNARNARNA酶酶酶酶,为为为为防止其污染影响实验结果防止其污染影响实验结果防止其污染影响实验结果防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程都需戴在整个杂交前处理过程都需戴在整个杂交前处理过程都需戴在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套消毒手套消毒手套消毒手套.所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日所有实验用玻

26、璃器皿及镊子都应于实验前一日所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温置高温置高温置高温(160(160(160(160)烘烤以达到消除烘烤以达到消除烘烤以达到消除烘烤以达到消除RNARNARNARNA酶的目的酶的目的酶的目的酶的目的.要破坏要破坏要破坏要破坏RNARNARNARNA酶酶酶酶,其最低温度必需在其最低温度必需在其最低温度必需在其最低温度必需在150150150150左右左右左右左右.（二）（二）杂交反应杂交反应：将杂交液滴于经预杂交处理的组织细胞将杂交液滴于经预杂交处理的组织细胞将杂交液滴于经预杂交处理的组织细胞将杂交液滴于经预杂交处理

27、的组织细胞切片上，加盖硅化的盖玻片，按所要求的温切片上，加盖硅化的盖玻片，按所要求的温切片上，加盖硅化的盖玻片，按所要求的温切片上，加盖硅化的盖玻片，按所要求的温度进行的孵化。度进行的孵化。度进行的孵化。度进行的孵化。杂交液杂交液 1 1 1 1）一定浓度的探针）一定浓度的探针）一定浓度的探针）一定浓度的探针2 2 2 2）高浓度）高浓度）高浓度）高浓度NaNaNaNa+:使杂交率增加，减少静电结合使杂交率增加，减少静电结合使杂交率增加，减少静电结合使杂交率增加，减少静电结合3 3 3 3）硫酸葡聚糖：）硫酸葡聚糖：）硫酸葡聚糖：）硫酸葡聚糖：10%10%硫酸葡聚糖，形成探针混合液基质，硫酸葡

28、聚糖，形成探针混合液基质，对对DNADNA有浓缩作用，可提高杂交的反应速度有浓缩作用，可提高杂交的反应速度1010倍以上，倍以上，但不影响探针的洗脱强度；杂交时常用浓度为但不影响探针的洗脱强度；杂交时常用浓度为5%5%10%10%，但浓度高时会使溶液的粘度增大，不利杂交探，但浓度高时会使溶液的粘度增大，不利杂交探 针的渗透。针的渗透。4 4 4 4）牛血清白蛋白、载体）牛血清白蛋白、载体）牛血清白蛋白、载体）牛血清白蛋白、载体DNADNADNADNA或或或或RNARNARNARNA：阻断非特异阻断非特异阻断非特异阻断非特异 性结合，降低背景。性结合，降低背景。性结合，降低背景。性结合，降低背景

29、。探针浓度探针浓度探针浓度探针浓度：以最低浓度达到与靶核酸的最大饱和结合度以最低浓度达到与靶核酸的最大饱和结合度以最低浓度达到与靶核酸的最大饱和结合度以最低浓度达到与靶核酸的最大饱和结合度 0.5-5.0 0.5-5.0 0.5-5.0 0.5-5.0ugugugug/ml/ml/ml/ml，10-2010-2010-2010-20ulululul/片片片片杂交时间：杂交时间：杂交时间：杂交时间：一般为一般为一般为一般为1620162016201620小时小时小时小时杂交严格度：杂交严格度：杂交严格度：杂交严格度：反应体系中避免非同源性或只有部分同源性的核酸顺序形成反应体系中避免非同源性或只有

30、部分同源性的核酸顺序形成反应体系中避免非同源性或只有部分同源性的核酸顺序形成反应体系中避免非同源性或只有部分同源性的核酸顺序形成杂交复合物的条件。杂交复合物的条件。杂交复合物的条件。杂交复合物的条件。低杂交温度、低甲酰胺的浓度、高离子强度条件下，严格度低，低杂交温度、低甲酰胺的浓度、高离子强度条件下，严格度低，低杂交温度、低甲酰胺的浓度、高离子强度条件下，严格度低，低杂交温度、低甲酰胺的浓度、高离子强度条件下，严格度低，反之严格度高。严格度愈高，杂交反应特异性愈强，但敏感性反之严格度高。严格度愈高，杂交反应特异性愈强，但敏感性反之严格度高。严格度愈高，杂交反应特异性愈强，但敏感性反之严格度高。

31、严格度愈高，杂交反应特异性愈强，但敏感性愈低。愈低。愈低。愈低。(三）杂交后处理三）杂交后处理 目的：除去未参与杂交体形成的过余探针，除去探针目的：除去未参与杂交体形成的过余探针，除去探针目的：除去未参与杂交体形成的过余探针，除去探针目的：除去未参与杂交体形成的过余探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，降低背景，与组织标本之间的非特异性结合，降低背景，与组织标本之间的非特异性结合，降低背景，与组织标本之间的非特异性结合，降低背景，有利于有利于信号的检测。信号的检测。盐溶液洗涤：盐浓度由高至低盐溶液洗涤：盐浓度由高至低盐溶液洗涤：盐浓度由高至低盐溶液洗涤：盐浓度由高至低 温度温度温度温度

32、由低至高由低至高由低至高由低至高高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。洗涤过程中至少有一次高严格度条件下的洗涤，即洗涤过程中至少有一次高严格度条件下的洗涤，即洗涤过程中至少有一次高严格度条件下的洗涤，即洗涤过程中至少有一次高严格度条件下的洗涤，即低盐、高温、高甲酰胺低盐、高温、高甲酰胺低盐、高温、高甲酰胺低盐、高温、高甲酰胺 (四）杂交显示四）杂交显示 放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影 酶检测系统（酶检测系统（酶检测系统（酶检测系统（HRPHRPHR

33、PHRP、APAPAPAP）(五）对照实验和结果判断五）对照实验和结果判断 组织对照、探针对照、杂交反应对照、检组织对照、探针对照、杂交反应对照、检组织对照、探针对照、杂交反应对照、检组织对照、探针对照、杂交反应对照、检测系统对照测系统对照测系统对照测系统对照 例：例：例：例：将切片应用将切片应用将切片应用将切片应用RNARNARNARNA酶或酶或酶或酶或DNADNADNADNA酶进行预处理后酶进行预处理后酶进行预处理后酶进行预处理后杂交杂交杂交杂交 应用同义应用同义应用同义应用同义RNARNARNARNA探针进行杂交探针进行杂交探针进行杂交探针进行杂交 以不加核酸探针的杂交液进行杂交以不加核酸探针的杂交液进行杂交以不加核酸探针的杂交液进行杂交以不加核酸探针的杂交液进行杂交 组织对照采用已知阴性或阳性组织组织对照采用已知阴性或阳性组织组织对照采用已知阴性或阳性组织组织对照采用已知阴性或阳性组织 用未标记的探针进行杂交用未标记的探针进行杂交用未标记的探针进行杂交用未标记的探针进行杂交 以上方法任选以上方法任选以上方法任选以上方法任选3-43-43-43-4种，综合判断。种，综合判断。种，综合判断。种，综合判断。the end Thank you！