功能基因组研究.ppt

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1、 基基 因因 克隆克隆(GENE CLONING)ZHANG ZHAO-SONG(张兆松张兆松)Department of Pathogenic BiologyNanjing Medical UniversityTel:025-86862774,86862909E-mail:基基因因,在在希希腊腊语语中中是是“给给予予生生命命”之之意意，1909年年，丹丹麦麦生生物物学学家家 W.Johannsen首首先先使使用用名名词词“基基因因”代代替替“遗遗传传因因子子”这这个个术术语语。随随着着遗遗传传学学、分分子子生生物物学学、生生物物化化学学领领域域的的发发展展，人人们们对对基基因因本本性性的的认

2、认识识逐逐渐渐深深入入，基基因因的的概概念念和和涵涵义义也也不不断断地地发发展展和和丰富。丰富。基基 因因 1926年，年，Morgan发表了发表了“基因论基因论”，指出基因，指出基因是在特定的染色体上，而且是呈直线排列在染色体是在特定的染色体上，而且是呈直线排列在染色体上的遗传颗粒上的遗传颗粒，位于同源染色体的同一位置上的相位于同源染色体的同一位置上的相对基因叫做对基因叫做等位基因等位基因。基因是世代相传的，。基因是世代相传的，基因决基因决定遗传性状的表达定遗传性状的表达。1941年年，Beade和和Tatum用用X射射线线照照射射链链孢孢霉霉菌菌使使其其产产生生不不同同的的突突变变株株，他

3、他们们发发现现突突变变可可致致催催化化代代谢谢的的酶酶发发生生变变化化，因因而而提提出出了了“一一个个基基因因一一个个酶酶”的的假假说说。基基因因中中的的突突变变可可导导致致它它所所负责的酶活性的改变负责的酶活性的改变。直直到到1957年年，科科学学家家找找到到了了证证明明该该假假说说的的证证据据。Ingram 通通过过实实验验证证明明，镰镰状状细细胞胞贫贫血血（sickle cell anemia）的的病病因因是是编编码码血血红红蛋蛋白白的的基基因因发发生生了了突突变变，从从而而改改变变了了血血红红蛋蛋白的氨基酸组成白的氨基酸组成。基因的生物学概念阐述了基因的功能基因的生物学概念阐述了基因的

4、功能，如如基因是可遗传的、基因型决定表型、基因呈直基因是可遗传的、基因型决定表型、基因呈直线排列在染色体上、基因在世代相传的行为和线排列在染色体上、基因在世代相传的行为和功能表达上具有相对的独立性等，功能表达上具有相对的独立性等，但尚未阐明但尚未阐明基因究竟是什么？它的物质基础是什么？基因究竟是什么？它的物质基础是什么？随着科学的进步，今天已清楚地知道，随着科学的进步，今天已清楚地知道，基因基因（gene）是）是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的基本单位。物质的基本单位。DNA是遗传的物质基础，是遗传的物质基础，基因位于染色

5、体上基因位于染色体上,实际上是位实际上是位于染色体的于染色体的DNA上。上。基因是基因是DNA大分子的一个个片段，有大分子的一个个片段，有复制、转录等主要的生物学功能，是生物遗传繁殖的物质复制、转录等主要的生物学功能，是生物遗传繁殖的物质基础基础。生物体的生物体的表型表型是通过产生许多特殊的是通过产生许多特殊的蛋蛋白质白质来实现的，而蛋白质由一系列的氨基酸来实现的，而蛋白质由一系列的氨基酸组成，蛋白质的结构和活性由其氨基酸的排组成，蛋白质的结构和活性由其氨基酸的排列顺序来决定。而列顺序来决定。而DNA的核苷酸序列能决定的核苷酸序列能决定组成它所对应蛋白质的氨基酸序列。这种关组成它所对应蛋白质的

6、氨基酸序列。这种关系叫做系叫做遗传密码遗传密码。遗传密码是以三个核苷酸为一组翻译的，遗传密码是以三个核苷酸为一组翻译的，每个三核苷酸叫做一个密码子每个三核苷酸叫做一个密码子（codon），），编码一个氨基酸编码一个氨基酸。一个基因包括一系列从。一个基因包括一系列从固定的起始位点读起并在固定的位点终止固定的起始位点读起并在固定的位点终止的密码子。的密码子。通常按通常按53方向书写方向书写，对应其，对应其蛋白质产物的蛋白质产物的N末端到末端到C末端。在任何确定末端。在任何确定的区域，的区域，DNA只有其中的一条链编码蛋白只有其中的一条链编码蛋白质质。随着分子生物学研究的进展，随着分子生物学研究的进

7、展，基因不是用一段基因不是用一段DNA就可以概括的。就可以概括的。在原核生物中，常见几个结构基因组成一个操在原核生物中，常见几个结构基因组成一个操纵子，发生在结构基因区域的突变可把它们区别纵子，发生在结构基因区域的突变可把它们区别开来。但当突变发生在操纵子的启动子区域或调开来。但当突变发生在操纵子的启动子区域或调控区，则操纵子所控制的所有结构基因都会受到控区，则操纵子所控制的所有结构基因都会受到影响。影响。在真核细胞中，首先转录出的核不均一在真核细胞中，首先转录出的核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA）有）有不同的内含子剪接位点，可通过不同的剪接修饰，

8、不同的内含子剪接位点，可通过不同的剪接修饰，产生两种以上的不同的产生两种以上的不同的mRNA，进而编码不同的，进而编码不同的蛋白质。由于分子生物学技术的发展，如蛋白质。由于分子生物学技术的发展，如DNA分分子克隆、核苷酸序列测定、核酸分子杂交等实验子克隆、核苷酸序列测定、核酸分子杂交等实验手段的不断出现，可从分子水平上研究基因的结手段的不断出现，可从分子水平上研究基因的结构和功能，丰富并深化了对基因本质的认识。构和功能，丰富并深化了对基因本质的认识。还有一大类还有一大类RNA基因基因，如，如rRNA、tRNA、snRNA(small nuclear RNA)基因等，基因等，它们它们只转录生成只

9、转录生成RNA，并不翻译蛋白质，并不翻译蛋白质，就无，就无法从遗传性状来分析它们了。因此，法从遗传性状来分析它们了。因此，现代现代分子生物学的基因概念应该是分子生物学的基因概念应该是：合成有功合成有功能的蛋白质或能的蛋白质或RNA所必需的全部所必需的全部DNA序列序列（除部分病毒（除部分病毒RNA），即一个基因不仅包），即一个基因不仅包括编码蛋白质或括编码蛋白质或RNA的核苷酸序列，还包的核苷酸序列，还包括为保证转录所必需的调控序列。括为保证转录所必需的调控序列。从分子水平来说，基因有从分子水平来说，基因有三个基本特性。三个基本特性。基基 因因 可可 自自 体体 复复 制制 1953年年 Wa

10、tson-Crick 提提出出了了DNA双双螺螺旋旋结结构构模模型型。说说明明了了半半保保留留复复制制机机制制，两两股股DNA彼彼此此分分开开，以以每每一一股股为为模模板板，按按碱碱基基配配对对的的规规则则，各各自配上一股新的自配上一股新的DNA，复制便告完成。，复制便告完成。基基 因因 决决 定定 性性 状状 生生 物物 体体 的的 表表（现现）型型（phenotype）是是指指有有机机体体可可见见的的或或可可计计算算的的外外在在性性质质，而而基基因因型型（genotype）是是指指控控制制这这些些表表型型的的遗遗传传因因子子。生生物物体体的的表表型型是是通通过过产产生生许许多多特特殊殊的的

11、蛋蛋白白质质来来实实现现的的，而而DNA的的核核苷苷酸酸序序列列能能决决定定组组成成它它所所对对应应蛋白质的氨基酸序列。蛋白质的氨基酸序列。这种关系叫做遗传密码。这种关系叫做遗传密码。基基因因突突变变 基基因因通通常常是是一一个个稳稳定定的的遗遗传传单单位位，但但它它也也可可能能发发生生可可遗遗传传的的变变异异，这这种种变变异异叫叫基基因因突突变变（mutation）。突突变变以以后后的的基基因因以以新新的的形形式式稳稳定定遗遗传传。携携带带突突变变基基因因的的生生物物体体叫叫突突变变体体（mutant），携带正常基因的生物体叫携带正常基因的生物体叫野生型野生型（wild type)。（1）原

12、原核核生生物物:一一般般只只有有一一个个染染色色体体，即即核核酸酸分分子子，大大多多数数为为双双螺螺旋旋结结构构，少少数数以以单单链链形形式式存存在在。原原核核生生物物基基因因组组较较小小，如如大大肠肠杆杆菌菌为为4.2106 bp，。因因细细菌菌生生长长迅迅速速，生生长长条条件件易易被被人人为为控控制制，取取材材方方便便，故故原原核核生生物物是是从从分分子子水水平平研研究究生生物物的的遗遗传传特特性性及及信信息息传传递递的的好好素素材材。（2）真真核核生生物物 真真核核生生物物基基因因组组比比原原核核生生物物要要复复杂杂得得多多。其其基基本本特特点点如如下下：基基因因组组中中有有大大量量低低

13、度度、中中度度、高高度度重重复复序序列列；基基因因大大多多数数是是不不连连续续的的，由由编编码码的的外外显显子子与与不不编编码码的的内内含含子子镶镶嵌嵌排排列列而而成成，非非编编码码区区多多于于编编码码区区，约约占占90%以以上上的的DNA序序列列；基基因因不不存存在在操操纵纵子子结结构构，功功能能相相关关的的基基因因也也大大多多分分散散在在不同的染色体上，即使空间位置相近，也分别转录。不同的染色体上，即使空间位置相近，也分别转录。真真核核生生物物基基因因组组DNA大大多多与与蛋蛋白白质质结结合合形形成成染染色色质质，染染色色质质的的基基本本结结构构单单位位为为核核小小体体，其其中中DNA约约

14、占占35%，RNA约约占占5%，其其余余约约60%为为组组蛋蛋白白和和非组蛋白。非组蛋白。病病毒毒既既不不属属原原核核生生物物，也也不不是是真真核核生生物物，它它们们是是一一种种超超分分子子的的亚亚细细胞胞生生命命形形式式，仅仅由由核核酸酸（DNA或或RNA）和和蛋蛋白白质质外外壳壳组组成成，其其繁繁殖殖要要在在寄寄生生细细胞胞内内进进行行，其其遗遗传传机机制制与与寄寄主密切相关。主密切相关。基因根据其产物分为三类基因根据其产物分为三类 第一类第一类 蛋白质基因蛋白质基因 它的最终产物是它的最终产物是蛋白质蛋白质；第二类第二类 RNA基因基因 它的最终产物是它的最终产物是tRNA和和rRNA。

15、第三类第三类 不转录的基因不转录的基因 它不产生任何产物，而对基因表它不产生任何产物，而对基因表达起调节控制作用。达起调节控制作用。基因根据其功能可以分为两类基因根据其功能可以分为两类结构基因结构基因（structural gene）是指某些能决定某种多肽链是指某些能决定某种多肽链（蛋白质）或酶分子结构的基因。结构基因的突变可导致特（蛋白质）或酶分子结构的基因。结构基因的突变可导致特定蛋白质（或酶）一级结构的改变或影响蛋白质（或酶）量定蛋白质（或酶）一级结构的改变或影响蛋白质（或酶）量的改变。的改变。调控基因调控基因（regulator and control gene）是指某些可调是指某些可

16、调节控制结构基因表达的基因。调控基因的突变可以影响节控制结构基因表达的基因。调控基因的突变可以影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。（或酶）量的改变。人类基因包括人类基因包括4个区域个区域 编码区编码区，包括外显子与内含子，包括外显子与内含子前导区前导区，位于编码区上游，相当于，位于编码区上游，相当于mRNA 5末端非编码区（非翻译区）；末端非编码区（非翻译区）；尾部区尾部区，位于，位于mRNA 3编码区下游，相当编码区下游，相当于于3末端非编码区（非翻译区）；末端非编码区（非翻译区）；调控区调控区，包括启动子和增

17、强子等。基因编，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼序列（码区的两侧也称为侧翼序列（flankingsequence）。）。1外显子（外显子（exon）和内含子）和内含子（intron）大多数真大多数真核生物的基因为不连续基因（核生物的基因为不连续基因（interrupted或或discontinuous gene）或割裂基因（）或割裂基因（split gene）。所谓）。所谓割裂基因是指基因的编码序列在割裂基因是指基因的编码序列在DNA分子上是不连续分子上是不连续排列的，而是被不编码的序列所隔开。编码的序列称排列的，而是被不编码的序列所隔开。编码的序列称为外显子，对应于为外显子，

18、对应于mRNA序列的区域，是一个基因表序列的区域，是一个基因表达为多肽链的部分。达为多肽链的部分。不编码的间隔序列称为内含子，内含子只转录，不编码的间隔序列称为内含子，内含子只转录，在前在前mRNA（premRNA）时被剪切掉。）时被剪切掉。如果如果一个基因有一个基因有n个内含子，一般总是把基因的外显个内含子，一般总是把基因的外显子分隔成子分隔成n+1部分。部分。外显子外显子内含子内含子外显子外显子内含子内含子外显子外显子外显子外显子内含子内含子真真核核生生物物中中有有的的结结构构基基因因不不含含有有内内含含子子，如如组组蛋蛋白白基基因因、干干扰扰素素基基因因等等，它它们们大大多多数数以以基基

19、因因簇簇的的形式出现，大多数的酵母结构基因也没有内含子。形式出现，大多数的酵母结构基因也没有内含子。2 外外显显子子和和内内含含子子接接头头 每每个个外外显显子子和和内内含含子子接接头头区区都都有有一一段段高高度度保保守守的的一一致致序序列列（consensus sequence），即即内内含含子子5末末端端大大多多数数是是GT开开始始，3末末端端大大多多数数是是AG结结束束，称称为为GT-AG法法则则，是是普普遍存在于真核基因中。遍存在于真核基因中。3侧侧翼翼序序列列 在在第第一一个个外外显显子子和和最最末末一一个个外外显显子子的的外外侧侧是是一一段段不不被被翻翻译译的的非非编编码码区区，称

20、称为为侧侧翼翼序序列列。侧侧翼翼序序列列中中存存在在基基因因调调控控序序列列，对对基基因因的的活活性有重要影响。性有重要影响。4启启动动子子 启启动动子子（promoter）是是基基因因中中一一段段能能结结合合RNA聚聚合合酶酶的的DNA序序列列，由由于于它与它与RNA聚合酶的结合，由此开始聚合酶的结合，由此开始转录转录。(1)TATA框框（TATA box）：其其 一一 致致 序序 列列 为为TATATAA。它它 约约 在在 基基 因因 转转 录录 起起 始始 点点 上上 游游 约约-3050bp处处，基基本本上上由由A-T碱碱基基对对组组成成，是是决决定定基基因因转转录录起起始始点点的的选

21、选择择，为为RNA聚聚合合酶酶的的结结合合处处之之一，一，RNA聚合酶与聚合酶与TATA框结合才能开始转录。框结合才能开始转录。（2）CAAT框框（CAAT box）：其一致序列为）：其一致序列为GGTCAATCT，是真核生物常有的调节区，位于，是真核生物常有的调节区，位于转录起始点上游转录起始点上游-80100bp处，可能也是处，可能也是RNA聚合聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。（3）GC框框（GC box）：有两个拷贝，位于）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录组成，是一个转录调控区，有激活转录调控的

22、功能调控区，有激活转录调控的功能。5增增强强子子 增增强强子子（enhancer）也也是是一一段段DNA序序列列，该该序序列列能能提提高高该该基基因因分分子子存存在在的的某某段段DNA的的转转录录活活性性。在在真真核核基基因因转转录录起起始始点点的的上上游游或或下下游游一一般般都都有有增增强强子子，增增强强子子可可与与特特异异性性细细胞胞因因子子结结合合而而促促进进转转录录的的进进行行。研研究究表表明明，增增强强子子通通常常有有组组织织特特异异性性，这这是是因因为为不不同同的的细细胞胞核核有有不不同同的的特特异异性性因因子子与与增增强强子子结结合合，从从而而对对基因表达有组织、器官、时间不同的

23、调节作用。基因表达有组织、器官、时间不同的调节作用。6终终止止子子 在在一一个个基基因因的的末末端端往往往往有有一一段段特特定定顺顺序序，它它具具有有转转录录终终止止的的功功能能，这这段段终终止止信信号号的的顺顺序序称称为为终终止止子子（terminator）。终终止止子子的的共共同同顺顺序序特特征征是是在在转转录录终终止止之之前前有有一一段回文顺序，约有段回文顺序，约有720核苷酸对。核苷酸对。在回文序列的下游有在回文序列的下游有68个个A-T对，因此，这段对，因此，这段终止子转录后形成的终止子转录后形成的RNA具有发夹结构，并具有具有发夹结构，并具有与与A互补的一串互补的一串U，因为，因为

24、A-U之间氢键结合较弱，之间氢键结合较弱，因而因而RNA/DNA杂交部分易于拆开，这样的转录物杂交部分易于拆开，这样的转录物从从DNA模板上释放出来是有利的，模板上释放出来是有利的，也可使也可使RNA聚聚合酶从合酶从DNA上解离下来，实现转录的终止上解离下来，实现转录的终止。基基 因因 克克 隆隆 基因克隆基因克隆 人人类类基基因因组组全全序序列列的的阐阐明明将将绘绘出出一一篇篇密密码码图图谱谱，随随后后需需要要了了解解的的是是：哪哪一一段段序序列列编编码码哪哪一一个个基基因因？这这一一基基因因在在体体内内功功能能是是什什么么？一一个个生生物物学学功功能能需需要要哪哪几几个个基基因因的的协协同

25、同作作用用？它它们们又又是是如如何何协协调调控控制制着着生生命命的的正正常常活活动动的的？以以及及哪哪些错误会导致各种病理现象的产生？。些错误会导致各种病理现象的产生？。基因克隆基因克隆 这这一一系系列列艰艰巨巨的的、极极富富挑挑战战性性的的解解码码工工作作促促使使我我们们进进入入了了功功能能基基因因组组研研究究时时代代。这中间最基础的工作是这中间最基础的工作是基因克隆基因克隆。基因克隆基因克隆1972年年,美国学者美国学者 Berg P等人首次在体外进等人首次在体外进行行 DNA的重组研究的重组研究,成功地构建成第一个成功地构建成第一个人工人工 DNA分子。分子。1973 年年,Cohen

26、S等人将等人将带有四环素抗性表型的质粒带有四环素抗性表型的质粒 pSC101 和带有和带有新霉素抗性的质粒新霉素抗性的质粒R6-3 分别用分别用 Eco RI 酶切酶切后后,在体外将两者连接起来在体外将两者连接起来,然后将连接产物然后将连接产物导入大肠杆菌导入大肠杆菌,成功地进行了无性繁殖成功地进行了无性繁殖,并得并得到了既抗四环素又抗新霉素的大肠杆菌到了既抗四环素又抗新霉素的大肠杆菌,从从而完成了而完成了DNA体外重组和扩增体外重组和扩增,基因工程这基因工程这门新兴学科也就应运而生。门新兴学科也就应运而生。基因克隆基因克隆基因工程所采用的基本技术被称为基因工程所采用的基本技术被称为 DNA体

27、外体外重组技术重组技术,也被称为基因克隆或分子克隆技术。也被称为基因克隆或分子克隆技术。基因工程是指在体外条件下基因工程是指在体外条件下,人工将人工将DNA分子分子“剪切剪切“并重新并重新“拼接拼接”,形成一个新的杂合形成一个新的杂合DNA分子分子,然然后将它导入微生物或真核细胞内后将它导入微生物或真核细胞内,使该分子得到无限使该分子得到无限繁殖繁殖,并可使该基因在细胞中表达并可使该基因在细胞中表达,产生出人类所需产生出人类所需要的基因产物或改造、创造新的生物类型。要的基因产物或改造、创造新的生物类型。基因克隆基因克隆一、一、克隆概念克隆概念：克隆（原指一个亲本细胞产生成千：克隆（原指一个亲本

28、细胞产生成千上万个相同细胞组成群体的过程上万个相同细胞组成群体的过程,clone），也就是），也就是细胞的无性繁殖。细胞的无性繁殖。二、分子克隆的关键技术：二、分子克隆的关键技术：DNA重组技术。该技术重组技术。该技术是基因工程技术的核心。基本操作步骤如图是基因工程技术的核心。基本操作步骤如图1所示所示。目的基因目的基因克隆载体克隆载体连连 接接DNA重组体形成重组体形成含重组子的克隆菌含重组子的克隆菌表达产物表达产物RE消化消化RE消化消化T4 DNA连接酶连接酶转化（转染）宿主细胞转化（转染）宿主细胞诱导表达诱导表达1、获得某一基因或、获得某一基因或DNA片片段，将其插入载体段，将其插入载

29、体DNA分分子中，形成一个新的重组子中，形成一个新的重组DNA分子。分子。2、将、将DNA重组体导入受体重组体导入受体细胞（宿主细胞），并在细胞（宿主细胞），并在其中复制保存。其中复制保存。3、阳性重组体细胞的筛选、阳性重组体细胞的筛选和鉴定。和鉴定。T-vector or T-easy vectorExpression vector 外源基因经酶外源基因经酶切插入特定的切插入特定的表达载体表达载体用通用引物测定基因核用通用引物测定基因核苷酸序列苷酸序列在原核或真核细胞中表达在原核或真核细胞中表达SDS-PAGE表达水平测定表达水平测定纯化产物纯化产物Western blot免疫反应性鉴定免疫

30、反应性鉴定免疫原性鉴定免疫原性鉴定分子筛分子筛反相层析反相层析亲和层析亲和层析功能性鉴定功能性鉴定活性鉴定活性鉴定外源基外源基因因PCR product 基因克隆基因克隆三、三、基因克隆所需的生物材料基因克隆所需的生物材料1、RNA（mRNA）、）、DNA抽提试剂盒抽提试剂盒2、cDNA合成试剂盒合成试剂盒3、工具酶：、工具酶：（1）限限制制性性内内切切酶酶（restriction endonucleases，RE）是是一一类类能能识识别别和和切切割割双双链链DNA分分子子内内特特定定碱碱基基序序列列的的核核酸酸内内切切酶酶，也也是是原原核核细细胞胞所所特特有有的的酶酶。只只有有II型型内内切

31、切酶酶在在分子生物学中应用。分子生物学中应用。各型限制性核酸内切酶特征各型限制性核酸内切酶特征切割位点切割位点甲基化作用甲基化作用限制作用是否需要限制作用是否需要ATPI 型型非特定在识别序列前后非特定在识别序列前后100-1000 bP范围内范围内有有需要需要II 型型特定特定在识别序列中或近处在识别序列中或近处无无不需不需III-型型特定特定在识别序列在识别序列3端端25-27bp处处有有需要需要影响影响限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶酶解反应的因素酶解反应的因素1.DNA纯度纯度,DNA纯度高纯度高,酶解效率也高。酶解效率也高。2.DNA分子的结构和构型分子的结构和构型,环状超螺旋环状超螺旋DNA的酶解效的酶解效率低率低 于线型于线型DNA,限制酶识别序列中核苷酸的甲基化将阻限制酶识别序列中核苷酸的甲基化将阻止限制酶的切割止限制酶的切割;3.反应体系反应体系,包括缓冲糸统、包括缓冲糸统、pH值、值、Mg离子浓度、离子浓度、NaCl浓度等浓度等.4.温度和时间温度和时间,一般为一般为370C;在保证限制酶切割效率前在保证限制酶切割效率前提下提下,尽量避免长时间酶解反应尽量避免长时间酶解反应,5.酶及酶量酶及酶量,高质量的酶及不使用过高的酶浓度高质量的酶及不使用过高的酶浓度,防防止杂酶活性的产生。止杂酶活性的产生。