凝胶电泳技术.ppt

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1、凝胶电泳技术 电泳（电泳（electroghoresis）：带电物质在电场中向相反电）：带电物质在电场中向相反电极移动的现象极移动的现象。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支对

2、流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。减少了扩散和对流等干扰作用。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶。蛋白质电泳主要使用

3、聚丙烯酰胺凝胶。电泳的基本原理：电泳的基本原理：在电场中，推动带电质点运动的力（在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点）等于质点所带净电荷量（所带净电荷量（Q）与电场强度（）与电场强度（E）的乘积。）的乘积。FQE质质点的前移同样要受到阻力（点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形）的影响，对于一个球形质点，服从质点，服从Stoke定律，即：定律，即：F6r式中式中r为质点半为质点半径，径，为介质粘度，为介质粘度，为质点移动速度，当质点在电场中为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：作稳定运动时：FF即即QE6r球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所球形质点的迁移率，首

4、先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。迁移率。电泳迁移率（电泳迁移率（m）是指在单位电场强度）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度）时带电分子的迁移速度迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。的大小和缓冲液的粘度成反比。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。作用下向正

5、极泳动。DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。泳动率就不同，从而分出不同的区带。为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应，为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应，增加分子筛效应。增加分子筛效应。常用的凝胶电泳有两类常用的凝胶电泳有两类：琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分子子。聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。分子。一、影响凝胶电泳迁移率的

6、因素一、影响凝胶电泳迁移率的因素（一）样品的物理性质（一）样品的物理性质1、分子大小、分子大小线状双链线状双链DNA分子长度（碱基对数目分子长度（碱基对数目bp）的对数）的对数（log10）与迁移距离成反比，以此来测定）与迁移距离成反比，以此来测定DNA片段片段（线性双链）的分子量准确且方便。（线性双链）的分子量准确且方便。EB嵌合使迁移率下降嵌合使迁移率下降15%。当当DNA分子大小超过分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离大小，因此，就用琼脂糖

7、凝胶电泳分离DNA时，分子时，分子大小不宜超过此值。大小不宜超过此值。2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同，、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同，其迁移率也不同。其迁移率也不同。DNA分子的空间构型分子的空间构型对泳动率的影响很大，比对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状共价闭合环状DNA（covalentlyclosecircularDNA，cccDNA，超螺旋构型）超螺旋构型）lDNA（linearform，线型，质粒，线型，质粒的两条链均断裂；线性分子）的两条链均断裂；线性分子）ocDNA（开环（开环DNA，ope

8、ncircularDNA，ocDNA，它的双链中的一条它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口）。口）。但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。3、带电量：核酸分子是两性解离分子，、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而时，碱基所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而时，碱

9、基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。致相同，因此对泳动速度影响不大。4、碱基组成：、碱基组成：对迁移率影响不明显，单链对迁移率影响不明显，单链DNA形成形成发头结构，影响迁移率，单链（发头结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链）小于双链DNA（1kb）(二二)支持物介质（种类和浓度）支持物介质（种类和浓度）核酸核酸电泳电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一

10、种聚合链线性分子。含有不同两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（由丙烯酰胺（Acr）在）在N,N,N-四甲基乙四胺（四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂联剂N,N-亚甲双丙烯酰胺（亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其）交叉连接而成，其网孔的大小由网孔的大小由Acr与与Bis的相对比例决定。的相对比例决定。

11、凝胶浓度凝胶浓度浓度越小，孔径越大，浓度越大，孔径浓度越小，孔径越大，浓度越大，孔径越小越小。不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围浓度度%（W/VW/V）线状状DNADNA分子的有效分分子的有效分离范离范围（kbkb）0.3560 0.61200.70.8100.90.571.20.46 1.51.23 2.00.12 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺浓度浓度有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯青二甲苯青FF溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.06040016045

12、12.040200702015.025150601520.061004512（三）电场强度（三）电场强度电场强度是指单位长度（电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。）的电位降，也称电势梯度。1-5V/cm（低压），低压时，线性（低压），低压时，线性DNA迁移率与电压成迁移率与电压成正比，而对于大片段电泳，甚至用电泳过夜。正比，而对于大片段电泳，甚至用电泳过夜。电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小。离范围随着电压增大而减小。高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降：因为高电压影响凝胶的分离范围，使分辨

13、率下降：因为随电压上升，不同长度随电压上升，不同长度DNA泳动的增加程度不同，泳动的增加程度不同，凝胶有效分离范围随电压上升而下降凝胶有效分离范围随电压上升而下降。高压电泳（高压电泳（20-600V/cm20-600V/cm（电场强度）（电场强度）,1000-2000V,1000-2000V（电压）（电压）,必须用必须用PAGPAG作介质。作介质。（四）电泳缓冲液（种类、（四）电泳缓冲液（种类、pH、离子强度）、离子强度）1、pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动

14、。2、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电颗粒泳动慢颗粒泳动慢；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使DNA变变性。性。3、种类、种类：TAE（Tris、醋酸、醋酸、EDTA）：缓冲能力差，电流大易发）：缓冲能力差，电流大易发热，长时间使用阴极为碱性热，长时间使用阴极为碱性，阳极为酸性，阳极为酸性，需要循环使，需要循环使两极的两极的pH一致；但价格便宜。一致；但价格便宜。TBE（Tris、硼酸、硼酸、EDTA）：缓冲能力强。首选）：缓

15、冲能力强。首选TBE。TPE（Tris磷酸，磷酸，EDTA）：缓冲能力强，但回收）：缓冲能力强，但回收DNA易与易与DNA一起沉淀，影响酶反应。一起沉淀，影响酶反应。TNE（Tris醋酸钠，醋酸钠，EDTA）：电流大，适合于长时间低）：电流大，适合于长时间低压电泳，分辨率高。压电泳，分辨率高。在缓冲液中加入在缓冲液中加入EDTAEDTA，可以鳌合二价离子，抑制，可以鳌合二价离子，抑制DNaseDNase，保护保护DNADNA。TBE一般配一般配10或或5的贮存液，都以的贮存液，都以1TBE作为作为使用液进行琼脂糖凝胶电泳。但使用液进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5的使用液已具备足的使用液已具备足够的

16、缓冲容量；进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液够的缓冲容量；进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1TBE以提供足够的缓冲容量。以提供足够的缓冲容量。TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存问题，可在室温下用玻璃瓶保存5溶液或高压灭菌。溶液或高压灭菌。DNA电泳带模糊的原因：电泳带模糊的原因：1)DNA降解，应降解，应避免核酸酶污染；避免核酸酶污染；2)电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强电泳缓冲液多次使用后，离子强度降

17、低，度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液；泳效果。建议经常更换电泳缓冲液；3)所用电泳条件不合适所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过电泳时电压不应超过20V/cm，温度，温度30；巨大；巨大DNA链电泳，温度应链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力；4)DNA上样量过多上样量过多减少凝胶中减少凝胶中DNA上样量；上样量；5)DNA样含盐过高样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐；电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐；6)有蛋白污染有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白；电泳前酚

18、抽提去除蛋白；7)DNA变性变性电泳前勿加热，用电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释缓冲液稀释DNA。二、核酸电泳的指示剂与染色剂二、核酸电泳的指示剂与染色剂核核酸酸电电泳泳常常用用的的指指示示剂剂有有两两种种，溴溴酚酚蓝蓝（bromophenolblue,Bb）呈呈蓝蓝紫紫色色；二二甲甲苯苯晴晴（xylenecyanol,Xc）呈呈蓝蓝色色，它它携携带带的的电电荷荷量量比比溴溴酚酚蓝蓝少少，在在凝凝胶胶中中的的的的迁迁移率比溴酚蓝慢。移率比溴酚蓝慢。在在0.6%、1%、1.4%和和2%琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中，溴溴酚酚兰兰的的迁迁移移率率分分别别与与1Kb、0.6Kb、0.2K

19、b和和0.15Kb的的双双链链线线性性DNA片片段段大大致致相相同同。在在1%和和1.4%琼琼脂脂糖糖中中电电泳泳时时，二二甲甲苯苯青青的的迁迁移移速速率率分分别别与与2Kb和和1.6Kb的的双双链链线线性性DNA大致相似。大致相似。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液组成载样缓冲液（loadingbuffer）。）。载样缓冲液的作用：载样缓冲液的作用：增加样增加样品密度，使其比重增加，以确保品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉均匀沉入加样孔内；入加样孔内；在电泳中形成肉眼可见的指在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳示带，可预测核酸电泳的

20、速度和位置；的速度和位置；使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。配方：配方：将将0.25%0.25%溴酚蓝、溴酚蓝、0.25%0.25%二甲苯青二甲苯青FFFF或分别，或分别，或同时加或同时加入或入或30%30%甘油水溶液，或甘油水溶液，或40%40%（W/VW/V）蔗糖水溶液，或）蔗糖水溶液，或15%15%聚蔗糖聚蔗糖(Ficoll400)(Ficoll400)中。中。（二）染色剂（二）染色剂核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色，目前还有其他不仅安溴化乙锭染色法，其次是银染色，目前还

21、有其他不仅安全的染色剂。全的染色剂。溴化乙锭（溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）最常用）最常用260nm，300nm，360nm，发出，发出590nm橙红色。橙红色。溴化乙锭含有一个可以嵌入溴化乙锭含有一个可以嵌入DNADNA堆积碱基之间的一堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与个三环平面基团。它与DNADNA的结合几乎没有碱基序列特的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.52.5个碱基个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力

22、与上下碱基相互作团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与与DNADNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。染料有所增加。DNADNA吸收吸收254nm254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收合的染料本身吸收302nm302nm和和366nm366nm的光辐射。这两种情况的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm590nm处重

23、新发处重新发射出来。射出来。由于溴化乙锭由于溴化乙锭-DNA-DNA复合物的荧光产率比没有结合复合物的荧光产率比没有结合DNADNA的染料高出的染料高出20-3020-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（化乙锭（0.5ug/ml0.5ug/ml）时，可以检测到少至）时，可以检测到少至10ng10ng的的NDANDA条条带。带。溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNADNA或或RNARNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链其荧光产率

24、也相对较低。事实上，大多数对单链DNADNA或或RNARNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。最低检出量内螺旋产生的。最低检出量100ng100ng染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA（小于（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进）片段时，通常要将染色后的凝胶进行脱色。行脱色。EB存在的情况下，线状存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定）

25、，凝胶应该在无限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况情况下电泳，电泳结束后用下电泳，电泳结束后用EB染色。染色。EB在凝胶或染色液中的浓度为在凝胶或染色液中的浓度为0.5g/ml或或0.1g/ml。注意：注意：EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4下保存下保存。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！是强诱变剂，具有高致癌性！核酸吸收核酸吸收260nm紫外线紫外线，导致，导致DNA的断裂，因此回收的断裂，因此回收DNA应在长波紫外线下观察较好，以减少对应在长波紫外线下观察较好，以减少

26、对DNA的损的损伤伤。荧光易淬灭，注意观察的时期，不要反复在紫外下照荧光易淬灭，注意观察的时期，不要反复在紫外下照射。射。由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。危害人体健康。(1)对于对于EB含量大于含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：的溶液，可如下处理：将将EB溶液用水稀释至浓度低于溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；加入一倍体积的加入一倍体积的0.5mol/LKMnO4，混匀，再加入等，混匀，再加入等量的量的25mol/

27、LHCl，混匀，置室温数小时；，混匀，置室温数小时；加入一倍体积的加入一倍体积的2.5mol/LNaOH，混匀并废弃。，混匀并废弃。（2）EB含量小于含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理：的溶液可如下处理：按按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置放置1小时；小时；用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。银染：银染：银染色液中的银离子银染色液中的银离子(Ag)可与核酸形成稳定的可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛复合物，然后用还原剂如甲醛使使Ag还原成银颗粒，还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主

28、要用于聚丙烯酰胺可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比比EB高高200倍倍.但银染色后，但银染色后，DNA不宜回收。不宜回收。EB的替代物：的替代物：GoldViewDNA染料是一种可代替溴化乙锭（染料是一种可代替溴化乙锭（EB）的新）的新型型DNA染料，使用方法与之完全相同。采用琼脂糖凝染料，使用方法与之完全相同。采用琼脂糖凝胶电泳检测胶电泳检测DNA时，时，GoldView与核酸结合后能产生很与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，在某些波段甚至相当，在某些

29、波段甚至超过超过EB。在在100ml琼脂糖胶溶液中加入琼脂糖胶溶液中加入5lGoldView即即可，亦可在电泳缓冲液中以同样比例稀释后直接使用。可，亦可在电泳缓冲液中以同样比例稀释后直接使用。在紫外灯下双链在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链多聚核酸呈现绿色荧光，而单链多聚核酸链呈红色荧光。因此，链呈红色荧光。因此，GoldView不仅能染双链不仅能染双链DNA，也可用于染也可用于染RNA和单链和单链DNA。GoldViewDNA染料在染料在不同的波长下灵敏度有一定影响，建议使用不同的波长下灵敏度有一定影响，建议使用312nm波长。波长。弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般弱点是

30、它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。条带就会消失。GeneFinder具有安全、灵敏等突出优点，可以代具有安全、灵敏等突出优点，可以代替溴化乙锭替溴化乙锭(EB)作为各种核酸电泳的染色剂。作为各种核酸电泳的染色剂。与强致癌性的与强致癌性的EB不同，不同，GeneFinder?属于花青类染属于花青类染料，毒性很低，使用安全料，毒性很低，使用安全,可有效保护实验操作者和环可有效保护实验操作者和环境。境。GeneFinder?与与dsDNA结合荧光信号可增强结合荧光信号可增强8001000倍，其检测核酸的灵敏度比倍，其检测核酸的灵敏度比EB染色法平均高染色法平均高10

31、倍倍左右，与美国左右，与美国MolecularProbe公司的公司的SYBRGreenI染染料的灵敏度相当。料的灵敏度相当。GeneFinder?染料最大吸收峰为染料最大吸收峰为470nm，与该染料结合的核酸呈现绿色荧光。，与该染料结合的核酸呈现绿色荧光。GelRedTM是美国是美国Biotium公最新研制的一种出色的红公最新研制的一种出色的红色荧光核酸染色剂，适用电泳前凝胶染色和电泳后凝色荧光核酸染色剂，适用电泳前凝胶染色和电泳后凝胶染色。与胶染色。与其它核酸染色剂不同，它具备高灵敏度，其它核酸染色剂不同，它具备高灵敏度，高稳定性，低毒性和多功能等特性。高稳定性，低毒性和多功能等特性。这种染

32、色剂不仅有出色的灵敏度，而且表现出高稳定这种染色剂不仅有出色的灵敏度，而且表现出高稳定性和广泛的适应性和广泛的适应性，可用于电泳前染色性，可用于电泳前染色和电泳后染色和电泳后染色。使用紫外透视器在使用紫外透视器在300nm附近可得到最佳激发效果，附近可得到最佳激发效果，在在595nm附近附近显示红色发射光谱显示红色发射光谱。因此，这种染色。因此，这种染色剂可使用普遍使用的剂可使用普遍使用的300nm紫外透视器得到最佳的激紫外透视器得到最佳的激发光谱。发光谱。与与EB预制凝胶不同的是，预制凝胶不同的是，GelRedTM预制凝胶预制凝胶实质上并没有本底荧光，并且对低分子量的实质上并没有本底荧光，并

33、且对低分子量的DNA片片段也具有极高的灵段也具有极高的灵敏度。敏度。和和EB一样，使用一样，使用GelRedTM制作的预制胶可以制作的预制胶可以长时间贮存确不会降低性能。而长时间贮存确不会降低性能。而SYBRGreen1和和SYBRGold染色剂染色剂却不具备这种特性。当却不具备这种特性。当GelRedTM用于后制凝胶染色剂时，可以在用于后制凝胶染色剂时，可以在30分钟内完全着色，分钟内完全着色，而且因为没有本底色而免去再进行一次脱色或冲洗而且因为没有本底色而免去再进行一次脱色或冲洗的的过程。另外，由于过程。另外，由于GelRedTM的酸碱水解稳定性好，的酸碱水解稳定性好，其染色剂可以批量制备

34、以便日后使用。其染色剂可以批量制备以便日后使用。GelRedTM的另一个重要特性是它比的另一个重要特性是它比EB更安全，更安全，但是价格昂贵。但是价格昂贵。三三凝胶电泳的种类凝胶电泳的种类（一）琼脂糖凝胶（一）琼脂糖凝胶（agarosegel）琼脂糖是从琼脂（琼脂糖是从琼脂（agar)中分离得到，由中分离得到，由1，3连接的连接的吡喃型吡喃型b-D-半乳糖和半乳糖和1，4连接的连接的3，6脱水吡喃型阿脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为半乳糖组成，形成相对分子量为104105的长链。琼的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度

35、降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表表2-1给出了不同浓度凝胶对给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围片段的线性分离范围。由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象象NaClO4NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。盒利用的也是这一原理

36、。随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于）高熔点凝胶，可分离小于1kb的的DNA片段，专用于片段，专用于PCR产物的分析；产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；省实验时间；（4）适用于）适用于DNA大片段的分离。大片段的分

37、离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。机械强度和熔点。（二）聚丙烯胺凝胶电泳（二）聚丙烯胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）宜分离鉴定低分子量蛋白质、）宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于小于1Kb的的DNA片段和片段和DNA序列分序列分析析.其装载的样品量其装载的样品量大，回收大，回收DNA纯度高纯度高.长度仅相差长度仅相差0.2%(即即50

38、0bp中的中的1bp)的核苷酸的核苷酸分子即能分离。分子即能分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺一四甲基乙二胺)和和过硫酸铵的作用下，过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙叉联接而形成凝胶。丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定。烯酰胺的浓度决定。1、非变性聚丙烯酰胺凝胶：、非变性聚丙烯酰胺凝胶

39、：在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要链的长短有关外，更主要的是取决于的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成单链其顺序

40、不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。的构象不同，电泳迁移率也不同。同等大小的同等大小的DNA间的迁移率，由于空间结构影响间的迁移率，由于空间结构影响可相差可相差10%，不能用未变性的聚丙烯胺凝胶电泳判断，不能用未变性的聚丙烯胺凝胶电泳判断DNA的大小。的大小。（2）变性聚丙烯胺凝胶电泳）变性聚丙烯胺凝胶电泳DNA变性：加热、极端变性：加热、极端pH、有机溶剂：尿素或甲酰胺、有机溶剂：尿素或甲酰胺导致导致DNA解链。解链。电泳凝胶中进入变性剂：电泳凝胶中进入变性剂：5M的尿素，使的尿素，使DNA为单链线为单链线性，变性性，变性DNA的移动速度与其碱基组成和序列几乎完的移动

41、速度与其碱基组成和序列几乎完全无关。全无关。可用于可用于DNA序列分析等。序列分析等。聚丙烯胺凝胶电泳优点：聚丙烯胺凝胶电泳优点：（1）分辨率高；）分辨率高；（2）载样量大；）载样量大；1cm 1mm的加样孔加入的加样孔加入10 g分辨率不下降，而琼脂糖分辨率不下降，而琼脂糖0.5cm 1mm加样孔加入加样孔加入100-500ng的的DNA分辨率下降。分辨率下降。（3）回收）回收DNA纯度高；纯度高；（4）机械强度高，韧性好。）机械强度高，韧性好。（三三）脉脉 冲冲 电电 场场 凝凝 胶胶 电电 泳泳(pulsefieldgelelectrophoresis,PFGE)一般琼脂糖凝胶电泳只能分

42、离小于一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过筛孔，变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大，此时凝胶介质的分子筛效应不明显大，此时凝胶介质的分子筛效应不明显DNA分子的迁分子的迁移率不仅与其大小有关，而且还与电场强度有关。如移率不仅与其大小有关，而且还与电场强度有关。如此时改变电场方向，则此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿分子必须改变其构象

43、，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与新的泳动方面伸直，而转向时间与DNA分子大小关系分子大小关系极为密切。极为密切。原理：大于原理：大于20kb的线性双链的线性双链DNA，在琼脂糖凝胶的网，在琼脂糖凝胶的网孔中似蛇行或弯曲孔中似蛇行或弯曲行进，不时寻找合适的空隙，恒行进，不时寻找合适的空隙，恒定单向电场下易定单向电场下易“卡住卡住”走不动。走不动。PFGE施加在凝胶施加在凝胶上至少有两个方向电场（上至少有两个方向电场（45，60，90，120，180）时）时间与电流大小也交替改变，使间与电流大小也交替改变，使DNA分子能够不断调整分子能够不断调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，由于泳动方

44、向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，由于DNA分子越大，在交变电场中每次重新定向所需的时分子越大，在交变电场中每次重新定向所需的时间也越长，迁移率越低，从而达到分离线性大片段间也越长，迁移率越低，从而达到分离线性大片段DNA分子。分子。可以分离可以分离1000kb-5000kb的的DNA片段。片段。反转电场凝胶电泳（反转电场凝胶电泳（Fieldinversiongelelectrophoresis，FIGE）原理同上：原理同上：改变电场方向，则改变电场方向，则DNA分子必须改变其分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与DNA分分子大小关系极为密切。子大小关系极为密切。（四）（四）RNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳方法同方法同DNA，只是用变性的琼脂糖凝胶电泳，甲醛或，只是用变性的琼脂糖凝胶电泳，甲醛或乙二醛电泳，防止乙二醛电泳，防止RNA二级结构的形成二级结构的形成。关键：防止关键：防止RNase的污染，一般用的污染，一般用DEPC（0.1%）焦）焦碳酸二乙酯碳酸二乙酯。