茶多酚对氧化应激损伤脑神经细胞的保护作用(2004_广东自然基金).doc

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1、顺 序 号类 别A申报学科代 码 1C03020703广东省自然科学基金自由申请项目重点项 目 名 称： 茶多酚对氧化应激损伤脑神经细胞的保护作用及机理研究申 请 者： 所 在 单 位： 邮 政 编 码： 通 讯 地 址： 申请者电话： 传 真： 电 子 邮 件： 申 请 日 期： 2004-3-16广 东 省 自 然 科 学 基 金 管 理 委 员 会二一 研 究 内 容 和 意 义摘 要氧化应激与许多疾病的发生有关。在脑神经退行性病变过程中，氧化应激导致细胞内钙稳态失调，能量代谢和信号传导障碍而发生和加重疾病。茶多酚（Tea Polyphenols,TP）是从绿茶中提取的的主要活性成分，具

2、有明显的抗氧化应激作用。本项研究利用经典的氧化剂（如如淀粉样蛋白，神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP），秋水仙碱等）和慢性应激等刺激，建立氧化应激整体和细胞模型，以动物学习记忆和性活动等行为指标，脑内氧化产物和抗氧化酶活性、脑细胞内钙离子浓度和细胞膜流动性等生化检测指标，细胞凋亡等细胞生物学检测指标，进行系统和比较全面的评价茶多酚抗氧化应激与减缓衰老，改善学习记忆功能，调整胞内钙离子平衡和膜流动性，减轻和降低脑细胞损伤的作用关系，为茶多酚用于防治脑神经退行性疾病奠定药理学基础。主题词（主题词应反映研究内容，主题词数量不多于三个，各主题词之间以逗号分隔）氧化应激，脑神

3、经细胞，茶多酚16 二、立论依据请按以下提纲填写：1、研究意义（对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景）2、国内外研究现状3、本项目的创新之处4、主要参考文献及出处（格式：论文作者题目刊名年份卷(期)页码专著作者书名出版者年份）研究意义：氧化应激（oxidative stress）是指机体内氧自由基的产生与清除失去平衡，或外源性氧化剂的过量摄入导致活性氧（reactive oxygen species, ROS）在体内堆积引起细胞毒性1。自由基氧化应激而损伤生物分子包括蛋白质、DNA和脂

4、质过氧化，已涉入人类一些疾病的病因学2。已发现由氧化应激而引起的疾病有：冠心病、心肌缺血再灌注和动脉粥样硬化；神经退行性病；老年性斑变及白内障；糖尿病性微血管疾患；其他如炎症等3，4。其中，实验研究和临床病理检查均发现与衰老相关的中枢神经系统退行性病变，如帕金森病、老年性痴呆及多发性硬化等，它们的发病机制均与氧自由基有一定的关系5。因脑组织的氧代谢率极高，富含多聚不饱和脂肪酸，抗氧化能力低及再生能力差等，与机体其它组织相比脑组织更易遭受氧自由基的损伤6。体内存在氧化防御系统包括SOD、GSH和抗氧化营养素等对抗氧化应激反应，从而两者形成平衡关系。一旦体内产生大量的自由基未能被抗氧化剂所清除，一

5、些重要的酶的功能就会被破坏，导致氧化应激和抗氧化防御间平衡失调，引起细胞膜多价不饱和脂肪过氧化反应。氧化应激和钙稳态失调被认为是神经原损伤死亡的关键因素，它们是急性和慢性神经退行性疾病和细胞死亡的“最后共同通路”（final common pathways）。神经细胞死亡主要是不可控制的大量离子内流和细胞溶解，神经细胞凋亡主要是“死亡基因”表达增加所致。现以确定“死亡基因”的表达增加或大量离子内流入细胞，其元凶仍然是钙稳态失调和自由基生成过多。反过来，各种基因、环境因素会影响神经原的钙稳态和自由基代谢。当细胞内钙离子持续增加，并同时存在自由基时，会出现恶性前馈循环，即钙离子加速自由基生成，或反

6、过来，自由基增加细胞内钙离子堆积3。如淀粉样蛋白（A）在脑内增多时，可刺激脑内胶质细胞释放TNF-，并作用于TNF-受体，产生大量氧自由基，促发细胞凋亡或神经退行性变。同时，A促进Ca2+内流，胞内Ca2+增加，而活化calpain和caspases，促进tau蛋白磷酸化，出现神经纤维缠结、细胞凋亡或退行性变7。近年来研究认为线粒体在调控神经退行性病变过程中起关键作用。线粒体中的遗传基因突变、胞内钙超载、兴奋性氨基酸释放过量、自由基（包括NO）生成过多，均能引起线粒体能量代谢障碍，神经退行性病变的发生和恶化3，8，9。抗氧化剂具有防止脂质过氧化以及清除和/或抑制自由基的作用，从而保护细胞，尤其

7、是脑神经细胞，免受氧化应激的损伤，防止神经退行性疾病的发生。目前，抗氧化剂有内源性和外源性之分，内源性有酶抗氧化剂（超氧化物歧化酶SOD， 谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px， 过氧化氢酶CAT）和预防性抗氧化剂；外源性有天然性（食物性）抗氧化剂和药物性抗氧化剂，其中，首推是维生素E和维生素C，其抗氧化作用强而长期服用安全。食物性抗氧化剂和植物中抗氧化活性物质亦受到重视10。国内外研究现状：茶多酚（Tea Polyphenols,TP）是从绿茶中提取的的主要活性成分，占茶叶干重的30%，包括黄烷醇类、黄烷双醇、黄酮类和酚酸，其中黄烷醇类所占比重最大，占多酚类总量的80%，通常把黄烷醇类称为儿茶素1

8、1。实验表明TP在体内分布非常广泛，可进入全身各种组织，包括脑组织12。并对多种肿瘤，动脉硬化，心肌缺血，高血脂症，糖尿病肾病，皮肤光老化，痴呆症，巴金森症等具有防治作用，以及对免疫功能的调节作用13，14，15，16。其中，对神经退行性疾病的防治作用的研究已引起国内外学者的广泛关注，并开展了相应的研究工作17，18。实验表明TP具有保护肝脏、肾脏和脑免受脂质过氧化损伤作用19，20，呈剂量依赖性对抗短暂性脑缺血诱致脑细胞损伤，对脑神经细胞有保护作用17。对实验性动物脑缺血再灌注损伤的海马组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、Na-KATPase、Ca2+-ATP

9、ase等酶的活性均具有保护作用，同时使丙二醛（ MDA）含量明显下降，并抑制大鼠大脑皮层线粒体脂质过氧化（LPO）反应和降低脑组织磷脂酶A2（PLA2）活性，增加三磷酸腺苷（ATP）酶活性和ATP含量21，22；体内外实验亦表明TP对氧化剂型神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）、1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）和6羟多巴胺（6-OHDA）引起的黑质部位多巴胺能神经元损毁具有明显的保护作用，其机理可能与其抑制NF-kB的移位和活化，增加DA含量和提高酪氨酸羟化酶活性，减少神经细胞对MPP+的摄取有关18,23,24。上述实验提示TP可能通过防止脂质过氧化以及清除

10、和/或抑制自由基的作用，减轻脑组织的损伤25。体外实验表明，TP对A诱致海马神经细胞的神经毒性具有保护作用，可提高神经细胞存活率,降低MDA水平和caspase活性26。TP的抗氧化作用特点是清除游离基或中和各种游离基引起的脂质过氧化27，28，抑制黄嘌呤氧化酶活性29，阻断iNOS和nNOS的诱导作用30，31。临床初试表明TP对老年性痴呆高危人群认知功能减退具有一定的防治作用32。本项目创新之处：我国是茶叶生产大国，如何充分地开发和利用茶叶资源，一直是国家和政府关注的大事。上述国内外有关茶多酚的实验研究，仅侧重于某一点或某个侧面进行研究，缺乏系统的评价资料。本项目的创新之处在于利用经典的氧

11、化剂（A，MPTP,秋水仙碱等）以及慢性应激等刺激造成动物氧化应激和脑神经细胞损伤状态，通过采用整体动物模型和体外培养的大脑皮层细胞，以检测动物行为、生化改变和细胞生物学等变化，系统和比较全面地评价茶多酚对上述氧化应激损伤的脑神经细胞保护作用，并以氧化应激与细胞内钙和膜流动性及脑细胞凋亡的改变作为研究的主要目标，深入的探讨其作用机理。旨在为茶多酚作为防治早老性或血管性脑神经退行性病变的有效药物提供科学的和系统的实验资料，并为临床研究提供动物实验基础。参考文献：1 Simonian NA, Coyle JT. Oxidative stress in neurodegenerative disea

12、ses. Ann Rev Oharmacol Toxicol, 1996,36:83-1062 Maxwell SRJ. Anti-oxidant therapy: does it have a role in the treatment of human disease? Exp Opin Invest Drugs, 1997, 6:2113张均田. 老年痴呆的发病机制及防治药物. 医药导报，2002，21（8）：469-4714 Markesbery WR. Oxidative stress hypothesis in Alzheimers disease. Free Radic Biol

13、 Med, 1997, 23:134 5 Weber GF. The pathophysiology of reactive oxygen intermediates in the central nervous system. Med Hypotheses, 1994, 43:223-2306 Evans PH. Tree radicals in brain metabolism and pathology. Brain Med Bull, 1993, 49:577-5877 Yuan J, Yankner BA. Apoptosis in the nervous system. Natur

14、e, 2000, 407:802-098 Pukr Sundval MP, Wallin C, Gilland E, et al. Impairment of mitochondrial respiration after cerebral hypoxia ischemia in immature rats: relationship to activation of caspase-3 and neuronal injury. Dve Brain Res, 2000, 125(1-2):439 王来栓，于力君，张旭东等. 亚低温对新生大鼠缺氧缺血脑损伤线粒体功能及凋亡的影响. 复旦学报(医学

15、版)2003, 30(2)：95-9810 陈维洲. 抗氧化剂的研究和应用前景，药理学进展，科学出版社（1998）11 Graham HN. Green tea composition, consumption and polyphenol chemistry. Prev Med. 1992, 21(3):334-35012 Suganuma M, Okabe S, Oniyama M, et al. Wide distribution of 3H(-)- epigallocatechin gallate, a cancer preventive tea polyphenol, in mous

16、e tissue. Carcinogenesis, 1998, 19(10):1771-613 Srivastava RC,Husain MM,Hasan SK, et al. Green tea polyphenols and tannic acid act as potent inhibitors of phorbol ester-induced nitric oxide generation in rat hepatocytes independent of their antioxidant properties. Cancer Lett, 2000,153(1-2):1-514Muk

17、htar H,Ahmad N. Tea polyphenols:prevention of cancer and optimizing health. Am J Clin Nutr, 2000,71(6):1698-170215 张素慧，吕俊华，李校坤等. 茶多酚和茶色素对紫外线照射致小鼠皮肤光老化的防护作用. 中国药科大学学报， 2003，34（6）：561-56416 Stoner GD, Mukhtor H. Polyphenols as cancer chemopreventive agents. J.Cell Biochem Suppl, 1995, 22:169-8017 S.R.

18、, Lee, Seong-ll Suh, S.P. Kim. Protective effects of the green tea polyphenol(-)-epigallocatechin gallate against hippocampal neuronal damage after transient global ischemia in gerbils. Neuroscience Letters,2000, 287:191-19418 Yona L, Orly W, Gila M, et al. Green tea polyphenols (-)-epigallocatechin

19、-3-gallate prevents N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridne-induced dopaminergic neurodegeneration. J. Neurochemistry 2001, 78:1073-108219 Lin AM, Chyi BY, Wu LY, et al. The antioxidative property of green tea against iron-induced oxidative stress in rat brain. Chin. J. Physiol, 1998, 41:189-196

20、20 Sano M, Takahashi Y, Yoshino K et al. Effect of tea (camellia sinensis L) on lipid peroxidation in rat liver and kidney: a comparison of green and black tea feeding. Biol. Pharm. Bull, 1995, 18:1006-100821 何冰，陈小夏。茶多酚对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。广西中医药，1997，20（4）：48-5022 何冰，陈小夏。茶多酚清除氧自由基及抑制脑脂质过氧化反应的体外试验。 中国药理学

21、通报，1998，14（3）：270-223 Yona L, Moussa BH Youdim, Gila M, et al. Attenuation of 6-hydroxydopamine(6-OHDA)-induced nuclear factor-kappaB(NF-kB) activation and cell death by tea extracts in neuronal cultures. Biochemi. Pharmacol. 2002, 63:21-2924 Pan TH, Fci J, Zhou XD, et al. Effects of green tea polyp

22、henols on dopamine uptake and on MPP+-induced dopamine neuron injury. Life Sci. 2003, 72:1073-108325 李明阳，谢仁厚，刘波等。茶多酚对D-半乳糖诱导小鼠拟衰老作用的影响。空军总医院学报，2000，16（4）：202-0326 Choi YT, Jung CH, Lee SR et al. The green tea polyphenol(-)-epigallocatechin gallate attenuates -amyloid-induced neurotoxicity in culture

23、d hippocampal neurons. Life Sci. 2001,70:603-1427 Guo Q, Zhao B, Li M, et al. Studies of protective mechanisms of four components of green tea polyphenols against lipid peroxidation in synaptosomes. Biochim. Biophys Acta, 1996, 1304:210-22228 Liu ZQ, Ma LP, Zhou B, et al. Antioxidative effects of gr

24、een tea polyphenols on free radical initiated and photosensitized peroxidation of human low density lipoprotein. Chemistry and Physics of Lipids, 2000, 106:53-6329 Aucamp J, Gaspar A, Hara Y, et al. Inhibition of xanthine oxidase by catechins from tea. Anticancer Res, 1997, 17:4381-8630 Chan MM, Fon

25、g D, Ho CT, et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase gene expression and enzyme actibity by epigallocatethin gallate, a natural product from green tea. Biochem. Pharmacol, 1997, 54:1281-128631 Lin YL and Lin JK. (-)-epigallocatethin 3-gallate block the induction of nitric oxide synthase

26、by down-regulating ipopolysaccha ride-induced activity of transcription factor nuclear factor-kB. Mol. Pharmacol, 1997, 52:465-47232 严镭，吴森，王树声.茶多酚对老年性痴呆早期防治的研究.浙江中西医结合杂志，2001，11（9）：538-40三、研究方案. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：在有关茶多酚国内外研究的基础上，采用经典的氧化剂，如淀粉样蛋白，神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP），秋水仙碱等和慢性应激等刺激，建立氧

27、化应激整体和细胞模型，以动物学习记忆等行为指标，脑内氧化产物和抗氧化酶活性、脑细胞内钙离子浓度和细胞膜流动性等生化检测指标，细胞凋亡等细胞生物学检测指标，系统和比较全面的评价茶多酚抗氧化应激作用与改善动物学习记忆功能，改善脑细胞内钙离子浓度和膜流动性，减轻和降低脑细胞损伤的程度，提供脑细胞的保护作用及可能的作用机理，为茶多酚用于防治脑神经退行性疾病提供动物实验资料，并为茶叶的开发和利用拓宽医药市场。研究内容：1）整体实验氧化应激动物模型的建立 A（25-35）侧脑室注射模型 神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）动物模型 脑缺血损伤模型 应激性性行为缺损模型（悬吊应激

28、模型）2）大脑皮层细胞氧化应激模型的建立 原代大脑皮层细胞培养 A（25-35）、1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）、秋水仙碱诱致皮层细胞损伤模型3）茶多酚对上述氧化应激模型的保护作用 对氧化应激动物学习记忆和性功能等行为活动的影响；检测方法：采用小鼠穿梭实验，Morris水迷宫，跳台法，避暗法及自主活动的测定等方法。 对氧化应激动物脑内和血清氧化产物和抗氧化酶活性（NO,NOS,MDA,LPO，SOD,CAT,GSH-Px,AchE等）的影响； 对氧化应激动物脑细胞和/或红细胞内钙离子浓度和细胞膜流动性的影响； 对应激性动物血清睾丸酮水平的影响； 对抗氧化剂诱致脑神经细胞凋亡和/或死亡的

29、影响；检测方法：采用LDH释放量，MTT比色法，TUNEL法和免疫组织化学等方法。拟解决的关键问题：1） 应激整体动物模型和原代大脑皮层细胞模型的建立；2） 多酚对学习记忆和性行为改善作用与剂量的关系；3） 茶多酚对氧化应激、细胞内钙离子、细胞活性、动物行为改变的影响及其作用关系的探讨；4） 茶多酚用于防治脑神经退行性病变的前景预测。. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1）研究方法：本项研究采用整体实验和原代大脑皮层细胞培养技术，以A（25-35）、MPTP、MPP+、秋水仙碱、脑动脉结扎和悬吊应激等刺激，造成动物和脑神经细胞处于氧化应激状态，并诱致脑神经细胞损伤和出现相应的行

30、为和生化等方面的改变，建立相应的氧化应激模型。利用此模型进行茶多酚的抗氧化应激作用的药效学研究，具体方法如下： 行为检测：以Morris水迷宫、跳台法、避暗法作为改善学习记忆的评价方法；以舔、跨骑、交配等作为性行为评价方法。 生化检测：参照文献1，2测定脑组织内ChAT和AchE的活性；采用硫代巴比妥酸法测定MDA；黄嘌呤氧化法测定SOD；DTNB法测定GSH-Px；Abei法测定CAT；蛋白定量采用Lowry法。 细胞内钙离子和膜流动性测定：采用Fura-2/AM法3（荧光分光光度计）。 细胞活性检测：测定LDH释放量；MTT比色法。 细胞凋亡检测：采用TUNEL法或流式细胞仪。参考文献：1

31、. Chao LP. Spectrophotometric determination of choline acetyltransferase in the presence of dithiothreitol. Anal Biochem, 1978, 85(1):20-242. Wolfgam F. Spectrophotometric assay for choline acetyltransferase. Anal Biochem, 1972, 16(1):114-1183. 张均田. 用Fura-2/AM测定细胞内游离Ca2+浓度的方法. 中国药学杂志， 1991， 26：112）技

32、术路线： 整体动物实验：a组：小鼠侧脑室注入A（25-35）4nmol参照Haley方法（A模型）b组：小鼠ip MPTP，30mg.kg-1/12h，共4次（MPTP模型）c组：小鼠戊巴比妥麻醉，颈动脉夹住缺血5min，松开恢复血液再灌注（缺血再灌注模型）d组：小鼠尾朝上头朝下悬吊于水面，每天1次，连续10天，循序增加应激强度（应激模型） 茶多酚处理14d后 学习记忆能力和性行为活动测试 动物断头取脑，冰浴上剥离皮层和海马组织 称重 （b组取黑质切片染色，d组取血测睾丸酮水平） 10%匀浆 加入磷酸钾缓冲液50mmol.L-1 加入DMEM培养液 冰浴 测MDA、SOD 10%组织匀浆（Lo

33、wrry法测蛋白）CAT、 GSH-Px 制成组织匀浆 离心，去上清 测定ChAT和AchE活性 胰酶370C消化20min 100目尼龙网过滤 加入15%小牛血清DMEM 370C，10min终止酶解 加入Fura-2/AM(5mm/L) 370C，孵育50min Hanks 液洗2次 悬浮（Fura-2/AM最终浓度为110mol/L） EX335nm及EX385nm 荧光强度 以CaI=kd(F-Fmin)/(Fmax-F)计算出钙离子浓度 取106细胞.ml-1细胞悬液3ml+终浓度为10mol/L的DPH 370C，恒温震荡15minPBS洗1次 悬浮于PBS3ml中 荧光光度计测量

34、测定细胞膜流动性(荧光偏振度、各向异性、微粘度)此外，上述各组可采用TUNEL方法，测定相应脑部位细胞凋亡数目；b组可采用免疫组织化学方法检测TH阳性神经细胞数。 原代大脑皮层细胞培养氧化应激模型 取新生24h内Sprague-Dawley大鼠，断头取脑 Krebs液中分离大脑皮层、剪碎 0.125%胰蛋白酶的Krebs液，370C水浴消化17min 加入等体积胰酶抑制剂终止消化 取上清，1000rpm离心5min 取上清，EDEM培养基洗涤沉淀 离心1000rpm, 5min 去上清，沉淀加入DMEM混匀，稀释细胞浓度为106/ ml CO2培养箱，预温18min 取上清接种于poly-L-

35、lysine的35mm培养皿 5% CO2，370C 24h 换成2%B27无血清培养基 培养至第6天（破伤风内毒素染色，免疫荧光法进行神经原鉴定） 按实验设计细胞分组及药物干预： a. 0.1M秋水仙碱；0.1M秋水仙碱+EGCG (5M、10M、20M) b. A（25-35）50M; A（25-35）50M+ EGCG (5M、10M、20M) c. MPP+100M; MPP+100M+ EGCG (5M、10M、20M) EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）：为茶多酚的主要活性成分之一。 24小时后 检测：细胞活性测定LDH释放量；MTT比色法；NO测定；Hoechst 33258染

36、色与TUNEL法 细胞膜流动性检测见整体实验方法 细胞内钙离子浓度检测见整体实验方法3）实验方案 动物： NIH小鼠，体重30g以上，雌雄各半，正常饲养1周后，进行分组实验；Sprague-Dawley大鼠，出生18-24h内取脑，用于皮层脑神经细胞培养。 实验分组：整体动物实验分为正常对照组（生理盐水）；模型对照组（给予相应的溶媒）；茶多酚组（高、中、低三个剂量组）；阳性对照组（维生素E或其他抗氧化剂）。离体细胞培养试验细胞分为对照组及药物干预组，其中茶多酚组以其主要活性成分单体（EGCG）进行药物干预。 动物造模：整体动物实验采用小鼠icv A（25-35）4nmol；ip MPTP，30

37、mg.kg-1/12h，共4次；颈动脉夹住缺血5min，松开恢复血液再灌注；悬吊应激等刺激形成氧化应激动物模型。大脑皮层神经细胞采用0.1M秋水仙碱、A（25-35）50M、MPP+100M等氧化剂进行细胞氧化应激损伤，并进行茶多酚的药效学评价。 标本采集：行为实验检测后，立即进行取样（取血和不同部位的脑组织）测定。如一个动物需要多部位取样时，可将大脑分为各半，用于不同测定需要，或增加动物例数来完成。 检测指标和方法：见研究方法。 统计学分析：计量资料采用方差分析；记数资料采用2检验；等级资料采用议和检验，多因素相关回归分析。P0.05时，差异具有显著性。4）可行性分析： 前期工作完成茶多酚和

38、茶色素抗紫外线照射致皮肤光老化作用的研究和目前正在进行的茶多酚抗氧化应激作用与早老性痴呆的防治作用的研究，具有完成本项研究良好的工作基础； 通过大量、详细、全面的查阅国内外有关茶多酚研究方面的资料，研究方向明确； 动物建模和指标测试及细胞培养等技术方法比较成熟； 课题组人员由教授、博士、硕士等组成，人员结构合理； 实验中所需仪器设备和药品试剂均可由本院或本研究室提供，特殊研究药品和试剂均可购得。3. 年度研究计划及预期进展第一阶段（2005.1-2005.6）（1）建立整体氧化应激动物实验模型（2）建立原代大脑皮层细胞氧化应激模型（3）预实验第二阶段（2005.7-2005.12）（1）茶多酚

39、对A（25-35）、MPTP、脑缺血、慢性应激等诱致动物学习记忆和性行为影响的检测；（2）茶多酚对上述刺激引起的脑内和血浆中氧化产物、抗氧化酶、胆碱脂酶、血浆睾丸酮水平和活性影响的测定；（3）茶多酚对上述应激刺激动物脑神经细胞和红细胞内钙离子水平和细胞膜流动性影响的测定；（4）茶多酚对上述氧化应激所致动物脑神经细胞凋亡影响的测定。（5）整理实验资料，发表研究论文。第三阶段（2006.1-2006.10）（1）茶多酚对A（25-35）、MPP+、秋水仙碱致原代大脑皮层细胞的细胞活性影响的测定；（2）茶多酚对上述刺激致原代大脑皮层细胞内钙离子浓度和细胞膜流动性影响的测定。（3）整理实验资料，发表研

40、究论文。第四阶段（2006.11-2006.12） 整理、总结和汇报全部实验研究工作，并在此研究工作的基础上，继续申报国家自然科学基金委研究项目。四、研究条件与基础. 已取得的研究工作成绩及与本项目有关的研究工作积累（对于自由申请项目，请着重填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累和近五年的主要研究业绩）本项目负责人近年来主要完成由杨美玲教授主持的省科技厅项目NO天然供体亚硝基白蛋白的合成和临床研究和省卫生厅项目红丝线草总提取物降血压、降血脂的临床前研究，并顺利通过验收。目前，作为项目的负责人之一，参加国家863项目海藻中抗肿瘤和治疗心血管疾病活性化合物的分离与鉴定的研究；并主持省卫生厅项目茶多酚的抗氧化应激作用与早老性痴呆的防治的研究工作。近年内主要发表的研究论文如下：（1）茶多酚和茶色素对紫外线照射致小鼠皮肤光老化的防护作用. 中国药科大学学报， 2003，34（6）：561-564（2）茶色素对紫外线照射致小鼠皮肤光老化的防护效应 中药材，2002，25（1）：29（3）红茶与皮肤疾病关系的研究进展 国外医学皮肤性病学分册，2002，28（1）：20（4）白细胞介素6（IL