高效液相色谱法原理与应用.pptx

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1、会计学1高效液相色谱法原理与应用高效液相色谱法原理与应用21.1.色谱法的定义色谱法的定义色谱法的定义色谱法的定义茨维特的实验茨维特的实验第2页/共136页3 色谱分离效果图第3页/共136页4因此因此n n色谱法是一种色谱法是一种色谱法是一种色谱法是一种分离分离分离分离方法。方法。方法。方法。n n它它它它的的的的特特特特点点点点是是是是：有有有有两两两两相相相相，一一一一是是是是固固固固定定定定相相相相，一一一一是是是是流流流流动动动动相相相相，两相作相向运动。两相作相向运动。两相作相向运动。两相作相向运动。n nChromatographyChromatographyn n将色谱法用于分

2、析中，则称为色谱分析。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。n n色谱分析是一种分离、分析法。色谱分析是一种分离、分析法。色谱分析是一种分离、分析法。色谱分析是一种分离、分析法。第4页/共136页5 2 2、色谱法分离原理、色谱法分离原理、色谱法分离原理、色谱法分离原理n n当流动相中所携带的混合物流过固定相当流动相中所携带的混合物流过固定相当流动相中所携带的混合物流过固定相当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用时，就会和固定相发生作用时，就会和固定相发生作用时，就会和固定相发生作用(力的作用力的作用力的

3、作用力的作用)。由于混合物中各组分在由于混合物中各组分在由于混合物中各组分在由于混合物中各组分在性质和结构性质和结构性质和结构性质和结构上有上有上有上有差异，与固定相发生差异，与固定相发生差异，与固定相发生差异，与固定相发生作用的大小作用的大小作用的大小作用的大小也有差也有差也有差也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组异。因此在同一推动力作用下，不同组异。因此在同一推动力作用下，不同组异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从分在固定相中的滞留时间有长有短，从分在固定相中的滞留时间有长有短，从分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出而按先后

4、不同的次序从固定相中流出而按先后不同的次序从固定相中流出而按先后不同的次序从固定相中流出。第5页/共136页63、色谱法的分类、色谱法的分类n n 按流动相状态的不同，可按流动相状态的不同，可分为分为气相色谱法气相色谱法(GC)液相色谱法液相色谱法(LC)超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)第6页/共136页7什么是气相色谱法什么是气相色谱法？n n以气体为流动相的色谱法以气体为流动相的色谱法以气体为流动相的色谱法以气体为流动相的色谱法n nGas ChromatogaphyGas Chromatogaphy，简称简称简称简称GCGCn n适合分离分析适合分离分析适合分离分析适合分离分析易汽

5、化易汽化易汽化易汽化（在（在（在（在-190-190-500-500范围内有范围内有范围内有范围内有0.2-0.2-10mmHg10mmHg的蒸气压的）的蒸气压的）的蒸气压的）的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应稳定、不易分解、不易反应稳定、不易分解、不易反应稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于的样品，特别适合用于的样品，特别适合用于的样品，特别适合用于同系物、同分异构体同系物、同分异构体同系物、同分异构体同系物、同分异构体的分离。的分离。的分离。的分离。第7页/共136页8应用举例（应用举例（GC）第8页/共136页9什么是液相色谱法？什么是液相色谱法？n n以液体为流动相的色谱法以

6、液体为流动相的色谱法n nLiquid Chromatogaphy，简简称称LCn n适适合合分分离离分分析析高高沸沸点点、热热不稳定、离子型的样品。不稳定、离子型的样品。第9页/共136页10n n按按固固定定相相使使用用的的形形式式可可液液相相色谱法又可分为：色谱法又可分为：柱色谱（柱色谱（柱色谱（柱色谱（Column ChromatographyColumn Chromatography）将固定相装在色谱柱内将固定相装在色谱柱内将固定相装在色谱柱内将固定相装在色谱柱内纸色谱（纸色谱（纸色谱（纸色谱（Paper ChromatographyPaper Chromatography）用滤纸做

7、固定相或固定相载体的色谱用滤纸做固定相或固定相载体的色谱用滤纸做固定相或固定相载体的色谱用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱（薄层色谱（薄层色谱（薄层色谱（Thin Lay ChromatographyThin Lay Chromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上 第10页/共136页11TLC的应用 1 2 3 4 5 6 7 8 9Bands Description 1 Pseudoginsenoside F11 2 American Ginseng 3 Ginsenoside R

8、g1 4 Ginsenoside Rf 5 Ginseng 6 Ginsenoside Rc 7 Ginsenoside Rb1 8 Notoginseng 9 Notoginsenoside R1人参、西洋参和三七药材的鉴别人参、西洋参和三七药材的鉴别第11页/共136页12丹参药材有效成分的HPLC图谱1.Danshensu;2.Protocatechuicacid;3.Protocatechualdehyde;4.Caffeicacid;5.SalvianolicacidF;6.SalvianolicacidD;7.SalvianolicacidJ/isomer;8.Salvianoli

9、cacidE;9.Rosmarinicacid;10.Lithospermicacid;11.SalvianolicacidB;12.SalvianolicacidB/E/isomer;13.SalvianolicacidA;14.DihydrotanshinoneI;15.Tetrahydrotanshinone/isomer;16.Cryptotanshinone;17.TanshinoneI;18.TanshinoneIIA123456871091112161514131718第12页/共136页13第13页/共136页14pp拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰pp伸舌峰伸舌峰伸舌峰伸舌峰pp鬼峰

10、、假峰鬼峰、假峰鬼峰、假峰鬼峰、假峰pp畸峰畸峰畸峰畸峰pp峰底峰底峰底峰底pp基线漂移基线漂移基线漂移基线漂移pp基线噪声基线噪声基线噪声基线噪声pp谱带扩张谱带扩张谱带扩张谱带扩张第14页/共136页15pp死时间死时间死时间死时间(t tM M):):):):完全不保留组分流出系统的时间完全不保留组分流出系统的时间pp保留时间保留时间保留时间保留时间(t tR R):):):):pp调整保留时间调整保留时间调整保留时间调整保留时间(t tR R):):):):pp死体积死体积死体积死体积(V VM M):):):):pp保留体积保留体积保留体积保留体积(V VR R):):):):pp调

11、整保留体积调整保留体积调整保留体积调整保留体积(V VR R):):):):第15页/共136页16R:分离度tR:保留时间t0：死时间W：峰底宽度2.色谱分离基本方程色谱分离基本方程第16页/共136页17不同不同R值的峰重叠情况示意图值的峰重叠情况示意图R1.5可以得到基线分离分离度R反映的是相邻两个峰的分开程度R太小，两个峰无法彻底分离R太大，分离时间过长，工作效率低下一般要求R1.5，也可遵循行业特殊规定第17页/共136页18根据该公式优化试验条件，提高分离度R。从数学推导来看，分别增大n，k值，都可以提高分离度。色谱分离基本方程色谱分离基本方程第18页/共136页19分离选择性（分

12、离选择性（）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响如果t0=1min=1.64/1.58=1.04=1.15/0.85=1.35=0.95/0.63=1.50 改变分离选择性改变分离选择性的方法的方法改用不同的流动相改变流动相的组成并非必须大于并非必须大于1.5！改变流动相pH值尽量优化前几种实验条件提高a值，改变柱温避免改变固定相（买新柱子），以便降低成本应用特殊的化学效应改变固定相第19页/共136页20柱效（柱效（n）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响以上两张谱图k，,值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效

13、越高，通常使用理论塔板数（n）的大小衡量柱效的高低第20页/共136页21理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数理论塔板高度HETP=L/n理论塔板数n越大，柱效越高；理论塔板数HETP越效，柱效越高第21页/共136页22 容量因子（容量因子（容量因子（容量因子（k k）对分离度（）对分离度（）对分离度（）对分离度（R R）的影响）的影响）的影响）的影响容量因子越大，分离度越大。容量因子越大，分离度越大。k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00但当容量因子大于但当容量

14、因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，大大延长。因此，k的最佳范围是的最佳范围是1k20。改变容量因子的方法有：改变容量因子的方法有：改变柱温改变柱温改变柱死体积，其中改变柱死体积，其中死体积死体积对对k/(k+1)的影响很大。的影响很大。改变流动相的配比是最简便、最有效的方法改变流动相的配比是最简便、最有效的方法梯度洗提梯度洗提容量因子容量因子第22页/共136页23梯度洗提梯度洗提梯度洗提梯度洗提n n梯度洗脱即程序控制流动相的组成，使在整个梯度洗脱即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增分离过程中，溶剂

15、强度按照特定的变化规律增加。加。n n优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的最佳的k k值范围内。值范围内。n n缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。生处理。第23页/共136页24第24页/共136页25装置装置装置装置n n低压梯度（内梯度）：溶剂在常压下混合，再用高低压梯度（内梯度）：溶剂在常压下混合，再用高压泵输送至柱系统。简单、经济，只需一个泵，所压泵输送至柱系统。简单、经济，只需一个泵，所用溶剂的元数没有限制。用溶剂

16、的元数没有限制。n n高压梯度（外梯度）：一般由两台高压泵构成，每高压梯度（外梯度）：一般由两台高压泵构成，每台泵输送一种溶剂。溶剂在混合室混合后，在输入台泵输送一种溶剂。溶剂在混合室混合后，在输入柱系统。流量精密度高，溶剂的可压缩性和热力学柱系统。流量精密度高，溶剂的可压缩性和热力学体积的变化可能影响输入柱子中溶剂的组成。体积的变化可能影响输入柱子中溶剂的组成。第25页/共136页26溶剂A溶剂B电磁阀A电磁阀B混合室泵溶剂A溶剂B高压泵A 高压泵B混合室低压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框图第26页/共136页27n n实现方式实现方式实现方式实现方式n n对于复杂样品，线性梯度是最好的。对

17、于复杂样品，线性梯度是最好的。n n正相色谱中，常用二氯甲烷加入正己烷来实现。正相色谱中，常用二氯甲烷加入正己烷来实现。n n反相色谱中，乙腈，甲醇加入水中是最常用的。反相色谱中，乙腈，甲醇加入水中是最常用的。第27页/共136页28温度的影响温度的影响n，k都会受到柱温的影响不要使用过高温度，以保护柱子，60度算高温温度对平衡常数有影响，有时会影响出峰顺序影响出峰顺序，注意对化合物进行定性后再定量升温通常可以加速分离，缩短分析时间，但也不绝对第28页/共136页29三、色谱定性与定量方法三、色谱定性与定量方法第29页/共136页301.1.1.1.色谱定性分析色谱定性分析色谱定性分析色谱定性

18、分析(1)(1)纯物对照定性纯物对照定性 各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此因此保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标。第30页/共136页31实现方法实现方法利用保留时间和保留体积定性利用保留时间和保留体积定性 第31页/共136页32用相对保留值定性用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性 第32页/共136页33n n应应用用范范围围：适适用用于于简简单单混混合合物物，对对该该样样品品已有了解并具有纯物质的情况。已有了解

19、并具有纯物质的情况。n n优点：应用简便，不需要其他仪器。优点：应用简便，不需要其他仪器。n n缺点：定性结果的可信度不高。缺点：定性结果的可信度不高。提高可信度的方法：双柱、双体系定性提高可信度的方法：双柱、双体系定性第33页/共136页34(2)(2)与其它仪器或化学方法联合定性与其它仪器或化学方法联合定性与其它仪器或化学方法联合定性与其它仪器或化学方法联合定性n n离线联用方式离线联用方式化学法化学法仪器法仪器法n n在线联用方式在线联用方式化学法化学法仪器法仪器法第34页/共136页35离线联用方式离线联用方式收集方法：馏分收集器收集方法：馏分收集器应用范围：无标准物时，可对较为复应用

20、范围：无标准物时，可对较为复杂的混合物进行定性分析杂的混合物进行定性分析缺点：麻烦缺点：麻烦第35页/共136页36在线联用方式在线联用方式与其它仪器联用定性与其它仪器联用定性 混混合合物物经经色色谱谱分分离离后后，将将各各组组分分直直接接由由接接接接口口口口导导入入其其它它仪仪器器中中进进行行定定性性。常常用用的的联用方法有：联用方法有：LCLC-FTIR-FTIR、LC-MSLC-MS 其它仪器相当于其它仪器相当于色谱仪的检测器。色谱仪的检测器。色谱仪的检测器。色谱仪的检测器。使用范围：复杂样品的定性。使用范围：复杂样品的定性。优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。优点：不需要标

21、准物，定性结果可信度高，操作方便。缺点：需要特殊仪器或设备。缺点：需要特殊仪器或设备。第36页/共136页372 2 色谱定量分析色谱定量分析(1)色谱定量基础 色色色色谱谱谱谱定定定定量量量量分分分分析析析析是是是是基基基基于于于于被被被被测测测测物物物物质质质质的的的的量量量量与与与与峰峰峰峰面面面面积成正比积成正比积成正比积成正比。在一定色谱条件下有：。在一定色谱条件下有：第37页/共136页38（2 2）定量要解决的问题）定量要解决的问题）定量要解决的问题）定量要解决的问题n n峰面积的测量和计算n n校正因子的测量与计算n n色谱定量方法及其应用第38页/共136页39 峰面积的测量

22、与计算峰面积的测量与计算峰面积的测量与计算峰面积的测量与计算n n积分仪或色谱工作站积分仪或色谱工作站积分仪或色谱工作站积分仪或色谱工作站 简便、速度快，精度高，可达简便、速度快，精度高，可达0.2-2%0.2-2%，对小峰，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。n n手动测量与计算手动测量与计算手动测量与计算手动测量与计算第39页/共136页40峰高乘半峰宽法：适于对称峰峰高乘半峰宽法：适于对称峰峰高乘峰底宽度法峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰适于矮宽峰峰高乘平均峰宽法峰高乘平均峰宽法：适于不对称峰适于不对称峰峰高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常峰

23、高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。用于工厂控制分析。第40页/共136页41n n重叠峰的测量重叠峰的测量重叠峰的测量重叠峰的测量切线分峰切线分峰垂线分峰垂线分峰第41页/共136页42连线分峰连线分峰计算机拟合分计算机拟合分峰峰第42页/共136页43 校正因子的测量与计算校正因子的测量与计算校正因子的测量与计算校正因子的测量与计算n n相对校正因子相对校正因子相对校正因子相对校正因子 由由于于绝绝对对校校正正因因子子与与仪仪器器的的灵灵敏敏度度有有关关，又又由由于于灵灵敏敏度度与与实实验验条条件件相相关关，且且每每一一检检测测器器的的灵灵敏敏度度都都是是不不同同的的，

24、它它不不容容易易测测量量准准确确，亦亦无无通通用用性性，所所以以实实际际工工作作中中使使用用相对校正因子相对校正因子相对校正因子相对校正因子。第43页/共136页44质量校正因子质量校正因子 摩尔校正因子摩尔校正因子 相对响应值相对响应值 被测组分被测组分的质量的质量标准物质量标准物质量分子量分子量第44页/共136页45定量方法定量方法n n校正归一化法 含归一化n n内标法 含内标标准曲线法n n外标法 含单点校正第45页/共136页46n n 校正归一化法校正归一化法校正归一化法校正归一化法推导推导：第46页/共136页47应应用用范范围围：当当试试样样中中各各组组分分都都能能流流出出色

25、色谱谱柱柱，且且在在检检测测器器上上均均有有响响应应，各各组组分分峰峰没有重叠时，可用此法。没有重叠时，可用此法。优优点点：简简便便、准准确确，当当操操作作条条件件如如进进样样量量等等变变化化时时，对对定定量量结结果果影影响响很很小小，该该法法适适合于常量物质的定量。合于常量物质的定量。缺缺点点：对对该该法法的的苛苛刻刻要要求求限限制制了了它它的的使使用。用。第47页/共136页48面积归一化法面积归一化法面积归一化法面积归一化法若若各各组组分分的的定定量量校校正正因因子子相相近近或或相相同同，则则上上式可简化为：式可简化为：第48页/共136页49n n 内标法内标法内标法内标法推导推导 将

26、将一一定定量量的的纯纯物物质质作作为为内内标标物物，加加入入到到准准确确称称量的试样中。量的试样中。单点校正第49页/共136页50适用范围：适用范围：适用范围：适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。样中所有组分不能全部出峰时可用。优优优优点点点点：受受操操作作条条件件的的影影响响较较小小，定定量量结结果果较较准准确确，使使用用上上不不象象归归一一化化法法那那样样受受到到限限制制，此此法法适适合合于于微微量物质的分析。量物质的分析。缺缺缺缺点点点点：每每次次分分析析必必须须准准确确称称量量被被测测物物和和内内标标物物，不适合于

27、快速分析。不适合于快速分析。第50页/共136页51内标标准曲线法（多点校正内标法）内标标准曲线法（多点校正内标法）内标标准曲线法（多点校正内标法）内标标准曲线法（多点校正内标法）f fi,si,smms s/m/m为常数为常数K K，此时，此时C Ci i%=K(A%=K(Ai i/A/As s)，以，以C Ci i%对对A Ai i/A/As s作标准曲线。作标准曲线。优点：优点：不必测校正因子，消除了某些操作条件不必测校正因子，消除了某些操作条件的影响，方法简便，适合液体试样的常规分的影响，方法简便，适合液体试样的常规分析。析。第51页/共136页52n n 外标法（标准曲线法）外标法（

28、标准曲线法）外标法（标准曲线法）外标法（标准曲线法）用于常规分析用于常规分析用于常规分析用于常规分析优优点点：操操作作简简单单，计算方便。计算方便。缺缺点点：结结果果的的准准确确度度取取决决于于进进样样量量的的重重现现性性和和操操作作条条件件的的稳稳定定性性。该该法法必必须须定定量量进样。进样。第52页/共136页53单点校正单点校正单点校正单点校正当当被被测测试试样样中中各各组组分分的的浓浓度度变变化化范范围围不不大大时时而而用用单点校正法。单点校正法。即即配配制制一一个个与与被被测测组组分分含含量量十十分分接接近近的的标标准准溶溶液液，定量进样，计算被测物的含量。定量进样，计算被测物的含量

29、。第53页/共136页54（3 3 3 3）定量中的误差问题定量中的误差问题定量中的误差问题定量中的误差问题n n样品的代表性（样品的前处理）样品的代表性（样品的前处理）n n进样系统的影响进样系统的影响n n柱系统的影响柱系统的影响n n测量误差测量误差n n定量结果的误差分析定量结果的误差分析第54页/共136页55HPLCHPLC主要类型及其选择主要类型及其选择 n n化学键合相色谱法化学键合相色谱法n n液固色谱法液固色谱法n n离子对色谱法离子对色谱法n n离子色谱法离子色谱法n n体积排阻色谱法体积排阻色谱法第55页/共136页56一、化学键合相色谱法一、化学键合相色谱法一、化学键

30、合相色谱法一、化学键合相色谱法1.1.分类分类n n正正相相键键合合相相色色谱谱法法(Normal(Normal phase phase chromatography)chromatography)：固固定定相相的的极极性性大大于于流流动动相相的的极极性性，适适用用于于分分离离油油溶性或水溶性的极性或强极性化合物溶性或水溶性的极性或强极性化合物n n反反 相相 键键 合合 相相 色色 谱谱 法法(Reversed(Reversed phase phase chromatography)chromatography)：固固定定相相的的极极性性大大于于流流动动相相的的极极性性，适适于于分分离离非非

31、极极性性、极极性性和和离离子子性性化化合合物物。应应用用最最广广泛泛第56页/共136页57正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流动相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出第57页/共136页582.2.固定相固定相固定相固定相 n n疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷烃（C C8 8和和C C1818）和苯基等）和苯基等n n极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。第58页/共136页59类型类型分离方式分离方式应用特点应用特点C-18C-18反相、离子对反相、离子对普适性好

32、，保留值大。溶于水的高极性化合物、普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物中等极性化合物C-8C-8反相、离子对反相、离子对与与C-18C-18类似，保留值略小类似，保留值略小C-3,C-4C-3,C-4反相反相保留值小，适合肽类和蛋白质保留值小，适合肽类和蛋白质苯基苯基反相反相保留适中，选择性不同。非极性、中等极性化合保留适中，选择性不同。非极性、中等极性化合物物-CN-CN反相、正相反相、正相选择性与硅胶类似，保留小，用途广选择性与硅胶类似，保留小，用途广-NH-NH2 2反相、正相、离子交换反相、正相、离子交换分离糖类、核苷酸、固醇等分离糖类、核苷酸、固醇等二醇基二醇基正

33、相正相分离有机酸、排阻分蛋白质等分离有机酸、排阻分蛋白质等醚基醚基反相、正相反相、正相分离酚类、芳硝基化合物，保留比分离酚类、芳硝基化合物，保留比C-18C-18强强聚苯乙烯基聚苯乙烯基反相反相PHPH使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长常用固定相第59页/共136页60第60页/共136页61n n不同厂商固定相的比不同厂商固定相的比较较第61页/共136页623.3.流动相流动相流动相流动相溶剂具有稳定的化学性质溶剂的选择与使用的检测器要有相容性溶剂的粘度要小溶剂的沸点不能太低溶剂的纯度要高且价格便宜正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷为主

34、体，加入质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给予体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇及其混合物等，以水为主体，加入质子接受体甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。第62页/共136页634.4.影响保留值的因素影响保留值的因素影响保留值的因素影响保留值的因素n n溶质结构对保留值的影响：溶质结构对保留值的影响：溶质结构对保留值的影响：溶质结构对保留值的影响：n n正相：溶质极性越强，官能团越多，保留值越大正相：溶质极性越强，官能团越多，保留值越大正相：溶质极性越强，官能团越多，保留值越大正相：溶质极性越强，官能团越多，保留值越大n n反相：溶质极性越弱，疏水性越强，保留

35、值越大。溶质的保留值与其分反相：溶质极性越弱，疏水性越强，保留值越大。溶质的保留值与其分反相：溶质极性越弱，疏水性越强，保留值越大。溶质的保留值与其分反相：溶质极性越弱，疏水性越强，保留值越大。溶质的保留值与其分子非极性部分的总面积有关，面积大，保留值大。子非极性部分的总面积有关，面积大，保留值大。子非极性部分的总面积有关，面积大，保留值大。子非极性部分的总面积有关，面积大，保留值大。第63页/共136页64第64页/共136页65n n烷基键合固定烷基键合固定烷基键合固定烷基键合固定相特性对保留相特性对保留相特性对保留相特性对保留值的影响：值的影响：值的影响：值的影响：n n反相：键合反相：

36、键合反相：键合反相：键合相烷链长，相烷链长，相烷链长，相烷链长，k k大，选择性大，选择性大，选择性大，选择性好。好。好。好。第65页/共136页66n n溶剂性质：溶剂性质：溶剂性质：溶剂性质：n n正相：溶剂极性越弱，保留越大正相：溶剂极性越弱，保留越大正相：溶剂极性越弱，保留越大正相：溶剂极性越弱，保留越大n n反相：流动相表面张力大、介电常数大，则极反相：流动相表面张力大、介电常数大，则极反相：流动相表面张力大、介电常数大，则极反相：流动相表面张力大、介电常数大，则极性越强。其斥力越大，溶质与固定相键合越强，性越强。其斥力越大，溶质与固定相键合越强，性越强。其斥力越大，溶质与固定相键合

37、越强，性越强。其斥力越大，溶质与固定相键合越强，保留值越大。保留值越大。保留值越大。保留值越大。第66页/共136页67n n盐的影响：盐的影响：盐的影响：盐的影响：n n通常加入醋酸盐、硼酸盐、硫酸盐等。无机盐通常加入醋酸盐、硼酸盐、硫酸盐等。无机盐通常加入醋酸盐、硼酸盐、硫酸盐等。无机盐通常加入醋酸盐、硼酸盐、硫酸盐等。无机盐使流动相表面张力增大，对非离子性溶质，使使流动相表面张力增大，对非离子性溶质，使使流动相表面张力增大，对非离子性溶质，使使流动相表面张力增大，对非离子性溶质，使k k增加，对离子型溶质，增加，对离子型溶质，增加，对离子型溶质，增加，对离子型溶质，k k下降。对碱性有机

38、物有下降。对碱性有机物有下降。对碱性有机物有下降。对碱性有机物有改善峰形的作用。改善峰形的作用。改善峰形的作用。改善峰形的作用。n npHpH值：值：值：值：n n加入酸、碱或缓冲液，控制加入酸、碱或缓冲液，控制加入酸、碱或缓冲液，控制加入酸、碱或缓冲液，控制PHPH，抑制溶质的离，抑制溶质的离，抑制溶质的离，抑制溶质的离子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。第67页/共136页685 5 应用应用应用应用第68页/共136页69二二二二.液固色谱法液固色谱法液固色谱法液固色谱法 Liquid S

39、olid ChromatographyLiquid Solid ChromatographyLiquid Solid ChromatographyLiquid Solid Chromatography1.固定相固定相极性：硅胶、氧化镁、氧化铝等非极性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等2.流动相流动相 硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体，加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂第69页/共136页703.3.影响保留值的因素影响保留值的因素影响保留值的因素影响保留值的因素n n样品分子结构样品分子结构样品分子结构

40、样品分子结构n n溶质分子的官能团极性增加，保留值增加溶质分子的官能团极性增加，保留值增加溶质分子的官能团极性增加，保留值增加溶质分子的官能团极性增加，保留值增加n n溶质分子的官能团数目增加，保留值增加溶质分子的官能团数目增加，保留值增加溶质分子的官能团数目增加，保留值增加溶质分子的官能团数目增加，保留值增加n n保留值与溶质的空间效应有关保留值与溶质的空间效应有关保留值与溶质的空间效应有关保留值与溶质的空间效应有关n n保留值与吸附中心的几何分布有关保留值与吸附中心的几何分布有关保留值与吸附中心的几何分布有关保留值与吸附中心的几何分布有关n nb b吸附剂吸附剂吸附剂吸附剂n n吸附剂的孔

41、径越小，表面积越大，保留值越大吸附剂的孔径越小，表面积越大，保留值越大吸附剂的孔径越小，表面积越大，保留值越大吸附剂的孔径越小，表面积越大，保留值越大n n吸附剂的活性越强，保留值越大，活性由流动相中的含水量吸附剂的活性越强，保留值越大，活性由流动相中的含水量吸附剂的活性越强，保留值越大，活性由流动相中的含水量吸附剂的活性越强，保留值越大，活性由流动相中的含水量来控制来控制来控制来控制n nc c流动相流动相流动相流动相第70页/共136页714.4.应用应用应用应用n n中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等n n不同极性取代基的化合物不同极性取

42、代基的化合物n n结构异构体和几何异构体混合物的分离结构异构体和几何异构体混合物的分离第71页/共136页72第72页/共136页73三、离子对色谱法三、离子对色谱法三、离子对色谱法三、离子对色谱法 Ion-pair chromatographyIon-pair chromatographyIon-pair chromatographyIon-pair chromatography 1.1.1.1.基本原理基本原理基本原理基本原理n n将一种或数种与样品离子电荷（将一种或数种与样品离子电荷（将一种或数种与样品离子电荷（将一种或数种与样品离子电荷（A A A A+）相反的离子）相反的离子）相反的

43、离子）相反的离子(B(B(B(B-)（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱 第73页/共136页74第74页/共136页75第75页/

44、共136页762.2.2.2.固定相、流动相和离子对试剂固定相、流动相和离子对试剂固定相、流动相和离子对试剂固定相、流动相和离子对试剂n n固定相固定相固定相固定相多为多为多为多为C18,C8C18,C8C18,C8C18,C8反相键合相反相键合相反相键合相反相键合相n n流流流流动动动动相相相相是是是是以以以以水水水水为为为为主主主主的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液，或或或或水水水水-甲甲甲甲醇醇醇醇、水水水水-乙乙乙乙腈腈腈腈等等等等混混混混合溶剂合溶剂合溶剂合溶剂n n离离离离子子子子对对对对试试试试剂剂剂剂：四四四四丁丁丁丁基基基基铵铵铵铵正正正正离离离离子子子子、十十十十六六六六烷烷

45、烷烷基基基基三三三三甲甲甲甲基基基基铵铵铵铵正正正正离离离离子，子，子，子，ClOClOClOClO4 4 4 4-，十二烷基磺酸根等，十二烷基磺酸根等，十二烷基磺酸根等，十二烷基磺酸根等第76页/共136页773.3.影响保留值的因素影响保留值的因素影响保留值的因素影响保留值的因素n npHpH的影响的影响的影响的影响：改善分离选择性的有效方法。改善分离选择性的有效方法。反相中，对于阴离子的分离，反相中，对于阴离子的分离，pHpH下降，下降，k k减小。减小。n n离子对试剂的性质与浓度离子对试剂的性质与浓度离子对试剂的性质与浓度离子对试剂的性质与浓度：反相中，离子对试剂烷：反相中，离子对试

46、剂烷基链越长，疏水性越大，基链越长，疏水性越大，k k越大。越大。n n溶剂的极性溶剂的极性溶剂的极性溶剂的极性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脱强度增大，脱强度增大，k k下降。洗脱强度与极性参数、介电常下降。洗脱强度与极性参数、介电常数同时相关数同时相关n n离子强度离子强度离子强度离子强度：反相中，离子强度增加，溶质：反相中，离子强度增加，溶质k k下降下降第77页/共136页784.4.4.4.应用应用应用应用有机酸、有机碱特别是强酸有机酸、有机碱特别是强酸有机酸、有机碱特别是强酸有机酸、有机碱特别是强酸强碱的分析，如羧酸、磺酸、强碱的分析，如羧酸、磺

47、酸、强碱的分析，如羧酸、磺酸、强碱的分析，如羧酸、磺酸、胺类、酚类、药物、染料等胺类、酚类、药物、染料等胺类、酚类、药物、染料等胺类、酚类、药物、染料等反相离子对色谱分析有机酸固定相：C18烷基键合相流动相：0.03mol/L四丁基铵+戊醇1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羟基苯甲酸；4.3-羟基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸第78页/共136页79色谱类型（Mode）固定相（Stationary Phase）流动相(Mobile Phase)主要适用范围(Compound Sepatated)正相色谱（Normal-Phase）硅胶硅胶、氰基、氨基有机溶剂在

48、水中绝对不溶解的物质或同分异构体反相色谱色谱(Reversed-Phase)C-18,C-8,C-4,C-2水/有机溶剂中性、弱酸性、弱碱性物质离子对色谱(Ion-Pair)C18,C-8水/有机溶剂离子对试剂离子离子交换色谱(Ion Exchange)阴离子和阳离子交换剂水相/缓冲盐对离子离子体积排阻色谱(Size Exclusion)聚酯、硅胶水相(GPC)有机相(GPC)大分子量化合物聚合物液相色谱常用类型总结：第79页/共136页80第第第第3 3章章章章 高效液相色谱法的建立与应用高效液相色谱法的建立与应用高效液相色谱法的建立与应用高效液相色谱法的建立与应用第80页/共136页81我

49、国药典收载高效液相色谱法项目和我国药典收载高效液相色谱法项目和我国药典收载高效液相色谱法项目和我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：数量比较表：数量比较表：数量比较表：第81页/共136页82 高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪的结构色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱第82页/共136页83HPLC有以下特点有以下特点 n n高压压力可达150300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。n n高速流速为0.110.0 ml/min。n

50、n高效可达10000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。n n高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。第83页/共136页84HPLC与经典液相色谱相比有以与经典液相色谱相比有以下优点：下优点：n n速速度度快快通通常常分分析析一一个个样样品品在在1530 1530 minmin，有有些些样样品品甚甚至至在在5 5 minmin内即可完成。内即可完成。n n分辨率高分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。n n灵灵敏敏度度高高紫紫外外检检测测器器可可达达0.01ng0.01ng，荧荧光光和和电电化化学学检检测测器器可可