细胞化学与组织化学.pptx

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1、会计学1细胞化学与组织化学细胞化学与组织化学组织化学（组织化学（组织化学（组织化学（histochemistryhistochemistry）/细胞化学细胞化学细胞化学细胞化学(cytochemistry)(cytochemistry)是是是是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位织与细胞的化学成分、化学反应及其

2、变化规律进行定性、定位织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学。和定量研究的科学。和定量研究的科学。和定量研究的科学。主要研究对象是生物大分子主要研究对象是生物大分子主要研究对象是生物大分子主要研究对象是生物大分子(如核酸、蛋白质、酶、多糖如核酸、蛋白质、酶、多糖如核酸、蛋白质、酶、多糖如核酸、蛋白质、酶、多糖和脂类等和脂类等和脂类等和脂类等)在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。细胞组

3、分和细胞器在整个生命活动中的作用等。细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。第1页/共29页一、组织化学发展简史一、组织化学发展简史 组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合的，早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应，解释生物界中起来，开始观察组织中的化学反应，解释生物界中的生理现象。的生理现象。第2页/共29页n n(1890(1890一一一一1920)1920)随着显微镜的改进和组织细胞随着显微镜的改进和组织细胞随着显微镜的改进和组

4、织细胞随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组织学的概念转为显微化学。织学的概念转为显微化学。织学的概念转为显微化学。织学的概念转为显微化学。n n依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学反应形成反应形成反应形成反应形成酶细胞化学酶细胞化学酶细胞化学酶细胞化学。n n7070年代由于细胞显微分光光度法和荧光显年代由于细胞显微分光光度法和荧光

5、显年代由于细胞显微分光光度法和荧光显年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，形成了定量细胞化学。形成了定量细胞化学。形成了定量细胞化学。形成了定量细胞化学。第3页/共29页n n80年代电镜细胞化学可以观年代电镜细胞化学可以观察化学成分的亚细胞定位。察化学成分的亚细胞定位。n n80 90年代，先后流式细胞年代，先后流式细胞术、激光扫描共聚焦显微技术术、激光扫描共聚焦显微技术出现。出现。第4页/共29页n n激光扫描共聚焦显微技术激光

6、扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微技术，相似于对单个，相似于对单个，相似于对单个，相似于对单个细胞进行细胞细胞进行细胞细胞进行细胞细胞进行细胞“CT”CT”分析，并能研究活细胞和定分析，并能研究活细胞和定分析，并能研究活细胞和定分析，并能研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质量分析细胞内的遗传物质量分析细胞内的遗传物质量分析细胞内的遗传物质DNADNA、RNARNA、细胞器、细胞器、细胞器、细胞器的酶含量，细胞内各种荧光标记物的酶含量，细胞内各种荧光标记物的酶含量，细胞内各种荧光标记物的酶含量，细胞内各种荧光标记物(包括分子和包括分子和包括分子和包括分子和离子的浓度及其分

7、布，如离子的浓度及其分布，如离子的浓度及其分布，如离子的浓度及其分布，如CaCa2+2+和和和和pHpH值等值等值等值等)，n流式细胞术流式细胞术是一种快速对单细胞化学成分是一种快速对单细胞化学成分定量分析的新技术，每秒可测上万细胞信息，从定量分析的新技术，每秒可测上万细胞信息，从一个细胞中，可同时测量多种参数。一个细胞中，可同时测量多种参数。第5页/共29页二、组织化学技术的基本要求二、组织化学技术的基本要求 1 1 1 1尽尽尽尽可可可可能能能能地地地地保保保保持持持持组组组组织织织织和和和和细细细细胞胞胞胞生生生生前前前前的的的的形形形形态态态态结结结结构构构构、化化化化学学学学成成成成

8、分分分分和和和和酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性。必必必必须须须须选选选选择择择择适适适适当当当当的的的的固固固固定定定定液液液液和和和和恰当的处理方法。恰当的处理方法。恰当的处理方法。恰当的处理方法。2 2 2 2化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物使反应的产物使反应的产物使反应的产物不移位，不弥散不

9、移位，不弥散不移位，不弥散不移位，不弥散。第6页/共29页3 3 3 3反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具保留在原位上。颜色深度

10、要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。有一定的比例关系。有一定的比例关系。有一定的比例关系。4 4 4 4反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。5 5 5 5反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。6 6 6 6反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。反应产物有对照，否则难

11、以判断其结果的可靠性。反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。第7页/共29页三、细胞化学技术显示的化学成分：三、细胞化学技术显示的化学成分：uu蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基；：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基；：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基；：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基；uuRNARNA和和和和DNADNA；uu糖类糖类糖类糖类：如糖原、粘多糖和糖脂等；：如糖原、粘多糖和糖脂等；：如糖原、粘多糖和糖脂等；：如糖原、粘多糖和糖脂等；uu脂类脂类脂类脂类：如中性脂肪、磷脂和胆固醇等；：如中性脂肪、磷脂和胆固醇等；：如中性脂肪、磷脂和胆固

12、醇等；：如中性脂肪、磷脂和胆固醇等；uu酶酶酶酶：包括包括包括包括水解酶水解酶水解酶水解酶(如磷酸酶、酯酶、肽酶如磷酸酶、酯酶、肽酶如磷酸酶、酯酶、肽酶如磷酸酶、酯酶、肽酶)、氧化酶氧化酶氧化酶氧化酶(琥琥琥琥珀酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶珀酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶珀酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶珀酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶)和和和和激酶激酶激酶激酶、转转转转移酶移酶移酶移酶等；等；等；等；uu生物胺生物胺生物胺生物胺：5-5-羟色胺、肾上腺素类、组织胺等；羟色胺、肾上腺素类、组织胺等；羟色胺、肾上腺素类、组织胺等；羟色胺、肾上腺素类、组织胺等；uu特异抗原特异抗原

13、特异抗原特异抗原：其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等；：其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等；：其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等；：其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等；uu无机盐和微量元素无机盐和微量元素无机盐和微量元素无机盐和微量元素：如铁、铜、锌、钴、镁等。：如铁、铜、锌、钴、镁等。：如铁、铜、锌、钴、镁等。：如铁、铜、锌、钴、镁等。第8页/共29页四、细胞化学染色的原理：四、细胞化学染色的原理：细胞中的化学成分和其相应细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形的底物呈一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。成在显微镜下可见到的反应产物。常用组织化学方法的原理如

14、下：常用组织化学方法的原理如下：第9页/共29页一）金属一）金属一）金属一）金属-金属盐沉淀反应原理金属盐沉淀反应原理金属盐沉淀反应原理金属盐沉淀反应原理利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属化合利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属化合物在与细胞化学成份反应过程中生成物在与细胞化学成份反应过程中生成有色沉有色沉淀淀，借以辨认所检查的物质。，借以辨认所检查的物质。如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅/钴形成磷酸铅，在硫存在时形成钴形成磷酸铅，在硫存在时形成钴形成磷酸铅，在硫存在时形成钴形成磷酸铅，在硫存在时形成 PbSPb

15、S或或或或CoSCoS的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。第10页/共29页二）偶氮偶联法原理二）偶氮偶联法原理二）偶氮偶联法原理二）偶氮偶联法原理 用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而形成不溶性的偶

16、氮色素。形成不溶性的偶氮色素。形成不溶性的偶氮色素。形成不溶性的偶氮色素。n n 萘基磷酸钠萘基磷酸钠萘基磷酸钠萘基磷酸钠 磷酸氢二钠磷酸氢二钠磷酸氢二钠磷酸氢二钠 萘酚萘酚萘酚萘酚n n 萘酚萘酚萘酚萘酚FAST BLUE FAST BLUE 偶氮染料偶氮染料偶氮染料偶氮染料 碱性磷酸酶碱性磷酸酶水水第11页/共29页三）过碘酸三）过碘酸三）过碘酸三）过碘酸SchiffSchiff氏剂反应法原理氏剂反应法原理氏剂反应法原理氏剂反应法原理 利用细胞中多糖放出的醛基可将利用细胞中多糖放出的醛基可将利用细胞中多糖放出的醛基可将利用细胞中多糖放出的醛基可将SchiffSchiff氏剂中的氏剂中的氏剂

17、中的氏剂中的无色品无色品无色品无色品红红红红转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。这种反应多用于显示细胞中的这种反应多用于显示细胞中的这种反应多用于显示细胞中的这种反应多用于显示细胞中的糖类糖类糖类糖类和细胞核内的和细胞核内的和细胞核内的和细胞核内的DNADNA，前者称为，前者称为，前者称为，前者称为PASPAS反应反应反应反应，后者称为，后者称为，后者称为，后者称为FeulgenFeulgen反应反应反应反应。此外，还可。此外，还可。此外，还可。此外，还可用于检查细跑中的

18、粘蛋白和不饱和脂类。用于检查细跑中的粘蛋白和不饱和脂类。用于检查细跑中的粘蛋白和不饱和脂类。用于检查细跑中的粘蛋白和不饱和脂类。第12页/共29页四）联苯胺法原理四）联苯胺法原理 过氧化氢酶分解过氧化氢酶分解H2O2产生新生氧，后者产生新生氧，后者可将无色联苯胺氧化，生成联苯胺蓝，进而可将无色联苯胺氧化，生成联苯胺蓝，进而变成棕黑色化合物。此法主要显示细胞中的变成棕黑色化合物。此法主要显示细胞中的过氧化物酶过氧化物酶。第13页/共29页五）色素形成法原理五）色素形成法原理 是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在是一组显

19、示酶定位的常用方法，其原理是在酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成色素沉着，以此确定待测酶的存在部位。色素沉着，以此确定待测酶的存在部位。色素沉着，以此确定待测酶的存在部位。色素沉着，以此确定待测酶的存在部位。色素形成法主要包括四唑盐法（色素形成法主要包括四唑盐法（色素形成法主要包括四唑盐法（色素形成法主要包括四唑盐法（NBTNBT、MTTMTT）、靛蓝形成法等。其中四唑盐法用于定）、靛蓝形成法等。其中四唑盐法用于定）、靛蓝形成法等。其中四唑盐法用于定）、靛蓝形成

20、法等。其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝反应用于酯酶、磷酸酶等反应用于酯酶、磷酸酶等反应用于酯酶、磷酸酶等反应用于酯酶、磷酸酶等第14页/共29页六）底物标记法原理六）底物标记法原理底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在的部位。底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在的部位

21、。底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在的部位。底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在的部位。最常用的底物标记法为放射自显影术，即最常用的底物标记法为放射自显影术，即最常用的底物标记法为放射自显影术，即最常用的底物标记法为放射自显影术，即7070年代年代年代年代后兴起的同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物，后兴起的同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物，后兴起的同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物，后兴起的同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物，在酶的作用下，带有标记的分解产物沉着于酶所在组织在酶的作用下，带有标记的分解产物沉着于酶所在组织在酶的作用下，带有标记的分解产物沉

22、着于酶所在组织在酶的作用下，带有标记的分解产物沉着于酶所在组织结构上，通过放射自显影过程对沉着于酶所在部位的底结构上，通过放射自显影过程对沉着于酶所在部位的底结构上，通过放射自显影过程对沉着于酶所在部位的底结构上，通过放射自显影过程对沉着于酶所在部位的底物进行捕捉。物进行捕捉。物进行捕捉。物进行捕捉。第15页/共29页七）荧光染色与免疫荧光法原理七）荧光染色与免疫荧光法原理 荧光染色法是用特定的荧光染料对组织细胞荧光染色法是用特定的荧光染料对组织细胞荧光染色法是用特定的荧光染料对组织细胞荧光染色法是用特定的荧光染料对组织细胞中的化学成分直接染色，在荧光显微镜下对这些成中的化学成分直接染色，在荧

23、光显微镜下对这些成中的化学成分直接染色，在荧光显微镜下对这些成中的化学成分直接染色，在荧光显微镜下对这些成分进行直接观察。分进行直接观察。分进行直接观察。分进行直接观察。例如吖啶橙可以同时对细胞内的例如吖啶橙可以同时对细胞内的例如吖啶橙可以同时对细胞内的例如吖啶橙可以同时对细胞内的DNADNA和和和和RNARNA染色，染色，染色，染色，细胞核的细胞核的细胞核的细胞核的DNADNA呈呈呈呈亮绿色亮绿色亮绿色亮绿色-黄绿色黄绿色黄绿色黄绿色荧光，胞质和核仁的荧光，胞质和核仁的荧光，胞质和核仁的荧光，胞质和核仁的RNARNA呈呈呈呈桔红色桔红色桔红色桔红色荧光。荧光。荧光。荧光。第16页/共29页组

24、织与细胞材料的制备组织与细胞材料的制备第17页/共29页一、组织取材注意事项一、组织取材注意事项一、组织取材注意事项一、组织取材注意事项1.1.1.1.注意防止人为因素的影响注意防止人为因素的影响注意防止人为因素的影响注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。刀和剪要快，刀要足够长。刀和剪要快，刀要足够长。刀和剪要快，刀要足够长。2.2.2.2.组织块的大小组织块的大小组织块的大小组织块的大小 大小可根据需要而定，一般大小可根据需要而定，一般大小可根据需要而定，一般大小可根据需要而定，一般长长长长1cm1cm宽宽宽宽1cm1cm厚厚厚厚0.20.20.3cm0.3cm。3.3.3.3.动

25、物和人体组织的取材位置动物和人体组织的取材位置动物和人体组织的取材位置动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定。要视研究目的，观察部位而定。要视研究目的，观察部位而定。要视研究目的，观察部位而定。取材时应考虑：取材时应考虑：取材时应考虑：取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。组织。组织。组织。第18页/共29页4.4.4.4.取材时间取材时间取材时间取材时间 原则上，应尽快取材，但较大的手术标本如胃、原则上，应尽快取材

26、，但较大的手术标本如胃、原则上，应尽快取材，但较大的手术标本如胃、原则上，应尽快取材，但较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织要求离体后肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织要求离体后肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织要求离体后肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织要求离体后30min30min30min30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材，物组织取材要求心脏还在跳动时取材，物组织取材要求心脏还在跳动时取材

27、，物组织取材要求心脏还在跳动时取材，脑组织和神经脑组织和神经脑组织和神经脑组织和神经组织应采用灌注预固定后，再进行后固定。组织应采用灌注预固定后，再进行后固定。组织应采用灌注预固定后，再进行后固定。组织应采用灌注预固定后，再进行后固定。5.5.5.5.注意包埋方向，注意包埋方向，注意包埋方向，注意包埋方向，包埋时要平整。包埋时要平整。包埋时要平整。包埋时要平整。6.6.6.6.保持材料的清洁保持材料的清洁保持材料的清洁保持材料的清洁7.7.7.7.切除不需要的部分，骨组织需脱钙切除不需要的部分，骨组织需脱钙切除不需要的部分，骨组织需脱钙切除不需要的部分，骨组织需脱钙8.8.8.8.明确编号，登

28、记明确编号，登记明确编号，登记明确编号，登记第19页/共29页 培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有：培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有：培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有：培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有：（1 1 1 1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（101010106 6 6 6）涂在包被有切）涂在包被有切）涂在包被有切）涂在包被有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。片

29、粘合剂的载玻片上，凉干后固定。片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。（2 2 2 2）将细胞直接培养在盖玻片上。）将细胞直接培养在盖玻片上。）将细胞直接培养在盖玻片上。）将细胞直接培养在盖玻片上。（3 3 3 3）将细胞直接培养在）将细胞直接培养在）将细胞直接培养在）将细胞直接培养在6 6 6 6孔或孔或孔或孔或9 9 9 9孔板上，固定后备用。孔板上，固定后备用。孔板上，固定后备用。孔板上，固定后备用。胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本，可用离胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本，可用离胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本，可用离胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液

30、多而细胞较少的标本，可用离心沉淀法收集细胞。心沉淀法收集细胞。心沉淀法收集细胞。心沉淀法收集细胞。二、细胞材料的准备二、细胞材料的准备二、细胞材料的准备二、细胞材料的准备第20页/共29页三、组织标本的固定三、组织标本的固定三、组织标本的固定三、组织标本的固定 1.目的目的(1)(1)防止组织细胞的死后变化，防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态细胞的固有形态(2)(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿结构与

31、生活时相仿第21页/共29页（3 3）防止细胞过度收缩或膨胀而）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构，固定剂失去其原有形态结构，固定剂兼有硬化作用兼有硬化作用（4 4）经过固定的组织能对染料产）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。便于辨认。第22页/共29页2.2.2.2.固定液的种类固定液的种类固定液的种类固定液的种类 固定液分为固定液分为固定液分为固定液分为单纯固定液单纯固定液单纯固定液单纯固定液和和和和混合固定液混合固定液混合固定液混合固定液两种。两种。两种。两种。（1 1 1 1）甲醛固定液：）甲醛固定液：）甲醛固定液：）甲醛固定

32、液：是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为37%37%37%37%40%40%40%40%，配成固定液的，配成固定液的，配成固定液的，配成固定液的浓度为浓度为浓度为浓度为4%4%4%4%甲醛。配制时取甲醛原液甲醛。配制时取甲醛原液甲醛。配制时取甲醛原液甲醛。配制时取甲醛原液10ml10ml10ml10ml，加双蒸水或缓冲液至，加双蒸水或缓冲液至，加双蒸水或缓冲液至，加双蒸水或缓冲液至100ml100ml100ml100ml，为甲醛固定液（习惯上称为，为甲醛固定液（习惯上称为，为甲醛固定液（习惯上称为，为甲

33、醛固定液（习惯上称为10101010福尔马林）福尔马林）福尔马林）福尔马林）。甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pHpHpHpH为为为为7.67.67.67.6，可长期保，可长期保，可长期保，可长期保持中性。甲醛固定后，通常需用流水冲洗持中性。甲醛固定后，通

34、常需用流水冲洗持中性。甲醛固定后，通常需用流水冲洗持中性。甲醛固定后，通常需用流水冲洗12 12 12 12 24242424小时小时小时小时,否则影响否则影响否则影响否则影响染色效果。染色效果。染色效果。染色效果。第23页/共29页(2)4(2)4(2)4(2)4多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液(3)Bouin(3)Bouin(3)Bouin(3)Bouin s s s s液液液液 苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液 75ml75ml75ml75ml 甲醛甲醛甲醛甲醛 25ml25ml25ml25ml 冰醋酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸 5ml5m

35、l5ml5ml 渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为特殊染色效果好。固定为特殊染色效果好。固定为特殊染色效果好。固定为1212121224242424小时，但固定过久，小时，但固定过久，小时，但固定过久，小时，但固定过久，对碱性染料着色不利。对碱性染料着色不利。

36、对碱性染料着色不利。对碱性染料着色不利。第24页/共29页（4 4 4 4）CarnoyCarnoyCarnoyCarnoy氏液氏液氏液氏液 纯酒精纯酒精纯酒精纯酒精 60ml60ml60ml60ml 氯仿氯仿氯仿氯仿 30ml30ml30ml30ml 冰醋酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸 10ml10ml10ml10ml 此固定液渗透速度快，此固定液渗透速度快，此固定液渗透速度快，此固定液渗透速度快，2mm2mm2mm2mm以下小块组织固定时以下小块组织固定时以下小块组织固定时以下小块组织固定时间间间间2 2 2 24 4 4 4小时，它是细胞核极好的固定液，适合于细胞小时，它是细胞核极好的固定液，适合

37、于细胞小时，它是细胞核极好的固定液，适合于细胞小时，它是细胞核极好的固定液，适合于细胞分裂、分裂、分裂、分裂、RNARNARNARNA、DNADNADNADNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精及糖元等固定。固定后直接入纯酒精及糖元等固定。固定后直接入纯酒精及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。脱水。脱水。脱水。第25页/共29页(4)PLP(4)PLP(4)PLP(4)PLP固定液：过碘酸固定液：过碘酸固定液：过碘酸固定液：过碘酸-赖氨酸赖氨酸赖氨酸赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固多聚甲醛固定液。该固多聚甲醛固定液。该固多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多定剂较适合于富含

38、糖类组织，对超微结构及许多定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。抗原的抗原性保存较好。抗原的抗原性保存较好。抗原的抗原性保存较好。(5)Methacarn(5)Methacarn(5)Methacarn(5)Methacarn固定液：甲醇固定液：甲醇固定液：甲醇固定液：甲醇60ml60ml60ml60ml，氯仿，氯仿，氯仿，氯仿30ml30ml30ml30ml，醋酸，醋酸，醋酸，醋酸10ml10ml10ml10ml，混均后，混均后，混均后，混均后4444保存备用，对核内抗原的保存效果较保存备用，对核内抗原的保存效果较保存备用，

39、对核内抗原的保存效果较保存备用，对核内抗原的保存效果较好。好。好。好。(6)(6)(6)(6)丙酮及醇类固定剂：丙酮、乙醇类固定剂其固定原丙酮及醇类固定剂：丙酮、乙醇类固定剂其固定原丙酮及醇类固定剂：丙酮、乙醇类固定剂其固定原丙酮及醇类固定剂：丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是使蛋白质沉淀而发生固定作用。酒精是理主要是使蛋白质沉淀而发生固定作用。酒精是理主要是使蛋白质沉淀而发生固定作用。酒精是理主要是使蛋白质沉淀而发生固定作用。酒精是一种还原剂，用于组织固定以一种还原剂，用于组织固定以一种还原剂，用于组织固定以一种还原剂，用于组织固定以95%95%95%95%的浓度为宜，酒的浓度为宜，酒的浓度

40、为宜，酒的浓度为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。第26页/共29页固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种类及浓度、温度而定。原则上，组织块大小与固类及浓度、温度而定。原则上，组织块大小与固类及浓度、温度而定。原则上，组织块大小与固类及浓度、温度而定。原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。间成反比。间成反比。间成反比。组织固定后必须彻底冲洗。组织固定后必须彻底冲洗。组织固定后必须彻底冲洗。组织固定后必须彻底冲洗。第27页/共29页第28页/共29页