贝类过敏原的小鼠模型致敏性评价技术规程(T-SDIFST T-SDIFST0004—2021).pdf

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1、ICS 65.150 B 51 山东省食品科学技术学会团体标准 T/SDIFST 00042021 贝类过敏原的小鼠模型致敏性评价技术规程Code of practice for allergenicity assessment of mollusc allergen in a mouse model 2022-10-28 发布 2022-10-28 实施 山东省食品科学技术学会 发布 SDIFSTT/SDIFST 00042021 前言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文本的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担

2、识别专利的责任。本文件由中国海洋大学提出。本文件由山东省食品科学技术学会归口。本文件起草单位：中国海洋大学、黑龙江飞鹤乳业有限公司、荣成银海水产有限公司。本文件主要起草人：李振兴、林洪、张自业、牟伟丽、解庆刚、王象欣、姜森。T/SDIFST 00042021 贝类过敏原的小鼠模型致敏性评价技术规程 1.范围 本文件确立了贝类过敏原致敏性小鼠模型评价技术规程，规定了术语和定义、一般要求、仪器设备、试剂与溶液配制、评价流程图、评价程序的要求。本文件适用于小鼠模型评价贝类过敏原致敏性过程中的技术操作。2.规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引

3、用文件，仅对该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14922.1 实验动物 寄生虫学等级及监测 GB 14922.2 实验动物 微生物学等级及监测 GB 14924.3 实验动物 配合饲料营养成分 GB 14925 实验动物 环境及设施 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 30891 水产品抽样规范 GB/T 35892 实验动物 福利伦理审查指南 3.术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 贝类过敏原 mollusc a

4、llergen 贝类中能够诱发过敏反应的蛋白质。其中，贝类包括但不限于：牡蛎等双壳贝类、螺等单壳贝类、鱿鱼等头足贝类。3.2 贝类过敏原致敏性 mollusc allergen allergenicity 由贝类过敏原诱发机体发生过敏反应的能力。3.3 免疫球蛋白 E immunoglobulin E(IgE)是介导 I 型变态反应中起主要作用的免疫分子。3.4 过敏小鼠模型 A mouse model for mollusc allergy 利用小鼠建立评价贝类过敏原致敏性的动物模型。4.一般要求 4.1 实验人员应具有动物实验从业人员资格证书。4.2 小鼠动物应选用无特殊病原体级（SPF

5、级）BALB/c 雌性成年小鼠（6 周龄8 周龄），质量应符合 GB 14922.1 和 GB 14922.2 的规定，具有实验动物质量合格证。4.3 动物饲养实验小鼠饲养条件应符合 GB 14925 和 GB 19489 的规定，饮用水应符合 GB 5749 的规定，饲料应符合 GB 14924.3 的规定。T/SDIFST 00042021 4.4 本试验所需动物实验室应符合生物安全一级要求。实验室工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、动物房组成。其中，缓冲间面积应不小于 3 m2，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度为不少于 1.5 W/m3。紫外灯源距离地面不应超过 2.5 m，每次照射

6、时间为 20 min30 min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。4.5 动物伦理审批应按照 GB/T 35892 的规定对小鼠动物的福利伦理进行审查。4.6 评价实验结束后，小鼠动物尸体应按 GB 14925 的规定进行处理。4.7 贝类样品取样应符合 GB/T 30891 水产品抽样规范的规定。5.仪器设备 5.1 酶标仪 波长范围：330 nm1100 nm、吸光度范围：0.000 A4.000 A。5.2 分析天平 感量 0.01 g、0.0001 g。5.3 移液器 1 mL、5 mL。5.4 离心机 最大离心力大于 6000 g。5.5 微孔滤膜 滤膜孔径 0.22 m。5.6

7、 磁力搅拌器 转速范围:50 r/min1500 r/min。5.7 组织匀浆机 转速范围:5000 r/min12000 r/min、可均质样品范围:0.03 mL2000 mL。5.8 医用注射器 注射器容量 1 mL。5.9 低温冰箱 冷藏室温度 010、冷冻室-10-20。5.10 超低温冰箱 冷冻室温度-40-80。6.试剂与溶液配制 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T 6682一级水的规定。6.1 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS 缓冲液）称取 7.90 g 氯化钠、1.44 g 磷酸氢二钠、1.80 g 磷酸二氢钾、0.20 g 氯化钾，用 980 mL

8、水溶解，用盐酸调节 pH 至 7.2，再加水定容至 1000 mL，0.22 m 微孔滤膜过滤除菌，4 保存备用。或选用同类商品化产品。6.2 抽提缓冲液 称取 74.55 g 氯化钾，2.42 g 三羟甲基氨基甲烷，77.00 mg 二硫苏糖醇，用 800 mL 超纯水溶解后，调pH 至 7.5，然后用超纯水定容至 1000 mL。6.3 包被液T/SDIFST 00042021 称取 0.29 g 氢氧化钠和 0.16 g 碳酸钠溶于适量超纯水中，而后用超纯水定容至 100 mL。6.4 终止液 量取 10.88 mL 质量分数为 98%的浓硫酸，缓缓加入到适量超纯水中，待冷却至室温后，用

9、超纯水定容至 100 mL。6.5 TBST 缓冲液 称取 8.755 g 氯化钠，2.422 g 三羟甲基氨基甲烷，0.5 mL 吐温-20，加入 800 mL 超纯水溶解后，用 1 mol/L 的盐酸调 pH 至 7.5，定容到 1000 mL。6.6 羊抗鼠 IgE 二抗 纯度95%，可选用同类商品化产品。6.7 TMB 显色液 可选用各种同类商品化产品。6.8 氢氧化铝佐剂 可选用各种同类商品化产品。7.评价流程图 贝类过敏原致敏性评价流程包括 6 个步骤，评价流程图见图 1。图 1 贝类过敏原致敏性评价流程 8.评价程序 8.1 贝类过敏原样品制备 8.1.1 贝类取样参照 GB/T

10、 30891，将贝类去壳和内脏后取肌肉组织，剪碎成 1 mm 1 mm 1 mm 大小的碎块，组织匀浆机（5.8）10000 r/min 匀浆 5 min 后，加入 10 倍体积（W/V）的 95%酒精（V/V），于 4固定 8 h。8.1.2 用离心机（5.5）6000 g 离心 15 min，取沉淀。8.1.3 加入 2 倍体积（W/V）的丙酮乙醚混合液（V/V=2:1），覆膜，在 4操作间内，磁力搅拌器 1000 r/min 搅拌 4 h 后，6000 g 离心 15 min，取沉淀。此步骤重复三次。8.1.4 丙酮乙醚混合液 6000 g 离心 15 min，取沉淀，将沉淀在室温下通风

11、橱内干燥 8 h 后，研磨成粉末状，得贝类丙酮粉。8.1.5 取 10 g 贝类丙酮粉，加入 20 倍体积（W/V）的抽提缓冲液（6.2），磁力搅拌器搅拌（1000 r/min）抽提 12 h。8.1.6 6000 g 离心 15 min，取上清液。8.1.7 上清液用 0.22 m 微孔滤膜滤过除菌，冷冻干燥后-20 保存，得到过敏原样品。8.2 过敏小鼠模型构建 8.2.1 BALB/c 小鼠分组 商业无特殊病原体级（SPF 级）BALB/c 小鼠（雌性，6 周龄8 周龄，体重 20g2g），饲养于 SPF 级动物房（5.1）屏障环境中，温度为 252，湿度为 50%5%，12 h 光照，

12、12 h 黑夜，饲料不含贝类过敏原成份，自由摄食、饮水。所有小鼠饲养 1 周适应新环境后，随机等分为 2 组，分别为贝类过敏原组和阴T/SDIFST 00042021 性对照组（PBS 组），每组 5 只8 只。8.2.2 小鼠免疫方案 8.2.3 在试验第 0d、7d、14d、21d 和 28d 对贝类过敏原组每只小鼠分别腹腔注射给予 0.2 mL 含 0.05 mg 贝类过敏原（8.1）的 PBS 与氢氧化铝佐剂混合物（V/V=1:1），腹腔注射后 1 h 左右，按照表 1 对小鼠的过敏症状进行评分，随后尾静脉采血，分析血清中特异性 IgE 抗体效价；8.2.4 阴性对照组（PBS 组）的

13、每只小鼠分别腹腔注射给予 0.2 mL PBS 与氢氧化铝佐剂混合物（V/V=1:1）；8.2.5 第 35d，以 10 mg 贝类过敏原/只的剂量灌胃刺激小鼠，具体的操作见图 2。阴性对照组（PBS 组）给予相同体积的 PBS 溶液。灌胃后 1 h 内，按照表 1 对小鼠的过敏症状进行评分，随后尾静脉采血，分析血清中特异性 IgE 抗体效价；8.2.6 若与 PBS 组小鼠相比，贝类过敏原组小鼠的过敏症状评分和血清 IgE 抗体效价均明显高于给予 PBS组小鼠，且有统计学意义，认为过敏小鼠模型构建成功。图 2 小鼠免疫方案 8.3 过敏原给予 过敏小鼠动物模型构建成功后，贝类过敏原组每只小鼠

14、分别灌胃 0.2 mL 含 1.0 mg 贝类过敏原的 PBS溶液（8.1），灌胃后约 1 h，观察小鼠的过敏症状，随后尾静脉采血，测定血清中特异性 IgE 抗体的效价。阴性对照组（PBS 组）的每只小鼠分别灌胃 0.2 mL PBS 溶液。8.4 评价方法 8.4.1 小鼠过敏症状评分 过敏原给予后约 1 h 观察小鼠的过敏症状，根据小鼠过敏症状的严重程度进行评分。小鼠过敏症状评分表见表 1。表 1 小鼠过敏症状评分表 过敏症状 评分 无症状 0 反复挠耳朵、鼻子 1 眼睛、耳朵肿胀；腹泻；呼吸急促；活动减少 2 嘴巴、尾巴发绀；哮喘；呼吸困难 3 肌肉收缩痉挛 4 休克；死亡 5 8.4.

15、2 小鼠血清 IgE 抗体效价测定 8.4.2.1 动物给药后 1 h 左右进行采血，全血离心（1000 g,10 min）后取血清，如需暂存应保存于-18及以下。T/SDIFST 00042021 8.4.2.2 将贝类过敏原溶于包被液（6.3）中（10 g/mL）。8.4.2.3 将含过敏原的包被液加入到 96 孔酶标板中（100 L/孔），4包被过夜，以不含过敏原的包被液为对照组。8.4.2.4 用 TBST 缓冲液（6.5）洗板 3 次后加入封闭液（5%脱脂乳，300 L/孔）。8.4.2.5 酶标板于 37封闭 2 h，封闭完成后用 TBST 缓冲液洗板 3 次。8.4.2.6 加入

16、用 1%脱脂乳按 1:10（V/V）稀释的小鼠血清样品（100 L/孔），4孵育过夜。8.4.2.7 次日，取出酶标板后用 TBST 缓冲液洗板 5 次。8.4.2.8 加入 1%脱脂乳稀释的二抗（1:1000 稀释羊抗鼠 IgE 二抗，100 L/孔），37孵育 2 h。6.4.2.9 用 TBST 洗板 5 次，再加入 TMB 显色液（100 L/孔），37孵育 20 min。8.4.2.10 加入终止液（6.4，50 L/孔）终止反应。8.4.2.11 用酶标仪（5.2）测定 450 nm 处的吸光值（OD450nm），并记录。小鼠血清 IgE 抗体效价按公式（1）计算：R=（A2A0）

17、A1A0 100%（1）式中：R血清 IgE 抗体效价；A2样品组的吸光度；A0空白孔的吸光度；A1对照组的吸光度。以平行样的平均值为最终血清 IgE 抗体效价，计算结果保留到小数点后两位。8.5 评价结论 8.5.1 依据 8.4.1 小鼠过敏症状评分和 8.4.2 血清 IgE 抗体效价结果对致敏性进行评价。8.5.2 给予过敏原后小鼠的过敏症状评分和血清 IgE 抗体效价与给予过敏原前小鼠无显著差异，则认为该样品无致敏性。8.5.3 与灌胃给予过敏原前小鼠相比，给予过敏原后小鼠的过敏症状评分和血清 IgE 抗体效价均明显高于给予过敏原前小鼠，且有统计学意义，则认为该样品有致敏性。8.6

18、评价报告 根据 8.5 填写贝类过敏原致敏性评价报告，以小鼠过敏症状评分的平均值和血清 IgE 抗体效价的平均值对贝类过敏原致敏性进行评价，报告格式见附录 A。T/SDIFST 00042021 附 录 A（资料性）评价报告 贝类过敏原的小鼠模型致敏性评价报告见表A.1。表表 A.1 贝类过敏原贝类过敏原的的小鼠小鼠模型模型致敏性致敏性评价报告评价报告 样品受理编号：第 1 页/共 1 页 样品名称：检验类别：委托 送检单位：检验目的：致敏性评价 检验日期：规格数量：一、试验目的 经口给予受试物后，在短时间内观察小鼠动物所产生的过敏反应，评价贝类过敏原的致敏性。二、试验条件 1.试验动物：选用 SPF 级健康 BALB/c 雌性小鼠，体重 18g22g。于动物房外检室适应 7d，健康状况良好。2.试验动物饲养环境：SPF 级动物实验室。温度为 252，湿度为 50%5%，12 h 光照，12 h 黑夜，饲料不含贝类过敏原成份，自由摄食、饮水。三、试验方法 依据 XXXX 的规定执行。四、试验结果（见下表）表 贝类过敏原致敏性小鼠评价 试验组别 动物数（只）过敏反应 死亡动物数（只）死亡率（%）过敏症状评分 血清 IgE 抗体效价 试验组 对照组 判定结论：该贝类过敏原具有致敏性，不具有致敏性。评价：审核：检验机构盖章 年 月 日