C酶的催化活性和调节机制.pptx

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1、3.6 酶促反应动力学v3.6.1 酶与底物之间的作用酶的中间产物理论 酶分子酶分子（E）表面与底物表面与底物（S）结合形结合形成不稳定中间产物即酶成不稳定中间产物即酶-底物复合物底物复合物（ES），它较底物需要较少的活化能就可继续反应，它较底物需要较少的活化能就可继续反应，分解成产物分解成产物（P）并释放酶。因此，并释放酶。因此，ES 浓度浓度决定着整个酶促反应速度。决定着整个酶促反应速度。S+E ES E+P第1页/共54页3.6.1 酶与底物之间的作用v 米氏方程 当当 Km=S 时，则时，则 v=1/2 Vmax，即当酶促，即当酶促反应速度达到其最大反应速度的一半时，反应速度达到其最大

2、反应速度的一半时，Km值即为此时的底物浓度，其单位是值即为此时的底物浓度，其单位是 mol/L。当当 Km远大于远大于 S 时，分母时，分母S不计，则不计，则v=Vmax S/Km，初速度与底物浓度呈一级反应。，初速度与底物浓度呈一级反应。当当 Km远小于远小于 S 时，时，Km不计，则不计，则v=Vmax，初速度与底物浓度呈零级反应。，初速度与底物浓度呈零级反应。v=VmaxSKm +S第2页/共54页3.6.1 酶与底物之间的作用KmVmax12v=VmaxS/Km第3页/共54页3.6.1 酶与底物之间的作用v米氏常数（Km）的特性 Km与酶的性质有关，与酶浓度无关；与酶的性质有关，与酶

3、浓度无关；Km最小的底物为该酶的最适底物；最小的底物为该酶的最适底物；Km值与温度、值与温度、pH等环境因素相关；等环境因素相关；1/Km近似表示对底物亲和性大小；近似表示对底物亲和性大小；K3K1和和K2时，时，KmKs Km随不同底物而异（酶专一性判断指标）随不同底物而异（酶专一性判断指标）第4页/共54页米氏方程求解方法vLineweaver-Burk法 (双倒数法）横轴截距为横轴截距为-1/Km，纵轴截距，纵轴截距 1/Vmax，斜率，斜率Km/Vmax。缺点缺点：点过分集中在直线左下：点过分集中在直线左下 方，而低浓度方，而低浓度S点因倒数后误点因倒数后误 差较大，偏离直线，影响结果

4、。差较大，偏离直线，影响结果。1v=KmVmax.1S+1Vmax第5页/共54页米氏方程求解方法vHanes-Woolf法横轴截距为横轴截距为-Km，纵轴截，纵轴截 距距Km/Vmax，斜率，斜率1/Vmax。KmVmaxSVmaxv=+SKm/Vmax第6页/共54页米氏方程求解方法vWoolf-Hofstee法v=-Km.Vmaxv+SVmax/Km以以vv/S作图作图,得一直得一直线。横轴截距为线。横轴截距为Vmax/Km,纵轴截距纵轴截距Vmax,斜率斜率-Km第7页/共54页3.6.2 单底物较复杂的酶反应v多种活性中间产物 v底物的抑制：酶分子上有两个底物结合位点，：酶分子上有两

5、个底物结合位点，一为高亲和性，另一个为低亲和性。当其完一为高亲和性，另一个为低亲和性。当其完全被底物占据时会抑制高亲和性位点的结合全被底物占据时会抑制高亲和性位点的结合作用，使酶促反应速度降低，如果糖二磷酸作用，使酶促反应速度降低，如果糖二磷酸酶。酶。v多个活性部位：有多个亚基、多个活性中心，：有多个亚基、多个活性中心，其动力学实验常很复杂，不符合米氏方程。其动力学实验常很复杂，不符合米氏方程。E+S ES E+PE+S ES ES E+P第8页/共54页3.6.3 pH影响下酶促反应动力学 E2-ES2-K2 K2 EH-+S ESH-EH-+P K1 K1 EH2 ESH2v =VmaxS

6、Km)+S(1+H+K2H+)K1(1+H+K1+K2H+pH对酶构象对酶构象的影响即对的影响即对其解离基团其解离基团的影响，就的影响，就是是H+和解离和解离基团间的结基团间的结合与解离的合与解离的变化过程变化过程第9页/共54页3.6.4 酶的抑制动力学（1）不可逆抑制不可逆抑制：抑制剂与酶分子中的必要基团发生共价结合，使酶失活。：抑制剂与酶分子中的必要基团发生共价结合，使酶失活。v 按其选择性差异，不可逆抑制剂分：按其选择性差异，不可逆抑制剂分：专一性：仅与活性部位有关的基团反应；专一性：仅与活性部位有关的基团反应；非专一性：可与几类基团反应。如有机磷、砷、重金属（非专一性：可与几类基团反

7、应。如有机磷、砷、重金属（Ag、Pb、Hg）、氰化物）、氰化物(沙林毒气）、沙林毒气）、CO及青霉素等。及青霉素等。第10页/共54页3.6.4 酶的抑制动力学（2）可逆抑制：竞争性抑制竞争性抑制：加入加入 I 后，后，Vmax不变，不变，Km变大变大(KmKm)I与与S结构相似结构相似,但但E不能同时与不能同时与S和和I结合结合第11页/共54页3.6.4 酶的抑制动力学（2）可逆抑制：非竞争性抑制非竞争性抑制：加入加入 I 后，后，Vmax变小，变小，Km不变不变(Km=Km)第12页/共54页3.6.4 酶的抑制动力学（2）可逆抑制：反竞争性抑制反竞争性抑制：加入加入 I 后，后，Km

8、和和Vmax都变小，都变小，且且KmKm,Vmax Vmax第13页/共54页3.6.5 双底物酶促反应动力学v顺序有序反应(如如NAD+或或NADP+的脱氢酶的脱氢酶)A B P Q E E EA EAB EPQ EQv顺序随机反应(如肌酸激酶使肌酸磷酸化反应如肌酸激酶使肌酸磷酸化反应)v乒乓反应或双-置换反应(如氨基酸转移酶如氨基酸转移酶)A P B Q E E EA FP F FB EQ第14页/共54页四、酶的调节作用v生命现象调节和控制层次：整体水平调控整体水平调控：神经系统和激素；：神经系统和激素；器官、组织和细胞水平调控器官、组织和细胞水平调控：体液；：体液；分子水平调控分子水平

9、调控：酶为中心的调控。：酶为中心的调控。v酶分子的调控方式：环境因素调控、别构调控、共价调控、酶原激活调控、：环境因素调控、别构调控、共价调控、酶原激活调控、分子聚合调控分子聚合调控。第15页/共54页 酶自身活性的调控4.1.1 环境因素调控v环境因素环境因素改变使酶构象稳定的力的平衡改变使酶构象稳定的力的平衡;v环境因素的种类环境因素的种类：pH、温度、金属离子、温度、金属离子、有机溶剂等；有机溶剂等；例如例如溶菌酶溶菌酶：在细胞内合成后即具有完整：在细胞内合成后即具有完整的空间结构，但细胞内的空间结构，但细胞内pH值约为中性，酶值约为中性，酶的活力很低，当溶菌酶分泌到细胞外偏酸的活力很低

10、，当溶菌酶分泌到细胞外偏酸性环境中性环境中pH 5时，溶菌酶的活性显著提高。时，溶菌酶的活性显著提高。第16页/共54页 别构酶的调控v别构酶的特点：一般有多个亚基一般有多个亚基,分子量大，结分子量大，结构复杂。有负责调节的别构中心和负责催化的活性构复杂。有负责调节的别构中心和负责催化的活性中心。两中心位于不同亚基中心。两中心位于不同亚基,或同一亚基的不同部或同一亚基的不同部位。位。v别构效应：调节物或效应物与别构中心结合后，调节物或效应物与别构中心结合后，诱导或稳定酶分子的某构象，使酶催化中心的催化诱导或稳定酶分子的某构象，使酶催化中心的催化作用受到调节，从而调节酶反应速度和代谢过程。作用受

11、到调节，从而调节酶反应速度和代谢过程。同促效应：酶分子上有两个以上底物结合中心，酶分子上有两个以上底物结合中心，通过酶上结合底物分子数量而调节其活性。通过酶上结合底物分子数量而调节其活性。异促效应：通过非底物分子的结合调节其活性。通过非底物分子的结合调节其活性。第17页/共54页 别构酶的调控v别构酶的动力学特征：不遵循米氏动力学方不遵循米氏动力学方程，具有正协同效应和负协同效应。程，具有正协同效应和负协同效应。故有米氏活力酶、负协同效应酶和正协同效故有米氏活力酶、负协同效应酶和正协同效应酶的区分（应酶的区分（Koshland规则规则）Rs 为协同指数，为协同指数，n代表协同系数（代表协同系数

12、（Hill系数）。系数）。Rs=81：米氏方程：米氏方程;Rs 81：正协同：正协同;Rs 81：负协同。：负协同。酶与配基结合达到酶与配基结合达到0.9饱和度时的配基浓度饱和度时的配基浓度酶与配基结合达到酶与配基结合达到0.1饱和度时的配基浓度饱和度时的配基浓度Rs=811/n第18页/共54页 别构酶的调控v别构酶机理模型 MWC模型模型（齐变模型）：（齐变模型）：1965年年Monod,Wyman和和Changeux提出。提出。无无RT混合态混合态第19页/共54页 别构酶的调控v别构酶机理模型KNF模型模型（序变模型）：（序变模型）：1966年年Koshland,Nemethy 和和F

13、ilmer提出提出无无RT平衡态平衡态存在存在RT混合态混合态第20页/共54页 别构酶的调控v研究得较为清楚的别构酶是研究得较为清楚的别构酶是E.coli.天冬氨酸转氨天冬氨酸转氨甲酰酶甲酰酶(ATCase),它催化下列反应：它催化下列反应：这个反应是合成这个反应是合成CTP的第一步的第一步,它受终产物它受终产物CTP反馈抑制反馈抑制,而被而被ATP激活。酶反应速度与底物激活。酶反应速度与底物浓度的关系曲线为浓度的关系曲线为S型型,说明底物有正协同性。加说明底物有正协同性。加入负效应物入负效应物CTP,活力降低活力降低,S型更明显。加入正效型更明显。加入正效应物应物ATP,活力升高活力升高,

14、S型趋势变小，接近双曲线。型趋势变小，接近双曲线。v大多数别构酶均有这种大多数别构酶均有这种S型曲线。型曲线。氨甲酰磷酸+L-Asp N-氨酰基-L-Asp+磷酸第21页/共54页 别构酶的调控v别构酶用加热、化学试剂或其它方法处理后，别构酶用加热、化学试剂或其它方法处理后，它仍具有活力，但丧失了酶的调节性质。它仍具有活力，但丧失了酶的调节性质。如如ATC酶经过温和的化学处理酶经过温和的化学处理,如用对羟基汞苯如用对羟基汞苯甲酸（甲酸（PCMB）处理可解聚为两个催化亚基（为）处理可解聚为两个催化亚基（为三聚体）和三聚体）和 3个调节亚基（为二聚体）。催化亚个调节亚基（为二聚体）。催化亚基仍有催

15、化活力基仍有催化活力,但不再受效应物影响但不再受效应物影响,调节亚基调节亚基无催化活力无催化活力,但仍能结合效应物。更剧烈的处理但仍能结合效应物。更剧烈的处理,如用如用SDS处理处理,则催化亚基和调节亚基都各解聚则催化亚基和调节亚基都各解聚成成6个单体。个单体。第22页/共54页 别构酶的调控vATC酶受酶受CTP抑制的生物学意义是避免合成过抑制的生物学意义是避免合成过多的多的CTP,而受而受ATP激活是为了保持嘌呤和嘧啶激活是为了保持嘌呤和嘧啶核苷酸合成的速度相称核苷酸合成的速度相称,以满足合成核酸的需要。以满足合成核酸的需要。v别构酶在代谢调节中起着重要的作用。在合成别构酶在代谢调节中起着

16、重要的作用。在合成代谢中催化第一步反应的酶或分支点的第一个代谢中催化第一步反应的酶或分支点的第一个酶往往是别构酶，以避免形成一系列过多的中酶往往是别构酶，以避免形成一系列过多的中间体和终产物。在分解代谢途径中，则有一个间体和终产物。在分解代谢途径中，则有一个或几个关键酶为别构酶。或几个关键酶为别构酶。第23页/共54页 别构酶的调控v如糖酵解途径中的如糖酵解途径中的磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶是一个重要的是一个重要的调节酶，它受调节酶，它受ATP抑制，而抑制，而AMP可逆转可逆转 ATP的抑制作用。故当的抑制作用。故当 ATPAMP比值降低时，比值降低时，也就是细胞内能荷降低时，糖酵解被促进，从也

17、就是细胞内能荷降低时，糖酵解被促进，从而提供较多的能量。而提供较多的能量。第24页/共54页4.1.3 共价调节酶v通过在酶蛋白某些氨基酸残基上增、减基团的办法通过在酶蛋白某些氨基酸残基上增、减基团的办法调节酶的活性态与非活性态间的相互转化（调节酶的活性态与非活性态间的相互转化（可逆可逆）。）。v有些酶存在两种形式，在其它酶的共价修饰后可以有些酶存在两种形式，在其它酶的共价修饰后可以相互转变，如磷酸化酶催化下述反应：相互转变，如磷酸化酶催化下述反应：磷酸化酶磷酸化酶a:不依赖不依赖AMP即有活性即有活性;Ser-14磷酸化磷酸化;磷酸化酶磷酸化酶b:依赖依赖AMP才有活性才有活性;Ser-14

18、无磷酸无磷酸化。化。b a 转变需转变需Mg2+、ATP(糖原糖原)n+磷酸磷酸 (糖原糖原)n-1+1-磷酸磷酸-D-Glc第25页/共54页4.1.3 共价调节酶A.共价调节酶的类型磷酸化磷酸化/去磷酸化去磷酸化乙酰化乙酰化/去乙酰化去乙酰化腺苷酰化腺苷酰化/去腺苷酰化去腺苷酰化尿苷酰化尿苷酰化/去尿苷酰化去尿苷酰化甲基化甲基化/去甲基化去甲基化S-S/SH糖基化糖基化脂酰化脂酰化第26页/共54页B.常见共价调节酶酶酶来源来源修饰机制修饰机制活性变化活性变化糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶真核细胞生物真核细胞生物磷酸化磷酸化/去磷酸化去磷酸化/磷酸化酶激酶磷酸化酶激酶哺乳动物哺乳动物磷酸化磷酸化

19、/去磷酸化去磷酸化/糖原合成酶糖原合成酶真核细胞生物真核细胞生物磷酸化磷酸化/去磷酸化去磷酸化/丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶真核细胞生物真核细胞生物磷酸化磷酸化/去磷酸化去磷酸化/激素敏感性脂酶激素敏感性脂酶哺乳动物哺乳动物磷酸化磷酸化/去磷酸化去磷酸化/乙酰乙酰CoA羧化酶羧化酶哺乳动物哺乳动物磷酸化磷酸化/去磷酸化去磷酸化/谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶大肠杆菌大肠杆菌腺苷酰化腺苷酰化/去腺苷酰化去腺苷酰化/黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶哺乳动物哺乳动物S-S/SH/第27页/共54页4.1.4 酶原的激活v酶原激活的特点：不可逆的共价修饰不可逆的共价修饰调节；调节；在正常生理条件下，酶原不会过在正常

20、生理条件下，酶原不会过 早地在不适当的地方激活；早地在不适当的地方激活；激活酶受抑制剂调控；激活酶受抑制剂调控；酶原的激活伴随着信号的放大。酶原的激活伴随着信号的放大。第28页/共54页4.1.4 酶原的激活v酶原激活常见的类型：A.消化酶酶原的激活消化酶酶原的激活：胃蛋白酶胃蛋白酶：从：从N端切除端切除42个氨基酸，胃酸或胃蛋白酶；个氨基酸，胃酸或胃蛋白酶；胰蛋白酶胰蛋白酶：从：从N端切除端切除6个氨基酸，肠激酶或胰蛋白酶；个氨基酸，肠激酶或胰蛋白酶；糜蛋白酶糜蛋白酶：内切：内切14-15Aa，147-148Aa，胰蛋白酶；（羧肽酶、弹性蛋，胰蛋白酶；（羧肽酶、弹性蛋白酶）白酶）第29页/共

21、54页 B凝血酶和血液凝固 内源性途径内源性途径 损伤表面 激肽原 激肽 释放酶 外源性途径外源性途径 XII XIIa创伤 XI XIa IX IXa VIIa VII VIIIVIIIa 组织因子 X Xa X V Va 凝血酶原（IIII）凝血酶（IIaIIa）血纤蛋白原（I I）血纤蛋白（IaIa）XIII XIIIa 交联血纤蛋白凝块 创伤第30页/共54页C.某些蛋白激素的激活v胰岛素、甲状旁腺素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素等；胰岛素、甲状旁腺素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素等；v胰岛素：前胰岛素原（胰岛素：前胰岛素原（N端切除端切除20信号肽）信号肽）-胰岛素原（进入内质网腔，

22、在胰岛素原（进入内质网腔，在中间切下中间切下29-35AA的的C肽）肽）-A链和链和B链。链。人、猪和牛的人、猪和牛的C肽长度分别为肽长度分别为31AA、29AA和和26AA。第31页/共54页D.发育过程和酶原激活v动物在发育的特定阶段，激活特定的酶发挥特殊的作用动物在发育的特定阶段，激活特定的酶发挥特殊的作用。青蛙青蛙：在蝌蚪去除尾部时，体内胶原蛋白酶被激活；：在蝌蚪去除尾部时，体内胶原蛋白酶被激活；哺乳动物哺乳动物：分娩后，子宫内部的许多胶原蛋白也被激活的胶原蛋白酶降：分娩后，子宫内部的许多胶原蛋白也被激活的胶原蛋白酶降解；解；蚕蛾蚕蛾：在蛹成蛾过程中，激活茧酶，将蚕茧降解。：在蛹成蛾过

23、程中，激活茧酶，将蚕茧降解。第32页/共54页E.酶分子的聚合和解聚v由于酶与一些小分子调节因子的由于酶与一些小分子调节因子的非共价非共价结合，结合，引起酶的聚合和解聚，实现酶在活性和无活引起酶的聚合和解聚，实现酶在活性和无活性间相互转化。如性间相互转化。如Glu脱氢酶和乙酰脱氢酶和乙酰CoA羧羧化酶化酶乙酰乙酰CoA羧化酶羧化酶：催化脂肪酸合成。亚基的聚：催化脂肪酸合成。亚基的聚合和解聚，构成酶的三种存在形态：合和解聚，构成酶的三种存在形态：四个不同的亚基四个不同的亚基 原体原体 多聚体多聚体 无活性无活性 无活性无活性 有活性有活性ATP-Mg2+柠檬酸异柠檬酸柠檬酸异柠檬酸第33页/共5

24、4页常见酶的聚合和解聚与酶活性常见酶的聚合和解聚与酶活性酶酶来源来源聚合聚合/解聚解聚影响因素影响因素活性变化活性变化磷酸果糖磷酸果糖激激 酶酶兔骨骼肌兔骨骼肌聚合聚合解聚解聚F-6-P,FDPATP异柠檬酸异柠檬酸脱脱 氢氢 酶酶牛心牛心聚合聚合解聚解聚ADPNADH苹苹 果果 酸酸脱脱 氢氢 酶酶猪心猪心单体单体二聚体二聚体NAD+谷谷 氨氨 酸酸脱脱 氢氢 酶酶牛肝牛肝聚合聚合解聚解聚ADP，LeuGTP(GDP)第34页/共54页4.2 参与代谢调控的酶v4.2.1 细胞空间上酶分布的分隔性：不同部位分布不同的酶，保证生物反应不不同部位分布不同的酶，保证生物反应不互相干扰。如互相干扰。

25、如脂肪酸的氧化脂肪酸的氧化和和合成合成分处于线粒体分处于线粒体内外，细胞液中的脂酰内外，细胞液中的脂酰CoA需经需经肉毒碱脂酰基转肉毒碱脂酰基转移酶移酶I和和II催化，才能进入线粒体内进行催化，才能进入线粒体内进行-氧化氧化;而胞液要进行脂肪酸合成，线粒体中的乙酰而胞液要进行脂肪酸合成，线粒体中的乙酰CoA需经柠檬酸合成酶催化，与草酰乙酸缩合成柠檬需经柠檬酸合成酶催化，与草酰乙酸缩合成柠檬酸酸(三羧酸转运体系三羧酸转运体系)，进入细胞液后，再经柠檬，进入细胞液后，再经柠檬酸裂合酶催化，释放出乙酰酸裂合酶催化，释放出乙酰CoA,参与脂肪酸合参与脂肪酸合成。成。第35页/共54页 细胞膜中的酶v负

26、责个区域间传送代谢物及离子。负责个区域间传送代谢物及离子。周围蛋白周围蛋白：果糖二磷酸醛缩酶、甘油醛磷酸脱氢酶等。与磷脂的极性头部：果糖二磷酸醛缩酶、甘油醛磷酸脱氢酶等。与磷脂的极性头部由静电引力相连，易于用盐溶液抽提出来；由静电引力相连，易于用盐溶液抽提出来；镶嵌蛋白镶嵌蛋白：氨基肽酶、：氨基肽酶、-D-葡萄糖苷酶、腺苷酸三磷酸酶等。与磷脂的葡萄糖苷酶、腺苷酸三磷酸酶等。与磷脂的烃链因疏水作用而结合烃链因疏水作用而结合,只能用去污剂或有机溶剂抽提出来。只能用去污剂或有机溶剂抽提出来。第36页/共54页 细胞核中的酶v核液中的酶：糖酵解酶群，戊糖磷酸途径酶：糖酵解酶群，戊糖磷酸途径酶群，乳酸脱

27、氢酶，苹果酸脱氢酶，异柠檬酸群，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶；脱氢酶；v与染色质结合的酶：DNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶,RNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶II和和III等；等；v核仁中的酶：核糖酶，：核糖酶，RNA甲基转移酶甲基转移酶,RNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶I等；等；v核膜酶：葡萄糖：葡萄糖-6-磷酸酶，酸性磷酸酶等。磷酸酶，酸性磷酸酶等。第37页/共54页 线粒体中的酶v间质：三羧酸循环酶群，脂肪酸：三羧酸循环酶群，脂肪酸-氧化酶群，氧化酶群，丙酮酸羧化酶，谷氨酸脱氢酶等；丙酮酸羧化酶，谷氨酸脱氢酶等；v内膜：NADH脱氢酶脱氢酶+呼吸链，腺苷三磷酸呼吸链，腺苷三磷酸酶，己

28、糖激酶，细胞色素酶，己糖激酶，细胞色素C氧化酶等；氧化酶等；v内外膜间空隙：腺苷酸激酶，核苷酸磷酸激：腺苷酸激酶，核苷酸磷酸激酶等；酶等；v外膜：NADH脱氢酶，细胞色素脱氢酶，细胞色素b5还原酶，还原酶，胺氧化酶，胆碱磷酸转移酶，磷酸脂酶胺氧化酶，胆碱磷酸转移酶，磷酸脂酶A2，酰基酰基CoA合成酶等。合成酶等。第38页/共54页 溶酶体中的酶v含含60多种水解酶多种水解酶,多适用于酸性反应。多适用于酸性反应。蛋白水解酶：组织蛋白酶，弹性酶，胶原酶：组织蛋白酶，弹性酶，胶原酶等；等；糖苷水解酶：溶菌酶，：溶菌酶，-D-葡萄糖胺酶等；葡萄糖胺酶等；核酸水解酶：DNase II，RNase II；

29、脂类水解酶：磷酸脂酶：磷酸脂酶A1和和A2等；等；其他：酸性磷酸酶、芳香基硫酸酶等。：酸性磷酸酶、芳香基硫酸酶等。第39页/共54页 内质网酶v蛋白质的合成和传送、脂肪酸的合成及外来蛋白质的合成和传送、脂肪酸的合成及外来物质的代谢的场所。物质的代谢的场所。平滑内质网：胆固醇合成酶，肉毒碱脂酰转移酶、药物代谢酶等；：胆固醇合成酶，肉毒碱脂酰转移酶、药物代谢酶等；粗内质网（胞液面）：蛋白质合成酶，葡萄糖（胞液面）：蛋白质合成酶，葡萄糖-6-磷酸酶、磷酸酶、ATPase等；等；粗内质网(腔面)：核苷二磷酸酶，：核苷二磷酸酶，-D-葡萄糖苷酶等。葡萄糖苷酶等。第40页/共54页 胞液酶v碳水化合物代谢

30、酶群：糖酵解酶群，糖原：糖酵解酶群，糖原合成酶，戊糖磷酸代谢途径酶群等；合成酶，戊糖磷酸代谢途径酶群等；v脂类代谢酶群：乙酰：乙酰CoA羧化酶，脂肪酸羧化酶，脂肪酸合成酶系等；合成酶系等；v氨基酸和蛋白质代谢酶群：天冬氨酸氨基：天冬氨酸氨基转移酶，氨酰转移酶，氨酰tRNA合成酶等；合成酶等；v核酸合成酶：核苷激酶，核苷酸激酶等。：核苷激酶，核苷酸激酶等。第41页/共54页4.2.8 限速步骤中调控作用的关键酶v在代谢反应中有一些反应实际上只有一个方向；这一类酶一般为别构酶。在代谢反应中有一些反应实际上只有一个方向；这一类酶一般为别构酶。如：糖酵解中的磷酸果糖激酶，催化如：糖酵解中的磷酸果糖激酶

31、，催化1-磷酸果糖生成磷酸果糖生成1,6-二磷酸果糖；二磷酸果糖；还有硫激酶还有硫激酶(脂酰脂酰CoA 合成酶合成酶)、硫酯酶、乙酰羧化酶、丙二酰、硫酯酶、乙酰羧化酶、丙二酰CoA脱脱羧酶等。羧酶等。第42页/共54页4.2.8 限速步骤中调控作用的关键酶v同工酶：理化性质不同：理化性质不同,而催化相同反应的一类而催化相同反应的一类酶酶.对细胞生长、发育、遗传及代谢调节都很重对细胞生长、发育、遗传及代谢调节都很重要。要。不同脏器来源的同工酶，依机体需要，完成同一不同脏器来源的同工酶，依机体需要，完成同一代谢任务，如代谢任务，如LDH1-5。相同脏器来源的同工酶，各自起催化作用。如在相同脏器来源

32、的同工酶，各自起催化作用。如在肝脏中己糖激酶和葡萄糖激酶，都可以催化葡萄肝脏中己糖激酶和葡萄糖激酶，都可以催化葡萄糖磷酸化，但在正常血糖浓度范围内，只有己糖糖磷酸化，但在正常血糖浓度范围内，只有己糖激酶达到最大反应速度，而葡萄糖激酶不同，在激酶达到最大反应速度，而葡萄糖激酶不同，在血糖浓度增高时，催化反应速度也同时增长。血糖浓度增高时，催化反应速度也同时增长。第43页/共54页4.3 酶调控作用的机制v酶调控作用的连锁性和放大作用酶调控作用的连锁性和放大作用 如激素如激素-cAMP调节系统。调节系统。v酶调控作用的反馈性酶调控作用的反馈性：即某一序列反应的终产物：即某一序列反应的终产物(效效应

33、物应物)对催化该反应序列第一步反应的酶对催化该反应序列第一步反应的酶(常为别构常为别构酶酶)所呈现的效应，分正、负反馈。所呈现的效应，分正、负反馈。如如 天冬氨酸和氨甲酰磷酸合成天冬氨酸和氨甲酰磷酸合成CTP,CTP能反馈能反馈抑制催化第一步反应的酶，即天冬氨酸甲酰基转抑制催化第一步反应的酶，即天冬氨酸甲酰基转移酶（移酶（ATC），从而减慢其自身的合成；当由于），从而减慢其自身的合成；当由于代谢活动使代谢活动使CTP浓度减低很多时，此抑制减弱。浓度减低很多时，此抑制减弱。第44页/共54页4.3 酶调控作用的机制v酶合成的诱导和阻遏酶合成的诱导和阻遏：诱导剂、诱导作用和诱导酶诱导剂、诱导作用和

34、诱导酶 许多细菌如许多细菌如 能在能在Glc培养基上正常生长发育，却不能立即利用培养基上正常生长发育，却不能立即利用Gal。若将其移入含若将其移入含Gal培养基，培养基，2min后。它们能合成利用后。它们能合成利用Gal的三种酶即的三种酶即-Gal苷酶、苷酶、Gal苷通透酶和硫苷通透酶和硫Gal苷转乙酰基酶，一旦苷转乙酰基酶，一旦Gal耗尽或重移回耗尽或重移回Glc培养基上，这些酶水平立即下降。培养基上，这些酶水平立即下降。第45页/共54页4.3 酶调控作用的机制v酶合成的诱导和阻遏酶合成的诱导和阻遏：阻遏剂、辅阻遏剂和阻遏作用阻遏剂、辅阻遏剂和阻遏作用 当当 培养基中有培养基中有Trp存在

35、时，参与存在时，参与 Trp合成过程的所有酶的生成受到阻遏。合成过程的所有酶的生成受到阻遏。操纵子模型操纵子模型（1961年，年，Monod&Jacob）前提前提：A.酶蛋白基因主要有：结构基因、操纵酶蛋白基因主要有：结构基因、操纵 基因和基因和 调控基因；调控基因；B.基因表达共同控制部位：操纵子单位基因表达共同控制部位：操纵子单位如如 Gal 操纵子。操纵子。第46页/共54页 兴奋性和抑制性调控蛋白v兴奋性调控蛋白 糖原磷酸化酶激酶糖原磷酸化酶激酶(PhK)由（由（）4 组成组成,催化亚基为催化亚基为,和和亚基为别构亚基亚基为别构亚基,最最令人感兴趣的是令人感兴趣的是,它是一种钙调蛋白。

36、它是一种钙调蛋白。v抑制性调控蛋白 这类蛋白与酶结合紧密，如牛胰蛋白酶这类蛋白与酶结合紧密，如牛胰蛋白酶抑制蛋白与胰蛋白酶结合后，解离常数只有抑制蛋白与胰蛋白酶结合后，解离常数只有10-13 M。在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存。在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在，可能对于调节激活后的水解酶具有作用。在，可能对于调节激活后的水解酶具有作用。第47页/共54页五、酶活性分析v5.1 酶活性概念:催化一定化学反应的能力催化一定化学反应的能力酶活性单位（酶活性单位（U）：单位时间内催化一定底物消耗和产物生成量的酶量：单位时间内催化一定底物消耗和产物生成量的酶量.(U/ml U/g)IU：25C、最适底物

37、浓度、最适、最适底物浓度、最适pH值、最适缓冲液等条件下，每分值、最适缓冲液等条件下，每分钟催化钟催化1mol/L 底物转化的酶量。底物转化的酶量。Katal（Kat）：最适条件下，每秒钟催化：最适条件下，每秒钟催化1mol/L底物转化的酶量。底物转化的酶量。IU和和Kat换算关系换算关系:1Kat=6107IU第48页/共54页5.2 影响酶活性的因素v底物种类和浓度底物种类和浓度：一般要求底物浓度在：一般要求底物浓度在7-10倍倍Km值，以最适底物为参照值，以最适底物为参照,在在1-3min内测内测定定.vpH值值：常见几种酶的最适：常见几种酶的最适pH值值(具有具有Vmax的的pH)酶酶

38、底底 物物最适最适pHpH值值胃蛋白酶胃蛋白酶鸡蛋清蛋白鸡蛋清蛋白血红蛋白血红蛋白1.52.2淀粉酶淀粉酶淀粉淀粉4.5胰蛋白酶胰蛋白酶苯丙酰精氨酰胺苯丙酰精氨酰胺7.7精氨酸酶精氨酸酶精氨酸精氨酸9.7第49页/共54页5.2 影响酶活性的因素v酶反应最适酶反应最适pH的测定的测定:钟型或倒钟型或倒U形曲线形曲线.最适最适pH与酶的来源、代谢中所处地位及缓冲液种类有与酶的来源、代谢中所处地位及缓冲液种类有关。关。v酶的酶的pH稳定性测定稳定性测定:测定不同测定不同pH缓冲液酶活力；缓冲液酶活力；v酶反应的最适温度和测定酶反应的最适温度和测定：钟型或倒钟型或倒U形曲线形曲线.最适温度与酶的来源

39、有关。最适温度与酶的来源有关。v酶的热稳定性酶的热稳定性：测定不同温度下的酶活力测定不同温度下的酶活力。v其他因素其他因素：离子（金属离子等）、小分子有机：离子（金属离子等）、小分子有机物（巯基乙醇、物（巯基乙醇、EDTA等）等）酶激活剂酶激活剂第50页/共54页5.3 酶活性的保持v缓冲液和缓冲液和pH值值：常用磷酸盐缓冲液，常用磷酸盐缓冲液，pH值与值与pKa相差最好（相差最好（6-8），缓冲液离子强度为），缓冲液离子强度为10-50mmol/L。v温度温度：一般在一般在4C或或4C以下，但一些酶在温度以下，但一些酶在温度低时会引起高级结构破坏而失活低时会引起高级结构破坏而失活,如如Glu

40、脱氢酶脱氢酶v辅助因子辅助因子：用于维持分子的构象，有些脱氧酶需用于维持分子的构象，有些脱氧酶需加入适量的加入适量的NAD+或或NADP+;金属酶加适量金属离金属酶加适量金属离子子.v保护剂保护剂：如：如甘油、牛血清等防酶分子分离甘油、牛血清等防酶分子分离.v酶浓度酶浓度：一般浓度大保持活力较好。可加牛血清一般浓度大保持活力较好。可加牛血清白蛋白、表面活性剂或多价醇等。白蛋白、表面活性剂或多价醇等。v真空真空：防止防止-SH氧化。氧化。第51页/共54页5.4 酶活性的测定v酶促反应速率酶促反应速率(单位时间底物消耗量或产物生成单位时间底物消耗量或产物生成量量)可作为酶活性大小或酶含量多少的衡

41、量标准。可作为酶活性大小或酶含量多少的衡量标准。v抽样法：也称中止法。酶与底物反应一定时间：也称中止法。酶与底物反应一定时间后使其变性后使其变性,终止酶反应。测定方法包括比色法，终止酶反应。测定方法包括比色法，化学法，放射性化学法等；化学法，放射性化学法等；v连续测定法：用仪器连续监测整个酶促反应过：用仪器连续监测整个酶促反应过程。有分光光度法程。有分光光度法,荧光分析法荧光分析法,自动分析仪法等；自动分析仪法等；v快速反应追踪法：可以达到：可以达到10-3s以下，有停留以下，有停留法；达到法；达到10-6s以下，温度跃迁法以下，温度跃迁法(温度瞬时变化温度瞬时变化)等。等。第52页/共54页

42、 蛋白质剪接v1990年年Kane等首次报道，啤酒酵母细胞的等首次报道，啤酒酵母细胞的基因基因TFP1表达产物有两种：表达产物有两种：69Kd的的H+-ATPase和和50Kd的小蛋白。并证明前者是一的小蛋白。并证明前者是一条完整肽链条完整肽链N端和端和C端两段拼接而成，后者恰端两段拼接而成，后者恰恰是中间被剪切下来的肽段。恰是中间被剪切下来的肽段。v1992年年Biolabs研究人员发现著名的研究人员发现著名的Vent DNA聚合酶也为蛋白质自我拼接产物。聚合酶也为蛋白质自我拼接产物。v1992年年Davis发现，结合分支杆菌中发现，结合分支杆菌中Rec A 蛋白的活性调节，也经过蛋白质的自我拼接。蛋白的活性调节，也经过蛋白质的自我拼接。第53页/共54页感谢您的观看！第54页/共54页