体外培养课件.ppt

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1、体外培养体外培养体外培养体外培养 实际上就是从活体内取出组织、单个细胞实际上就是从活体内取出组织、单个细胞 和细和细胞群以及器官模拟体内生理环境，在无菌、适当胞群以及器官模拟体内生理环境，在无菌、适当温度、湿度和一定营养条件下，使之生存和生长温度、湿度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法并维持其结构和功能的方法组织培养(tissueculture)体外培养细胞培养(cellculture)（InVitro）器官培养(organculture)体外培养目的与用途体外培养目的与用途体外培养在现代医学和生物科学研究中应用极为广泛，其优点主要是：体外培养在现代医学和生物科学研究中应

2、用极为广泛，其优点主要是：能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作。传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作。便于使用摄影、摄电影和闭路电视等方法进行记录，能直接观察细胞便于使用摄影、摄电影和闭路电视等方法进行记录，能直接观察细胞变化，可用于药物作用机理、基因功能、疾病发生机理、新药筛选，变化，可用于药物作用机理、基因功能、疾病发生机理、新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程药物、疫苗、基因工程药物、细胞工程药物、研究与开发、单克隆抗体制研究与开发、单克隆

3、抗体制备备 体外培的养细胞所携带的基因与体内细胞相同，可用于分子生物学和体外培的养细胞所携带的基因与体内细胞相同，可用于分子生物学和基因工程的研究基因工程的研究细胞培养细胞培养 原代细胞培养原代细胞培养 细胞培养细胞培养 传代细胞培养传代细胞培养 原代培养原代培养原代培养方法可分为组织块法和消化法：原代培养方法可分为组织块法和消化法：组织块法：取组织后，用组织块法：取组织后，用HanksHanks液清洗，去弃多余组织，直液清洗，去弃多余组织，直接剪成接剪成1mm1mm3 3小块，铺于培养瓶或培养皿中培养。小块，铺于培养瓶或培养皿中培养。消化法：取组织后，用消化法：取组织后，用HanksHank

4、s液清洗，去弃多余组织，用剪液清洗，去弃多余组织，用剪刀剪碎，加入消化液，刀剪碎，加入消化液，3737；水浴消化；水浴消化20-4020-40分钟后，加入分钟后，加入血清或培养基终止消化，离心去消化液，清洗，加入培养基血清或培养基终止消化，离心去消化液，清洗，加入培养基并调整细胞数，接种于培养瓶或培养皿中培养。并调整细胞数，接种于培养瓶或培养皿中培养。细胞培养细胞培养传代细胞培养：传代细胞培养：指原代培养成功后细胞再培养称之为细胞系。指原代培养成功后细胞再培养称之为细胞系。传代细胞培养又分为有限细胞系和无限细胞系。传代细胞培养又分为有限细胞系和无限细胞系。细胞培养细胞培养 有限细胞系：指细胞群

5、体在体外生长有一定的限有限细胞系：指细胞群体在体外生长有一定的限度，即体外传代到一定次数时，一般不超过度，即体外传代到一定次数时，一般不超过5050代，代，细胞停止繁殖而死亡。细胞停止繁殖而死亡。无限细胞系：指细胞群体在体外条件满足生长环无限细胞系：指细胞群体在体外条件满足生长环境时，则可无限生长存活下去。境时，则可无限生长存活下去。体外培养培养基体外培养培养基天然培养基天然培养基 天然培养基包括体液、组织提取液。其种类天然培养基包括体液、组织提取液。其种类有血清、水解乳蛋白和胶原等有血清、水解乳蛋白和胶原等血清血清血清在组织培养中是最常用的天然培养基，在任血清在组织培养中是最常用的天然培养基

6、，在任何细胞培养中都不可缺少。合成培养基只能维持何细胞培养中都不可缺少。合成培养基只能维持细胞短时间内生存，只有补充血清后细胞才能增细胞短时间内生存，只有补充血清后细胞才能增殖并进行一定的功能活动，所以大多数细胞培养殖并进行一定的功能活动，所以大多数细胞培养液中必须加入一定比例的血清。常用的血清有牛液中必须加入一定比例的血清。常用的血清有牛血清（牛血清又分为胎牛血清、新生牛血清和小血清（牛血清又分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清）、马血清、鸡血清和人血清等。牛血清）、马血清、鸡血清和人血清等。血清中其它与细胞体外生长有关的基本成分血清中其它与细胞体外生长有关的基本成分蛋白质蛋白质生长因子生长因

7、子胺类胺类肽肽脂肪脂肪纤维连接蛋纤维连接蛋白白-2-2-巨球巨球蛋白蛋白胎球蛋白胎球蛋白转铁蛋白转铁蛋白胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子和和（IGFIGF）生长调节素生长调节素A A和和C C刺激增生活性因子刺激增生活性因子血小板来源的生长因血小板来源的生长因子子(PDGF)(PDGF)表皮生长因子表皮生长因子（EGFEGF）成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子（FGFFGF）内皮细胞生长因子内皮细胞生长因子（ECGFECGF）氨基酸氨基酸多胺类（精胺、多胺类（精胺、亚精胺）亚精胺）谷光谷光甘甘肽肽亚油亚油酸酸磷脂磷脂细胞传代所需消化液细胞传代所需消化液经常使用的是胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二（经

8、常使用的是胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二（EDTAEDTA）两种溶液，它们是传代细胞时用以使细胞脱离附着两种溶液，它们是传代细胞时用以使细胞脱离附着底物表面和离散成单个细胞。它们可以单独使用，底物表面和离散成单个细胞。它们可以单独使用，也可按一定比例与胰蛋白酶混合一起使用，这主要也可按一定比例与胰蛋白酶混合一起使用，这主要根据细胞的要求，可自行试验以做取舍。另外，用根据细胞的要求，可自行试验以做取舍。另外，用于原代细胞培养时，常常会使用胶原酶和胰蛋酶混于原代细胞培养时，常常会使用胶原酶和胰蛋酶混合一起使用。合一起使用。胰蛋白酶溶液胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，是一种黄白色粉末，易胰蛋白酶主要采自牛或

9、猪的胰脏，是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处潮解，应放置冷暗干燥处 保存。保存。主要作用是使细胞间的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。蛋白质水解，使细胞相互离散。胰蛋白酶的活力是用解离胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的。经常使用的有酪蛋白的能力表示的。经常使用的有1 1：125 125 和和1 1：250 250 的的两种浓度。两种浓度。胰蛋白酶溶液在胰蛋白酶溶液在Ph7.5Ph7.5，温度为，温度为3737时，作用时，作用能力最强。钙、镁离子可降低胰蛋白酶作用，所以在配制能力最强。钙、镁离子可降低胰蛋白酶作用，所以在配制胰蛋白酶时常用无胰蛋白酶时常用无Ca2+Ca

10、2+、Mg2+Mg2+的溶液配制的溶液配制组织培养的污染组织培养的污染组织培养细胞被有害物污染是组织培养工作的大敌。组织培养细胞被有害物污染是组织培养工作的大敌。应用组织培养进行研究工作，除需要好的实验设计应用组织培养进行研究工作，除需要好的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。一项好的研究，或建成的满意细胞系，往往由于遭一项好的研究，或建成的满意细胞系，往往由于遭受污染而前功尽弃。因此，一个组织培养工作者，受污染而前功尽弃。因此，一个组织培养工作者，要始终注意防止污染。要始终注意防止污染。污染途径与预防空气：空气是扩散微生物的主要途径

11、。由于空气空气：空气是扩散微生物的主要途径。由于空气流动性大，在操作场地与外界隔离不严和消毒不流动性大，在操作场地与外界隔离不严和消毒不充分的情况下，外界不洁空气很容易侵入造成污充分的情况下，外界不洁空气很容易侵入造成污染。因此，培养设施不宜置于通风场所。现各实染。因此，培养设施不宜置于通风场所。现各实验室普遍应用净化工作台，可防止不洁空气污染。验室普遍应用净化工作台，可防止不洁空气污染。细胞培养室可采用空气熏蒸法经常消毒。细胞培养室可采用空气熏蒸法经常消毒。污染途径与预防清洗消毒：培养器皿和容器洗刷消毒不彻底、培清洗消毒：培养器皿和容器洗刷消毒不彻底、培养用液灭菌不彻底等，瓶口消毒不严格，都

12、可导养用液灭菌不彻底等，瓶口消毒不严格，都可导致污染。细胞培养用的器皿最好用干热灭菌。致污染。细胞培养用的器皿最好用干热灭菌。操作：实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不操作：实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操强，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管或营养液，可能导致细胞作不慎，使用同一吸管或营养液，可能导致细胞交叉污染。交叉污染。污染途径与预防 血清：血清也是污染细胞的来源，如购买大包装血清后，分装血清：血清也是污染细胞的来源，如购买大包装血清后，分装时因操作人员操作不当、器皿消毒不彻底，可使血清污染。时因操作人员操作不当、器皿

13、消毒不彻底，可使血清污染。培养液：有时培养液配制时间过长，几种细胞同时使用一瓶培培养液：有时培养液配制时间过长，几种细胞同时使用一瓶培养液培养或多人同时使用同一瓶培养液，都可引发交叉污染养液培养或多人同时使用同一瓶培养液，都可引发交叉污染 组织：原代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本组织：原代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织身可能是被污染的组织(如已经发生溃烂的肿瘤组织如已经发生溃烂的肿瘤组织)；手术用；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染。碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染。污染对细胞的影响细胞被污染时间短、污染程度轻、并能及时排细胞被污染时间短

14、、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。当污染除污染物的情况下，细胞有可能恢复。当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。壁脱落。污染对细胞的影响2.2.细菌污染：细菌污染：常见污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单孢常见污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单孢菌等。细菌污染后大多能改变培

15、养液菌等。细菌污染后大多能改变培养液pH pH，使培养液，使培养液变混浊，也有的对培养液无影响，只在镜下观察发变混浊，也有的对培养液无影响，只在镜下观察发现菌体时才能知道污染。现菌体时才能知道污染。细菌增殖迅速，能消耗营养液和产生毒素而抑制细细菌增殖迅速，能消耗营养液和产生毒素而抑制细胞生长，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。应胞生长，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。应用抗生素对预防细菌污染有效。用抗生素对预防细菌污染有效。污染对细胞的影响3.3.支原体污染：支原体污染：支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。支原体是

16、一种介于细菌和病毒之间的，能独立生一种污染。支原体是一种介于细菌和病毒之间的，能独立生存的微生物。它无细胞壁，形态呈高度多样性，最小的直径存的微生物。它无细胞壁，形态呈高度多样性，最小的直径o o2 2 微米，可通过滤菌器。微米，可通过滤菌器。细胞受支原体污染后，个别严重情况下，可使细胞增殖缓慢、细胞受支原体污染后，个别严重情况下，可使细胞增殖缓慢、部分细胞变圆、从瓶壁脱落。但多数细胞受污染后，无明显部分细胞变圆、从瓶壁脱落。但多数细胞受污染后，无明显变化，或有微细变化却由于传代和换液而被缓解。在观察不变化，或有微细变化却由于传代和换液而被缓解。在观察不够细心和缺乏经验时，外观上往往给人以够细

17、心和缺乏经验时，外观上往往给人以“正常正常”的感觉，的感觉，实则污染细胞会受到多方面潜在的影响。实则污染细胞会受到多方面潜在的影响。污染对细胞的影响4.4.化学物，如重金属或其它非培养必需化学试化学物，如重金属或其它非培养必需化学试剂混入培养液中后，有的毒性小，被排除剂混入培养液中后，有的毒性小，被排除后，细胞仍可生存；有的烃化物如多环芳后，细胞仍可生存；有的烃化物如多环芳烃有致突变性，能导致细胞发生转化。烃有致突变性，能导致细胞发生转化。防治微生物污染策略 细胞培养中用抗生素是杀灭微生物的主要手细胞培养中用抗生素是杀灭微生物的主要手段，一般常用抗菌素有青霉素段，一般常用抗菌素有青霉素G G、

18、链霉素、庆、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、两性霉素大霉素、卡那霉素、多粘菌素、两性霉素B B和和制霉菌素。迄今尚无对抗支原体特效抗生素。制霉菌素。迄今尚无对抗支原体特效抗生素。各种抗生素的使用情况各种抗生素的使用情况抗生素抗生素作用对象作用对象参考浓度参考浓度(g/ml)(g/ml)稳定性稳定性（天）（天）两性霉素两性霉素氨苄青霉素氨苄青霉素氯霉素氯霉素红霉素红霉素庆大霉素庆大霉素卡那霉素卡那霉素制霉菌素制霉菌素青霉素青霉素链霉素链霉素利福平利福平四环素四环素真菌真菌革兰阳性、阴性菌革兰阳性、阴性菌革兰阴性菌革兰阴性菌革兰阳性菌、支原体革兰阳性菌、支原体革兰阳性、阴性菌、革兰阳性、阴性

19、菌、支原体支原体革兰阳性、阴性菌革兰阳性、阴性菌细菌细菌革兰阳性菌革兰阳性菌革兰阴性菌革兰阴性菌革兰阴性菌革兰阴性菌革兰阳性、阴性菌、革兰阳性、阴性菌、支原体支原体1 11001005 510010050501001005050100IU/ml100IU/ml100100505010103 33 35 53 35 55 53 33 33 33 34 4MTT实验实验MTT全称为：3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄

20、颜色的染料。MTT实验实验其检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使其检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性外源性MTTMTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（FormazanFormazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSODMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在疫检测仪在490nm490nm波长处测定其光吸收值，可间接反波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTTMTT结晶形成结晶

21、形成的量与活细胞数成正比的量与活细胞数成正比。MTT实验实验MTTMTT应用应用应用应用 该方法已广泛用于细胞生存曲线的制备、一些生物活该方法已广泛用于细胞生存曲线的制备、一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。敏度高、经济。MTT实验实验MTT MTT 溶液的配制方法：溶液的配制方法：溶液的配制方法：溶液的配制方法：MTT MTT最好是现用现配。在配制和保存的过程中，容最好是现用现配。在配制和保存的过程中，容器最好用棕色器皿或

22、用铝箔纸和黑色纸包住。操作器最好用棕色器皿或用铝箔纸和黑色纸包住。操作的时候尽量避光。的时候尽量避光。MTT MTT使用浓度为使用浓度为5mg/ml5mg/ml。溶。溶于于l l的磷酸缓冲液（的磷酸缓冲液（PBSPBS）或无酚红的培养基中，用）或无酚红的培养基中，用0.22m0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 4 避光避光保存亦可分成小包装保存亦可分成小包装-20-20 长期保存。长期保存。MTT实验实验MTTMTT法实验细胞数法实验细胞数法实验细胞数法实验细胞数 一般一般一般一般采用对数期细胞，调整细胞浓度为采用对数期细胞，调整细胞浓度为2102104 4个细个细胞胞/ml/ml培养液。用培养液。用9696孔板检测时孔板检测时,每孔加每孔加200ul200ul细胞悬液。细胞悬液。待细胞贴壁并待细胞贴壁并80%80%左右融合时，根据所需对细胞进行左右融合时，根据所需对细胞进行处理。处理。谢谢！谢谢！