微生物实验预习报告范文.pdf

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1、 实验三 细菌革兰氏染色法及芽孢染色法 一、实验目的 1.初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤；2.掌握细菌芽孢染色的方法。二、实验内容 1.制作细菌染色装片。2.进行革兰氏染色法操作。三、实验材料和用具 大肠杆菌(E coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液，枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的斜面菌种。革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯和 5孔雀绿水溶液。显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯和烧杯。四、操作步骤(一)革兰氏染色 1涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一

2、环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约 1cm 的菌膜。涂菌后将接种环 火焰灭菌。2.干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。3固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法即将细菌涂片向上，通过火焰 3 次，以热而不烫为宜，防止茵体烧焦、变形。此制片可用于染色。4.初染 于制片上滴加结晶紫染液，染 1min 后，用水洗去剩余染料。5.媒染 滴加卢戈氏碘液，1min 后水洗。6.脱色 滴加 95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时 30s 至 1min 水洗。7.复染滴加石炭酸复红液复染 1min

3、，水洗。8用滤纸吸干,油镜镜检。(二)芽孢染色法 1 方法 1(1)取 37C培养 18-24h 的枯草芽抱杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”)。(2)于载片上滴人 3 5 滴 5孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时开始计算时间约 4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时 可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用 0.5%沙黄水溶液(或 o.05%碱性复红)复染 1min，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。2.方法 2(1)加 1-2 滴自来水于小试管中，用接种环从

4、斜面上挑取 23 环培养 1824h 的枯草芽抱杆菌菌苔于试管中，并充分期匀打散，制成 浓稠的菌液。(2)加 5%孔雀绿水溶液 23 滴于小试管中.用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热 1520min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火 3 次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为比。(6)加沙黄水溶液，染 23min 后，倾去染液，不用水洗。(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。(三)结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色,革兰氏阳性菌染成淡红色。(四)检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色呵芽孢染色，并

5、绘图、记录染色结果。五、注意事项 1.涂片务求均匀.切忌过厚。2.在染色过程中，不可使染液干涸。3.脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌。4.老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。5.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽泡仍保留在菌体上为宜。六、演示 1.无菌操作取菌、涂片及涂片的固定；2.制片方法及染色过程。七、实验报告(一)绘图 大肠杆菌革兰氏染色视野图；金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图；枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。(二)记录革兰氏染色法步骤，并进行结果分析。(三)未知菌的检测结果。七、问题和思考 1.涂片后为什么

6、要进行固定，固定时应注意什么?2.什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?3.试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。4.为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色?实验四 油镜的使用和细菌形态的观察 一、实验目的 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸的使用方法。二、实验内容：1 学习油浸系物镜的使用方法。2.用油镜观察枯草芽抱杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。2 三、实验材料和用具 枯草芽抱杆菌（Bacillus.subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的染色装片。香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。四、操作步骤（一

7、）观察前的准备 1将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为 4cm 坐正，练习用左眼观察。2调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约 1mm 左右。转动反光镜采集光源，光线较强的 天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察 未染色装片时，光线不宜太强。3.低倍镜观察染色装片 首先下降载物台，将枯草芽抱杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片 0.5cm 处，适当缩小光圈，然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物

8、像时，改用细调节器调节到物像清楚 为止。移动装片，把合适的观察部分移至视野中心 4.高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与破片相撞。再用目镜观察，仔细调节光圈，使光 线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观 察。5.油镜观察（1）.下降载物台约 2cm,将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜 头的正下方）滴香柏油。（2）.从侧面注视，小心慢慢上升镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。（3）.将光线调亮，左眼从目镜

9、观察，用粗调节器将载物台徐徐下降（切 忌反方向旋转），直至视野中有物像为止。（二）细菌形态的观察 1.观察细菌的基本形态 用低倍镜、高倍镜和油镜观察革兰氏染色的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，芽胞染色的苏去金杆菌，并分别在油镜下绘图。五、注意事项 1.注意擦镜头时，只能用擦镜纸。2 观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作不能在油镜下直接取下和替换装片，切记。3 无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多。六、演示 1.细菌细胞结构装片示范镜；2.无菌操作过程；3.怎样盖盖玻片才不产生气泡。七、实验报告（一）绘图 给岀你所观察到的几种细菌的个体

10、形态视野图。绘出你所观察到的细菌细胞结构视野图，并注明各部分。（二）试指岀在制备活菌装片时，应注意什么问题？八、问题和思考 1.用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好还是用非染色装片好？观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同？2.无菌操作过程中，可否将棉寒放在桌面上？为什么？3.试设一个准备该实验的工作方案。实验五放线菌、酵母菌和霉菌形态观察 一、实验目的 1.观察细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。2 放线菌、酵母菌和霉菌的细胞形态观察。二、实验原理 菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一

11、定培 养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在 科研和生产实践中常被采用。三、实验材料和用具 圆褐固氮菌，枯草芽抱杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉的单个菌落平板，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）;Bouin 氏 固定液，0.01%结晶紫溶液，酒精等。显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环。四、操作步骤（一）四大菌落的形态观察 观察圆褐固氮菌、枯草芽抱杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉的单个菌落特征，并按实验菌落特征描述的方法记录结果。（二）放线菌的形态观察 精品文档 用镊子小心取出用插片法培养的放

12、线菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将长有菌的一面向上放在洁净 的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出 3 类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。（三）霉菌的形态观察 1粘片观察：取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。2假根观察：将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低 倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构 造。（四）酵母菌的形

13、态观察 酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定 1 以无菌水洗下 PDA 斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。2.取 0.05%美蓝染色液 1 滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色 23min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵 母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞（蓝色）与活细胞（不着色）。3.在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数 56 个视野。酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：死亡率=死细胞总数/死活细胞总数X 100%五、注意事项 1 用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润；在产抱培养基上加大移种量，可提高子囊形成率；通过微加热增加酵母的死亡 率，易

14、于观察死亡细胞。2培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。3玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，六、实验报告 1.将观察到的微生物菌落特征填入下表中。2.计算酵母菌的死亡率 3.根霉和青霉形态图，示各部。七、问题和思考 1.试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态的差异？2.酵母菌的假菌丝是怎样形成的？与霉菌的真菌丝有何区别？3在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？实验六 微生物显微计数和大小测量 一、实验目的和内容 目的：学会测微尺的使用和计算方法及对球菌和杆菌的测量 内

15、容：1 认识测微尺，学习目镜测微尺的标定。2 测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌体的大小。3.计数板直接镜检计数。4载玻片直接镜检计数。5.平板菌落计数。二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）斜面培养物（约培养 10h）、培养 5 7d 的大肠杆菌（E.coli）菌液。牛肉膏蛋白胨培养基、美蓝染色液、；结晶紫染色液、香柏油、二甲苯。显微镜、血细胞计数板、目镜测微尺、酒精灯、镜台测微尺、擦镜纸、酒精灯、滤纸条、载玻片、盖玻片、无菌微量移液管、接种环、无菌试管、涂布器、无菌培养皿。三、操作步骤（一）计数板直接

16、镜检计数 1.血细胞计数板的构造 血细胞计数板由四条平行槽构成 3 个平台，中间的平台较窄，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台面各有一个含 9 个大格的方格网，中间大格为计数室。计数室的长和宽各为 I mm，中间平台下陷 0.01 mm，故盖上盖玻片后计数室的总容积为 0.1 mm3。血细胞计数板 的构造见图 16.常见血细胞计数板的计数室有两种规格。一种是 16x 25 型，称为麦氏血细胞计数板共有 16 个小格，每个小格分 为 25 个小格。另一种是 25x16 型，称为希里格式血细胞计数板，共有 25 个中格，每个中格又分成 16 个小格。但是不管哪种规格 的血细胞计板其计数室的小格均由

17、 400 个小方格组成。应用血细胞计数板在显微镜下直接计算微生物细胞的数量，方法是先测定若干 个方格中的微生物细胞，再换算成每 m1 菌液（或每 g 样品）中微生物细胞数量。2.细菌数量的测定 45（1）稀释加样：取枯草芽抱杆菌斜面少量菌体至 100mL 无菌水中，稀释混匀后待用（浓度约为 10-10/mL）。先将盖玻片放在计数 室上，用吸管吸取以上稀释液滴于盖玻片的边缘，让菌液自行渗人，多余菌液用滤纸吸去，稍待片刻，待细菌细胞全部沉降到计数室 底部，将计数板放于载物台的中央，按下列步骤寻找计数室并计数。（2）找计数室：先在低倍镜下寻找计数板大方格网的位置，转换高倍镜后调节光亮度至菌体和计数室

18、线条清晰为止，再将计数室一 角的小格移至视野中。顺着大方格线移动计数板，使计数室位于视野中间。（3）计数：计数时，如用 16x 25 则计数板则按对角线方位，取左上、右上、左下、右下 4 个大格（共 4 个大格，100 个小格）内的 细胞逐一进行计数；如使用规格为 25X16 型的计数板，则除取左上、右上、左下、右下 4 个大格外，还需加中央的一个大格（共 5 个 大格，80 个小格）内的细胞。计数时当遇到大格线上的细菌时，一般只计此大格的上方及右方线上的细胞（或只计下方及左方线上的细 胞），将计得的细胞数填人结果表中.对每个样品重复计数 3 次，取具平均值，按下列公式计算每 mL 菌液中所含

19、的细菌细胞数。（二）载玻片直接镜检计数 1 摇动菌液使其混合均匀，用无菌微量移液管取菌液 0.01mL 于载玻片上并用无菌接种环均匀地涂布 1cm2 的面积上。风干，固定，4 结晶紫染色 lmin，冲洗.干燥备用。2用物镜测微尺，测量显微镜油镜观察时的视野直径，并以 S=n r2 公式，计算岀视野面积。3将涂片置于载物台，滴香柏油，以油镜观察，不断变化视野共观察 N 个视野，计数每一视野中细菌个数。以下列公式计算每毫 升菌液中的含菌数量：原菌枕谓数丿个 5 止G I个罰爲面厂祂野屮的平均菌数HI0OX稀释倍數（三）平板菌落计数 另取灭菌移液管吸取上述枯草芽抱杆菌稀释液 1mL，放人已灭菌的培养

20、皿中，再倒人融化而冷却到 50 C 左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培 养基，同时制作 3 个平板皿中铺成一薄层，并使平皿作前后和左右滑动，使样品和培养基混匀待其凝固后倒置，37C培养 24 h 后 汁算菌落数，并计算其每 mL 的含菌量。（四）细菌大小测定 I 测微尺的构造 显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份（图 15 1B）。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须 用镜台测微尺进行标定。镜台测微尺为一专用中央有精确等分线的载玻片（图 15 1A），一般将长为 1m

21、m 的直线等分 100 个小格，每 格长 0.01mm,即 10u m，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。2目镜测微尺的标定 把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放入目镜的隔板上.使有刻度的一面朝下。将镜台测微尺放在显微镜 的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台 测微尺的刻度相平行并使两尺左边的一条线重合，向右另外一条两尺相重合的直线（图 15 1B）、3 计算方法：例如，目镜测微尺 20 个小格等于镜台测微尺 3 个小格，已知镜台测微尺每格为 10um，则 3 小格的长度为 3 X 10=30um,那么相应 地在目

22、镜测微尺上每小格长度为 3X10-20=1.5（um）。用以上计算方法分别校正低倍镜，高倍镜及油镜下目镜测微尺每格实际长度。4 菌体大小的测定 将镜台测微尺取下，分别换上大肠杆菌及金黄色葡萄球菌玻片标本，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后 在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量岀菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算岀菌体的长和宽。并详细记录于表中。例如.目镜测微尺在这架显微镜下，每格相当于 1.5 um 测量的结果，若菌体的平均长度相当于目镜测微尺的 2 格.则菌体长应为 2 X 1.5 um=3.0um。一般测量菌体的大小.应测定 10-20 个菌体.求出平均值.

23、才能代表该菌的大小。四、注意事项 1 镜台测微尺的玻片很薄，在标定油镜头时，要格外注意，以免压碎镜台测微尺或损坏镜头。2 标定目镜测微尺时要注意淮确对正目镜测微尺与镜台测微尺的重合线。3直接镜检计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板。绝不能用硬物洗刷。洗后待自行晾干或用滤纸沾干。最后用擦镜纸擦干净。若计数是 病原微生物，则需先浸泡在 5%的石炭酸溶液中进行消毒，然后再进行清洗。五、演示 1.目镜测微尺、镜台测微尺的显微镜下示教 2.标定及测量方法示范 4 平板菌落计数操作过程。六、实验报告 1.目镜测微尺标定结果：低倍镜下 倍目镜测微尺每格长度是 高倍镜下 倍目镜测微尺每格长度为 油镜下 倍目镜测微尺每

24、格长度是 2 菌体大小测定结果：试与已知的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的大小作一比较是否一致，为何？3.计数板直接镜检计数结果：丿:格屮址电也敦 左上 1 W-St 1 r!4.涂片直接镜检计数结果:1 2 3 J J 1,7 8 9 IQ 平均良畀 .5.平板菌落计数结果 总菌数 mL 1或匸每口平均蔺落数 X 稀释倍数 精品文档 七、冋题和思考 1.根据你的体会，血细胞计数板计算的误差主要来自哪些方面？应如何减少误差？2.比较各种计数法的优点和缺点。3 设计一个方案如何计数市售酸奶或三株口服液或菌肥制品的单位含菌数。4.为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时必须重新用镜台测微尺对目镜测微尺进行标

25、定？5.若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么目镜测微尺每格所测量的镜台上的菌体细胞的实际长度 什么？实验七 E.coli生长曲线的测定 一、实验目的 1 了解细菌生长曲线特点及测定原理；2 学习用比浊法测定细菌的生长曲线。二、基本原理 三、器材 1 菌种：大肠杆菌 2 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 3 仪器和器具：四、方法与步骤 1 标记编号 取 11 支无菌试管，分别用记号笔标明培养时间，分别编号为 0、1.5、3、4、6、8 10、12、14、16、20 h。2 接种 用 5.0 mL 无菌吸管分别准确吸取 2.5 mL 种子液加入盛有 50 mL 牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶中，混

26、合均匀后分别取 5.0 mL 混合液放 入上述标记的 11 支无菌试管中。3 培养 于 37C下振荡培养 250 r/min，分别培养 0、1.5、3、4、6、8 10、12、14、16、20h，将标记有相应时间的试管取出，立即放冰箱中 贮存，待培养结束时一同测定 OD 值。4 生长量测定 将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用 600nm 波长进行比浊测定。并对不同时间培养液从 0h 起依次进行测定，对浓度大 的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其 OD 直在 0.10.0.65 以内，经稀释后测得的 OD 直要乘以稀释倍 数，才是培养液实际的 OD 直。五、实

27、验结果 1 将测定的 OD 直填入下表：2 以上述表格中的时间为横坐标，0D600 值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。3 思考：（1）用本实验方法测定微生物生长曲线，有何优点？细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为 103/ml，培养 4.5h 后，其密度高达 2x 108/ml，计计算 岀其代时。实验八细菌的生理生化反应 一、实验目的 1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同的微生物有着不同的酶系统；2.掌握进行微生物大分子物质水解实验的原理和方法 3.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法；4.了解 IMViC 反应的原理及其在肠道细菌鉴定

28、中的意义和方法。二、实验原理（请补充）三、实验器材（请补充）四、实验步骤 淀粉水解试验：1.用记号笔在淀粉培养基平板底部划分 4 部分。2.将 Bacillus subtilis,Escherichia coli,Enterobacter aerogenes，staphylococcus aureus 分别在不同的部分划线接种，在 平板的反面分别写上菌名。3.将平板倒置 37C生化培养箱中培养（A-509），24 h 后观察各种细菌生长情况：打开盖子，滴入少量卢戈氏碘液，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺面整个平板。糖发酵试验：1.用记号笔在试管外壁上分别表明表明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。2

29、.取 3 支含糖发酵培养基的试管，其中 2 支分别接种Escherichia coli，Enterobacter aerogenes，另外 1 支保留不接种的培养基 为对照。3.37 C恒温培养 24-48 h 后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性，不变或变蓝为阴性；倒立德汉氏小管中如有气泡，表示代 谢产气。4.实验结果记录：产酸产气用表示，只产酸的用“+”表示，不产酸不产气的用“-”表示。吲哚试验（或宽度）是否相同?为 时间 0 1+5 3 4 6 8 L0 12 14 15 20 光密度值（OD6O0）6 1.将Escherichia coli，Enterobacter aerogene

30、s，分别接种于 2 支蛋白胨水培养基中，37C恒温培养 24 h。2.在培养基中加入乙醚 1.0 mL,充分振荡使吲哚溶于乙醚中，静置 2 min，待乙醚层浮于培养液上面后，再沿试管壁慢慢加入吲哚 试剂 10 滴。乙醚层呈玫瑰红色的为阳性。注意：加入试剂后，不许摇动，否则无红色或红色不明显。甲基红（M.R.）试验和伏-普（V.P.）试验 1.将Escherichia coli,Enterobacter aerogenes，分别接种于 2 支葡萄糖蛋白胨水培养基中，37C恒温培养 24 h。2.M.R.试验：各取出 1 支培养好的试管，取沿管壁加入 M.R.试剂 3-4 滴，观察，培养基由原来的

31、橘黄色变为红色的为阳性反 应。3.V.P.试验：各取 1 支培养好的试管，加入 10 滴 40%的 KOH 然后加入等量的 5%勺a-萘酚溶液，用力振荡，37 C恒温 15-30 min，培养物呈红色的为阳性反应。五、实验结果（表格见黑板）六、结果分析（对实验进行总结与分析）实 验九 环境因素对微生物生长的影响 一、实验目的 1、学会自己设计实验测试一些环境因素对微生物生长的影响的方法与步骤。2、掌握物理因素、化学因素、生物因素对微生物生长的影响的原理。3、掌握培养基的配置及灭菌方法。4、了解并会使用微生物实验室的基本仪器及常用灭菌方法。二、实验原理 微生物的生命活动是由其细胞内外一系列物化环

32、境系统统一体所构成的，除营养条件外，影响微生物生长的环境因素，包括物理因素、化学因素和生物因素对微生物的生长繁殖、生理生化过程均能产生很大影响，总之一切不良的环境条件均能使微生物的生长受抑制，甚至导致菌体死亡。1、物理因素 pH PH 通过影响细胞质膜的通透性，膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。2、化学因素一一消毒剂（碘酒）通过诱导细胞裂解的方式杀死细胞。2、生物因素-抗生素（青霉素）能抑制微生物生长或杀死微生物的化合物，它们主要通过抑制细菌细胞壁合成，破坏细胞质膜，作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化，抑制蛋白质和核酸合成等方式来抑制微生物的生长或杀

33、死微生物。三、实验材料 菌种：3 号金黄色葡萄球菌、5 号大肠杆菌 仪器：高压灭菌锅、电子天平、电热炉、恒温培养箱、紫外分光光度计、移液枪、打孔器 器皿：玻璃棒、大烧杯、锥形瓶、试管和培养皿（使用时灭菌）、接种环、涂布棒枪头 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂粉，水，PH7.27.4）牛肉膏蛋白胨培养液（同上，不加琼脂粉）无菌水 1mol/L HCL 1mol/L NaOH 四、实验步骤 1.pH 对微生物的影响（1）配置不同 PH 值得培养基，0.3 克牛肉膏、1 克蛋白胨、0.5 克氯化钠、100 毫升的水。从最低 PH 值开始调：3.5、5.5、7.5、9.5、11

34、.5 五个 PH 浓度各 5 毫升分装十支试管，即每个梯度做两管。进行标记后灭菌。（2）制备菌液，取 37 摄氏度培养了 15 小时的大肠杆菌斜面一支，挑取两环菌群至 4 毫升的无菌水中，混匀后待用。3）滴加菌液，用移液抢向第一步中准备好的十支试管中分别加 200 微升的菌悬液，混匀后在 37 摄氏度下培养 24 小时。4）OD 值得测定，将培养好的菌液混匀后用 721 光电比浊法测各试管的 0D 值并做记录。2.碘酒试验 1）.配置固体培养基，取 0.6 克牛肉膏、2 克蛋白胨、1 克氯化钠、3 克琼脂、200 毫升水。加热溶化琼脂后，将 PH 调至 7.5，装入 锥形瓶中封口灭菌备用。2）

35、倒平板，将第一步制好的培养基溶化后冷却到 50 至 60 摄氏度后倒平板，每个培养皿 15 毫升，共倒 10 个平板，其中四个做碘酒 试验，对这四个平皿做碘酒和接种菌的标记。另六个培养皿是为下一个实验抗生素实验准备的。3）菌悬液制备，取 37 摄氏度培养了 15 小时的活化菌种，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别挑取 3 环分别加入两个 4 毫升的无菌水 中混匀备用。4）碘液梯度稀释，取 2.5%的碘酒 1 毫升加入 4 毫升自来水混匀，依次稀释制备成 0.5%、0.1%、0.02%、0.004%的碘酒梯度。5）涂布平板并加滤纸片，用移液抢吸取 200 微升菌悬液至培养皿中均匀涂布（两种菌每个涂两

36、个平板），将滤纸片分别在不同浓度 的碘酒液中浸湿后轻轻放在对应标记浓度和菌样的培养皿中，一个培养皿做两个梯度，每个梯度放 3 个滤纸片。6）将培养皿在 37 摄氏度下恒温培养 24 小时后测量每个滤纸片的抑菌斑大小并做记录。3.青霉素对微生物生长的影响 1）制备菌悬液，取 37 摄氏度下培养了 15 小时的活化菌种（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面各一支）分别挑取 3 环分别加到 4 毫 升无菌水中，制成两种菌的菌悬液。2）梯度稀释青霉素，将 40 万单位的青霉素依次稀释为 5 万、1.25 万、0.312 万、0.078 万、0.015 万单位。3）涂布，用移液抢吸取 200 微升菌悬液至培养

37、皿中（碘酒试验已经备好），两种菌各涂 3 个平板。用标记笔将六个平板从中间划线，以备加六种浓度的滤纸。（4）加滤纸片，将滤纸片在分别不同浓度的青霉素液浸湿轻放于对应浓度的平皿中，每个浓度放 3 个滤纸片，一个平板做两个浓度，然后在 37 摄氏度下恒温培养 24 小时。（5）测量，将各浓度下的滤纸片的抑菌斑直径测量岀来，并做记录。、实验结果及分析 1.PH 值对微生物生长的影响 PH 值 试管 1 试管 2 平均值 精品文档 2.碘酒对微生物生长的影响 菌种 浓度（%直径（cm）平均值 大肠杆菌 金黄色葡萄球 菌 注：滤纸片直径 0.5cm 3.青霉素对微生物生长的影响 菌种 浓度（%直径（cm）平均值 大肠杆菌 金黄色葡萄球 菌