流式细胞术分析及应用.ppt

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1、1流式细胞术分析及应用流式细胞术分析及应用2uu流式细胞术的原理流式细胞术的原理uu流式细胞术的应用流式细胞术的应用uu流式细胞术的数据处理流式细胞术的数据处理uu流式细胞术的样品制备流式细胞术的样品制备主 要 内 容流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。3一、流式细胞术的原理现代流式细胞仪包括o液流系统 聚焦细胞以供检测o光

2、学系统 激发和收集光信号 o电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析 4液流系统o液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处5Sample Flow in Optical Cuvette6SampleLaminarFlowLow Sample Flow Rate12 mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate60 mL/min样品和鞘液流78Injector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused la

3、serFocused laserbeambeamSheath fluid流式细胞仪的光学系统=激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。=激光波长:台式机为固定波长488nm,635nm，大型机波长谱线宽包括 325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647 nm=光收集系统是由若干组透镜，滤波片，小孔组成，将产生的光信号引导至检测器。9流式细胞仪的光信号o散射光信号o荧光信号10111.散射光信号前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信号 细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（SS

4、C,Side Scatter）入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光 FSC12FALS SensorLaser侧向角散射光SSC13FALS Sensor90LS SensorLaser散射光o散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 -通常使用“散点图”来看散射光信号 -散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据14散点图Dot Plot15lysed whole blood2.2.荧荧光光信号信号=荧光素吸收激光能量=荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子=荧光素与特异抗体结合=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信

5、号越强16Fluorochrome specification1718Compensation二、流式细胞术的应用o细胞表型分析o胞内蛋白的检测o细胞周期分析o细胞因子测定o分选o细胞内钙离子测量o191.细胞表型分析20212.胞内蛋白的检测223.细胞周期的检测23CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）244.细胞凋亡的检测25Annexin V AssayAnnexin V Assay2829Annexin V/PI双染双染活活细细胞胞为为（Annexin V-/PI-）坏死坏死细细胞胞为为（Annexin V+/PI+）凋亡凋亡细细胞（胞（Annexin V+/PI-）Annexi

6、n V Assay-能够区分死亡与凋亡30315、细胞因子测定+Antigen(cytokines)Fluorescence Detector antibodyCapture beads Capture antibodyBeads32Beads Provide a Flexible PlatformMultiple sizesBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometerDifferent intensitiesDifferent colors with different intensities

7、33Multiplexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads,emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label,emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.34Example 6-bead assayIL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12Capture BeadsLysate or SupernatantSampleDetector AntibodiesW

8、ashAnalyze on flow cytometer35CBA Standard curves6、细胞分选36488 nm laser+-Charged PlatesCharged PlatesSingle cells sortedSingle cells sortedinto test tubesinto test tubesFALS SensorFluorescence detector37 细胞分选38三、流式细胞数的数据处理39404142434445compensation分析软件47o常用软件 FlowJo 48Gating49505152四、流式细胞术的样品制备p单细胞悬液，

9、避免任何细胞沉积p被检细胞或颗粒大小0.240ump样品中至少20000个细胞，浓度105-106个/毫升53抗体的选择o首选直接标记抗体o荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原o间接标记：效果有时不太好54实验对照的设计空白对照：阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（单标）同型对照(Isotype)：使用与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。阳性对照：检测阴性时55表面分子检测样品制备o将细胞样本制成单细胞悬液，注意悬液内不能有粘

10、集，团块，尽量避免多的细胞碎片。o调整细胞浓度为5104-1105个，用PBS洗两次，用100ulPBS重悬细胞。o加入适量Fc受体阻断剂（与抗体匹配的动物的血清或IgG），4避光放置30分钟。o加入适量的特异性表面标记荧光抗体或独特型对照抗体，4避光放置30分钟。o用PBS洗两遍，用200ul固定液重悬细胞，上机检测。56胞内分子检测的样品制备o收集细胞，调至1106细胞/毫升。o4%固定液重悬细胞，常温或4避光放置30分钟。oPBS洗去固定液。o穿膜液重悬细胞沉淀，4避光孵育30分钟。oPBS洗两遍，加200ul穿膜液重悬细胞，常温避光放置10分钟。oPBS洗一遍，100ul穿膜液重悬细胞，加入适量内标抗体或独特型对照抗体，4避光孵育30分钟。oPBS洗两遍，用200ulPBS重悬细胞，上机检测。57谢 谢！58