水稻耐冷基因工程育种中的最新研究进展,基因工程论文.docx

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1、水稻耐冷基因工程育种中的最新研究进展,基因工程论文水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为全 球一半以上人口提供粮食来源1.水稻是亚热带起源作物，比小麦和大麦更容易遭到低温的影响。近年来，由于全球气候变化异常，极端气候发生频繁，低温冷害已成为水稻生产中的主要限制因素之一。因而，培育耐冷水稻品种具有特别重要的现实意义。 植物耐冷性大多是受多基因控制的复杂性状，而且还会与其他环境胁迫因子发生穿插作用，耐冷机理复杂，进而导致传统育种方式方法在改进植物耐冷性方面遭到限制。利用当代分子生物技术开掘利用优异的基因资源来改进植物的耐冷性，是提高植物耐冷丰产能力最为有效的途径。当前，低温信号转导途径主要分为依靠

2、CBF CRT/DRE binding factor 的信号转导途径和不依靠 CBF 的信号转导途径。在依靠 CBF 的信号转导途径中，细胞首先通过改变膜的流动性和蛋白构象接受冷信号，并且激活 Ca2 +通道，Ca2 +遭到低温诱导浓度瞬时增加，使信号转导途径中的CBF 上调表示出，进而调控其下游低温胁迫相关功能基因表示出上调2 -3.在不依靠 CBF 的信号转导途径中，下游低温胁迫相关功能基因的表示出遭到 CBF 之外的转录因子 MYB,SNAC 等 或其他因素 例如 ABA 的诱导，对该途径的研究没有依靠 CBF 的信号转导途径系统、全面、深切进入。根据低温信号转导途径，本文从蛋白激酶 C

3、DPK,MAPK 等 基因、转录因子 ICE1 / ICE-like,CBF /DREB,MYB 等 基因、功能基因 合成浸透调节物质基因、脂肪酸去饱和代谢关键酶基因等 三方面具体阐述耐冷基因在水稻耐冷基因工程育种中的最新研究进展，以期为耐冷基因的利用及农作物耐冷遗传改进和育种提供参考。 1 感应和转导胁迫信号的蛋白激酶和其他蛋白酶类基因 蛋白激酶位于胁迫信号转导的上游，在感受外界刺激、介入信号传递、增加蛋白质合成及调控转录等方面起重要作用4,其主要包括钙依靠蛋白激酶 calcium-dependent protein kinase,CD-PK 、丝裂原活化蛋白激酶 mitogen-activ

4、ated pro-tein kinase,MAPK 等。 水稻 OsCDPK7 基因受冷、高盐诱导表示出，在水稻中组成型超表示出 OsCDPK7 基因，与非转基因植株相比，正常条件下转基因植株苗期的生长发育状况没有发生明显改变，但苗期的耐冷、耐盐和抗旱能力加强，并且转基因植株对胁迫的耐受能力与 OsCDPK7 基因的表示出水平呈正相关5.水稻 OsCDPK13 基因受冷和 GA3诱导表示出，但干旱和盐胁迫能够抑制该基因的表示出，在水稻中组成型超表示出该基因，与空载体转化植株相比，正常条件下转基因植株的株高没有明显变化，低温胁迫处理后转基因植株的存活率显著提高； OsCDPK13 基因的 RNA

5、i 试验结果表示清楚，转基因水稻的株高变矮，耐冷性降低6.水稻 Os-MAPK5 基因受多种生物 病原侵染 和非生物胁迫 ABA、干旱、高盐、低温 诱导表示出，在水稻中组成型超表示出该基因，与空载体转化植株相比，正常条件下转基因植株的表型没有明显变化，但转基因植株苗期的抗旱、耐盐、耐冷性加强； Os-MAPK5 基因的 RNAi 试验结果表示清楚，正常条件下转基因水稻在营养生长后期出现不规则条纹，但仍能结实，转基因植株苗期的抗旱、耐盐、耐冷性降低，两个试验结果均表示清楚 OsMAPK5 基因正调控水稻的抗旱、耐盐、耐冷性7.另外，水稻 CIPK calcineurin B-like prote

6、in-interacting protein kinase家族基因功能多样，介入多种非生物胁迫响应，华而不实 OsCIPK03 受低温强烈诱导，受 ABA 稍微诱导，不受干旱、高盐诱导，在水稻中组成型超表示出该基因，与野生型植株相比，正常条件下转基因植株的生长发育没有发生明显变化，但低温胁迫处理后转基因植株苗期的存活率显著提高，一定程度上是由于低温胁迫条件下转基因植株体内脯氨酸和可溶性糖含量显著升高，脯氨酸合成酶基因及脯氨酸转运蛋白基因的表示出量提高8. 2 转录因子 植物低温胁迫经过中存在多层次的转录调控，最上游直接受低温诱导的转录因子是 ICE inducer of CBF express

7、ion ,它在常温下以非活性形式存在，受低温激活后其可诱导 CBF/DREB1 C-repeat binding factor/dehydration-responsive el-ement binding protein 1 基因的转录，进而提高植物耐寒性9.ICE1 基因编码一个 MYB 类型的碱性螺旋-环-螺旋 bHLH 转录因子，低温胁迫下，ICE1 结合在 CBF3 启动子区的 MYC 顺式作用元件上，激活 CBF3 基因的表示出9 .将拟南芥 ICE1 基因在水稻中组成型超表示出，在低温处理下转基因植株苗期的死亡率 10% 50% 较非转基因植株 80% 显著下降，脯氨酸含量显著升

8、高 2. 12 2. 23 倍 ,表示清楚超表示出拟南芥 ICE1基因提高了水稻的耐冷能力10. CBF / DREB1 亚家族转录因子属于 AP2 / ERF家族，在低温诱导中起关键作用11 -12,可与CRT / DRE C-repeat / dehydration responsive ele-ment 结合，不需要低温刺激便能激活一系列启动子区域含 CRT/DRE 元件耐冷基因的表示出，如COR cold regulated ,HOS high expression of os-motic responsive ,KIN cold inducible ,LTI low-temperat

9、ure induced ,RD responsive to dehydra-tion 等基因的表示出13 -16,进而提高植物的耐冷性。研究 发 现，CBF3,CBF1,CBF2 分 别 对 应DREB1A,DREB1B,DREB1C,均受低温诱导12. 在拟南芥中，CBF4 基因与 CBF1,CBF2,CBF3 不同，其能被 ABA 和干旱胁迫诱导表示出但不受低温胁迫的诱导，讲明 CBF4 及其目的基因的表示出是依靠 ABA 信号转导途径的17; 但在大麦中，CBF4 基因也受低温诱导，在水稻中超表示出该基因能够提高植株的耐冷、耐盐、抗旱性，且不影响植株的正常发育，但 CBF4 调控的基因大

10、部分与CBF3 / DREB1A 不同18.在水稻中分离的 CBF同源 基 因 OsDREB1A,OsDREB1B,OsDREB1C,OsDREB1D,OsDREB2A 中 OsDREB1A,OsDREB1B受低温诱导，OsDREB2A 受干旱和高盐诱导19.在水 稻 中 超 表 达 拟 南 芥 CBF1 或 水 稻 自 身DREB1 / CBF 基因，固然影响了转基因植株苗期的生长发育 矮小 ,但提高了植株可溶性糖与脯氨酸含量，加强了植株的耐盐、抗寒能力20 -21. 同样地，将水稻 OsDREB1A 基因转入拟南芥中，转基因拟南芥对干旱、高盐和低温的耐受能力加强，讲明 CBF 途径在单子叶

11、与双子叶植物中有着保守的形式19.在旱稻中克隆了一个 OsDREB1F基因，其受高盐、干旱、低温和 ABA 诱导，其不但能激活启动子中含有 CRT/DRE 核心序列的 COR基因的表示出，还能激活 rd29B、RAB18 基因的表示出，讲明 OsDREB1F 基因也介入了 CBF 和 ABA信号转导经过； 在水稻和拟南芥中超表示出 Os-DREB1F 基因，正常条件下转基因水稻和拟南芥幼苗与野生型植株无明显表型差异，但转基因植株的耐冷、耐盐、抗旱能力均加强22. 除 ICE,CBF/DREB1 外，还有一些转录因子介入冷胁迫信号转导，调控耐冷基因的表示出，如MYB、锌指蛋白、SNAC、WRKY

12、 等。 在植物中，MYB 是一个大的转录因子家族，其家族基因介入各种非生物胁迫。研究发现，水稻 OsMYB4 基因只受低温胁迫诱导，瞬时表示出试验证明 MYB4 转录激活 PAL2,ScD9,SAD,COR15a 冷诱导启动子，超表示出 OsMYB4 基因可提高转基因拟南芥、番茄、苹果的耐冷冻性，在转基因植株中，MYB4 影响不同低温诱导途径中低温胁迫响应基因的表示出，讲明它在耐冷中起着控制开关的作用23 -25.Os-MYB2 基因受冷、高盐、脱水诱导表示出，在水稻中组成型超表示出该基因，正常条件下转基因植株的表型同野生型植株没有明显差异，但转基因植株苗期的耐冷、耐盐、抗脱水性加强，在胁迫条

13、件下，转基因植株体内脯氨酸和可溶性糖含量及一些胁迫相关基因的表示出量提高，H2O2和 MDA 含量降低26.水稻 MYBS3 介入各种非生物胁迫，在水稻中其主要调控冷胁迫，超表示出 OsMYBS3 基因，在温室条件下与野生型植株相比转基因植株生长矮小、穗数减少、开花推延，但在大田条件下两者的表型和结实率无明显差异，且转基因植株苗期的耐冷性加强； OsMYBS3 介入一条不同于CBF / DREB1 的信号转导途径，其抑制了依靠于CBF / DREB1 的信号转导途径，MYBS3 响应低温胁迫较慢，而 CBF/DREB1 响应低温胁迫较快，这两条不同的冷胁迫信号转导途径在水稻中呈先后顺序且互补地

14、调节冷胁迫信号27.超表示出OsMYB3R-2 基因，能够提高低温处理下水稻的脯氨酸含量，加强水稻的耐冷能力，功能分析表示清楚OsMYB3R-2 是通过改变细胞周期和下游抗逆基因的异位表示出来调节低温胁迫的28.锌指蛋白是一类具有手指状构造域的转录因子，在基因表示出调控、细胞分化、加强植物抗逆性等方面具有重要作用。将水稻冷诱导锌指蛋白 OsCOIN coldinducible 基因在水稻中组成型超表示出，提高了转基因植株中 P5CS 1-pyrroline-5-carboxylate syn-thetase 基因表示出水平和脯氨酸含量，加强了转基因植株苗期的耐冷、抗旱、耐盐性29.籼稻中的具有

15、 A20/AN1 锌指构造域的胁迫相关蛋白 stress associated protein,SAP 基因 OsiSAP8 受冷、热、高盐、重金属等各种胁迫诱导，将其在水稻中组成型超表示出，转基因植株在萌发阶段和苗期均 表 现 出 较 强 的 耐 冷、耐 盐、抗 旱 性30. WRKY 是植物特异锌指转录因子，在植物防御反响方面具有重要作用。在水稻中超表示出 Os-WRKY76 基因，提高了植株细胞膜稳定性和过氧化物酶 POD 等非生物胁迫相关基因的表示出水平，加强了转基因植株的耐冷性31.NAC NAM,ATAF 和 CUC 家族转录因子也与多种胁迫有关，是植物特异转录因子家族，在水稻中发

16、现了 140 个 NAC 基因32,但仅一少部分被深切进入研究，这些基因大多介入调控植物生长发育及胁迫响应，华而不实 SNAC2 stress-responsive NAC 2 基因与冷胁迫相关。组成型超表示出旱稻 SNAC2 基因，可提高转基因水稻的细胞膜稳定性和耐冷、耐盐、抗脱水能力，且显著提高转基因水稻对ABA 的敏感性，并且在转基因植株中，被 SNAC2激活的胁迫响应基因与其他 NAC 基因完全不同33. 除了上述正调控植物耐冷性的转录因子外，还有一些负调控植物耐冷性的转录因子，如 Os-WRKY45-1,OsWRKY45-2,TCP TB1 / CYC / PCF ,通过基因敲除或者

17、基因沉默技术能够剔除该类转录因子基因或者降低其表示出量，进而提高植物的耐冷性。OsWRKY45-1,OsWRKY45-2 是等位基因，分别来自粳稻、籼稻，两者均负调控植物的耐冷性和抗旱性，在水稻中分别组成型超表示出两基因均降低了植株的耐冷性、抗旱性，而敲除 Os-WRKY45-1 基因的水稻植株和 OsWRKY45-2-RNAi水稻植株的耐冷性和抗旱性均加强34.TCP 转录因子是含有 bHLH basic helix loop helix 的植物特异转录因子家族，介入多种生理生化经过，具有重要的调控作用。研究发现，一些 TCP 转录因子负调控植物的耐冷性，如 OsPCF6,OsTCP21,通

18、过 RNAi 技术沉默水稻 OsPCF6,OsTCP21 基因，提高了转基因水稻幼苗体内脯氨酸含量，降低了 H2O2含量，加强了水稻幼苗的耐冷性，且转基因水稻幼苗在正常条件下与野生型植株及超表示出该基因的转基因水稻在表型上无明显差异35.OsPCF6,OsTCP21 是 MicroRNA319 的靶基因，在水稻中超表示出 MicroRNA319 基因同样提高了转基因植株的耐冷性35. 3 功能基因 植物遭遇低温胁迫时会通过诱导合成浸透调节物质来维持浸透压平衡，进而避免低温伤害，这类浸透调节物质主要包括脯氨酸、甜菜碱、海藻糖、果聚糖等。水稻中合成脯氨酸的关键酶基因 OsP5CS2 经 T-DNA

19、 插入丧失功能后，与野生型植株相比，突变体对盐、冷敏感，经高盐、低温处理后生长延迟缓慢，表示清楚 OsP5CS2 对提高植物耐冷、耐盐性特别重要36.甘氨酸甜菜碱合成所牵涉的酶包括胆碱单加氧酶 choline monooxygen-ase,CMO 、甜菜碱脱氢酶 betaine aldehyde dehy-drogenase,BADH 、胆碱氧化酶 choline oxidase,COD 、甘氨酸肌氨酸甲基转移酶 glycine sarco-sine methyltransferase,GSMT 、肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶 sarcosine dimethyglycine methyl-t

20、ransferase,SDMT .在水稻中超表示出 CodA 基因可提高水稻的耐冷和耐盐性37.同时将盐生隐杆藻的 ApGSMT 和 ApDMT 基因在水稻中组成型超表示出，提高了水稻体内甘氨酸甜菜碱含量，加强了植株苗期的耐冷、耐盐性38.海藻糖-6-磷酸合成酶 TPS 和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶 TPP是大肠秆菌中海藻糖合成的关键酶，将两个关键酶基因融合获得 TPSP 基因，在水稻中组成型超表示出该融合基因可提高植株体内海藻糖含量，加强植株苗期的耐冷、抗旱、耐盐性，但并没有延缓植株的生长39 -40.将水稻中的 OsTPS1 基因在水稻中组成型超表示出，提高了转基因植株体内的海藻糖、脯氨酸含

21、量及一些胁迫相关基因的表示出量，加强了植株苗期的耐冷、耐盐、抗旱性，但并没有显著改变植株的表型41.另外，将小麦果聚糖合成酶基因 WFT2 在水稻中组成型超表示出，同样也提高了植株体内的果聚糖含量，加强了植株苗期的耐冷性，且果聚糖含量与耐冷性程度呈正相关42.生物膜是低温冷害作用的首要部位，而且低温伤害的原初反响发生在生物膜系统类脂分子的相变上43.很多研究指出，植物的相变温度越低，其抗寒性越强，降低植物的膜相变温度，植物的抗寒性也得到提高； 而膜脂中的类脂和脂肪酸成分的不饱和度明显影响着膜脂的相变温度，不饱和度越高，植物的抗寒性越强44 -46.脂酰甘油 PG 具有较多的饱和脂肪酸，是决定膜

22、脂相变的主要因素，而甘油-3-磷酸酰基转移酶 glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT 又是PG 生物合成经过中的第一个酰基酯化酶，对决定植物膜 PG 的不饱和度起关键作用47.在水稻中超表示出拟南芥 GPAT 基因，可提高苗期转基因植株叶片中不饱和脂肪酸含量及光合速率，加强植株的抗寒性48.将拟南芥和菠菜的 AGPAT和 SGPAT 基因分别转入水稻后发现，在低温条件下苗期转基因植株叶片中的磷脂酰甘油的顺式不饱和脂肪酸含量增加，光合速率明显提高，生长速度加快，耐冷性加强49. 除上述功能基因外，还有一些基因在提高水稻耐冷性方面具有重要作用，如活性氧去

23、除酶类基因等。将水稻谷胱甘肽-S-转移酶 OsGSTL2 基因在拟南芥中组成型超表示出，提高了转基因拟南芥的 GST 活性 为野生型植株的 3 7 倍 ,加强了转基因拟南芥对重金属、冷、盐、浸透胁迫的耐性，且正常条件下，在莲座期前转基因拟南芥与野生型植株在表型上没有差异，讲明超表示出 OsG-STL2 可提高植株的耐冷性，有望在水稻耐冷基因工程中应用50.另外，水稻液泡 H+转移无机焦磷酸酶 OVP1 是一个电致质子泵，该基因受低温诱导表示出，将其在水稻中超表示出，正常条件下转基因植株苗期与野生型植株在表型上没有明显差异，但在低温条件下转基因植株的细胞膜完好性程度和脯氨酸含量提高，MDA 含量

24、降低，耐冷性加强51.Ran Ras-like nuclear protein 是真核细胞中含量极丰富的小分子的 GTP 酶，在植物发育、环境响应方面具有重要的作用。OsRNA2 受低温诱导表示出，不受高盐、干旱诱导表示出，根细胞有丝分裂指数与 OsRNA2 基因表示出水平密切相关，在水稻中组成型超表示出 OsRNA2 基因，可促进低温胁迫条件下完好核膜的构成，有效维持细胞分裂，加强植株的耐冷性52.OsRNA1 受低温和吲哚乙酸诱导表示出，同样不受高盐、干旱诱导表示出，在水稻中组成型超表示出 OsRNA1 基因，同样可促进低温胁迫条件下完好核膜的构成，有效维持细胞分裂，提高植株脯氨酸和可溶性

25、糖含量，加强植株的耐冷性53. 4 瞻望 近年来全球气候逐步变暖，极端气候变化频率增加，冷热不均，造成低温灾祸发生频率增加，因而，提高水稻耐冷能力在维护农业高产稳产、农业可持续性发展及保障粮食安全方面具有越来越重要的作用。为了克制低温对水稻的不利影响，到达增产稳产的目的，除了采取其他农业措施外，挑选和选育强耐冷性水稻种质资源，挖掘强耐冷性基因，然后通过基因工程技术提高水稻耐冷性是有效的途径。 当前，水稻耐冷基因工程研究已从蛋白激酶、转录因子、浸透调节物质、脂肪酸去饱和代谢关键酶基因等方面获得了一定的进展，具有潜在的应用前景。但该领域还存在一些亟待解决的问题： 1 耐冷性大多是受多基因控制的数量

26、性状，水稻高抗寒性的表现往往需要一系列相关基因的共同表示出，通过转单个耐冷基因获得的转基因植株的耐冷性加强幅度有限，故今后应该进行转多个耐冷基因尤其是调节基因的系统研究。 但当前，同时转化多个基因的技术还不成熟，此方面有待进一步深切进入研究。 2 转基因植株的耐冷性鉴定大多是在苗期进行的，植株苗期耐冷不代表其他生育时期也耐冷，尤其是对产量影响较大的抽穗期-灌浆期，故需要同时进行苗期和抽穗期-灌浆期的耐冷性鉴定，这样才能获得在低温条件下既不影响生长发育又能保证产量的转基因耐冷植株。 3 转基因植株的耐冷性鉴定大多是在室内或培养箱等可控条件下进行的，这与大田自然冷害有所不同，因而在两种条件下表现的

27、耐冷性可能会有所不同，故建议转基因植株的耐冷性鉴定进一步在田间进行，以确定转基因植株的耐冷性。 4 耐冷目的基因大多是采用组成型强启动子驱动的，固然能够提高转基因植株的耐冷性，但有时会影响转基因植株的生长发育，最终可能会影响到产量，因而，在今后的研究及实际应用中建议使用胁迫诱导型启动子驱动耐冷目的基因以提高转基因植株的耐冷性。 以下为参考文献： 1 Hadiarto T,Tran LSP. Progress studies of drought-responsivegenes in riceJ. Plant Cell Reports,2018,30 3 : 297- 310. 2 Orvar

28、BL,Sangwan V,Omann F,et al. Early steps in coldsensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and mem-brane fluidityJ. The Plant Journal,2000,23 6 : 785- 794. 3 Sangwan V,Foulds I,Singh J,et al. Cold activation of Bras-sica napus BN115 promoter is mediated by structural changesin membranes and cytoskeleton,and requires Ca2 +in fluxJ. The Plant Journal,2001,27 1 : 1 -12. 4 杨洪强，梁小娥。 蛋白激酶与植物逆境信号传递途径J.植物生理学通讯，2001,37 3 : 185 -191.