探究ape-lin是否促进骨髓间充质干细胞的增殖,细胞生物学论文.docx

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1、探究ape-lin是否促进骨髓间充质干细胞的增殖,细胞生物学论文1993 年 O Down 等1初次发现 7 次 螺旋的跨膜区段组成的 G 蛋白偶联受体 APJ apelin-angioten-sin receptor-like,APJ .1998 年，Tatemoto 等2从牛的胃蛋白提取并纯化 APJ 的内源性配体 apelin.Apelin / APJ 系统组织分布广泛，生物学功能多样。 研究发现，Apelin 具有舒张血管、降低血压、加强心肌收缩力、调节下丘脑-垂体激素释放、抑制抗利尿激素的释放、调节摄食摄水以及抵抗艾滋病毒侵入细胞等多种生物学效应。Apelin/APJ 系统还介入糖尿

2、病肾病、大血管并发症、视网膜新生血管的发展，是一种重要的生理调节肽。Apelin / APJ 系统具有促进细胞增殖的作用。 Apelin 在人的成骨细胞大量表示出，可刺激成骨细胞的增殖。在鼠的胃上皮细胞含有大量 Apelin,并证明在体外 Apelin 刺激胃上皮细胞的增殖。Apelin 具有血管生成因子的作用，研究发如今视网膜血管内皮细胞中，Apelin-13 和 Apelin-36 呈浓度依靠性促进细胞迁移、增殖和毛细血管构成。骨髓间充质干细胞 bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs主要来源于骨髓组织，具有多向分化潜能，增殖迅速、可塑性、可移植性及

3、自我更新能力强。在体外可被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、神经元样细胞等，这正是其多向分化潜能特点的具体表现出。文献3报道 apelin 能够介入多种细胞增殖的经过，但 apelin 能否能影响骨髓间充质干细胞的增殖尚不清楚，也未见相关报道。本文旨在探究 ape-lin 能否促进骨髓间充质干细胞的增殖。 1 材料与方式方法 1. 1 试剂与材料 Sprague-Dawley SD 大鼠购自湖南农业大学动物部； Apelin-13 多肽 057-19 购自美国 Phoenix Biotech 公司； 培养基、血清、胰酶等均购自美国 Gibco 公司； MTT 购自美国 Sigma 公

4、司；GNP-9080 隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 ; 流式细胞仪 美国 Becton Dickinson 公司 ; 酶标仪 美国 Labsystem Dragon 公司 . 1. 2 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 将SD 大鼠浸泡于 75% 医用酒精中 15 min,在无菌条件下切开大鼠组织，取股骨，去除外表软组织，冲出骨髓，接种于培养瓶。用含 10%FBS 的 DMEM 高糖培养基，37 5% CO2培育箱中孵育培养。当培养的原代细胞生长密度到达70% 80%以上后，弃去原培养液，用 PBS 洗 2 次，参加 0. 05% 胰蛋白酶消化液，放置于 CO2培养箱中孵育 5

5、min; 用巴式吸管汲取培养基反复吹打培养瓶壁，当贴壁的细胞悬浮后，取悬浮液 800 r/min 离心 8 min; 弃去上清液，参加培养基，继续培养至细胞重新悬浮时，分瓶进行传代培养。倒置显微镜观察细胞生长状态。 1. 3 流式细胞术检测细胞周期 将细胞以 1 106cells / L 接种于六孔板，直到细胞生长至 70% 80%状态时，用含有0.1%胎牛血清胞培养24 h 细胞同步化 ,然后分别参加不同浓度 apelin-13 继续孵育 24 h后用胰酶消化并收集细胞，PBS 洗两遍，弃上清，参加1 mL 70% 预冷乙醇中，吹打均匀，4 固定 12 h.PBS洗涤去乙醇，1 000 r/

6、min,5 min,洗两遍。0. 5 mL PBS重悬细胞，参加PI 和 RNaseA 至终浓度50 g/mL,37温浴30 min,上流式细胞仪测定细胞周期。 1. 2. 3 MTT 比色法测定细胞增殖 将细胞以 1 106cells / L 的浓度接种在 96 孔板中，直到细胞生长至 70% 80%状态时，再用含有 0. 1% 胎牛血清胞培养 24 h 细胞同步化 ,然后分别参加不同浓度apelin-13 继续孵育 24 h,每孔参加浓度为 5 g / L 的MTT 20 L,继续培养 3 h,然后吸出孔内培养液后，参加 DMSO 在 37中孵育 15 min 以后将其震荡混匀，再经酶联免

7、疫检测仪测定 OD 值 570 nm 处的检测波长 . 1. 2. 4 统计学分析 使用 SPSS 13. 0 软件进行统计与分析，数据以 x s 表示。组间比拟采用单因素方差分析，当 P 0. 05 即具有统计学意义。 2 结 果 2. 1 倒置显微镜观察 apelin-13 对骨髓间充质干细胞增殖的影响 分别采用不同浓度 apelin-13 0. 1 mol/L、1. 0 mol/L 和 10. 0 mol/L 处理大鼠骨髓间充质干细胞 24 h 后，倒置显微镜下观察细胞增殖，结果提示： apelin-13 显着促大鼠骨髓间充质干细胞的增殖 见图 1 . 2. 1 流式细胞术检测 apel

8、in-13 对骨髓间充质干细胞增殖的影响 表 1 表示清楚，与对照组相比拟，ape-lin-13 刺激后处于 S 期和 G2-M 期的细胞数目显着增加，G0-G1 期的细胞数目显着减少。apelin-13 刺激后增殖指数 PI 显着增加。提示： apelin-13 显着促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖。 2. 2 MTT 法观察 apelin-13 对大鼠骨髓间基质干细胞增殖的影响 图 2 表示清楚 apelin-13 0. 1 mol/L、1. 0 mol / L和 10. 0 mol / L 处理大鼠骨髓间充质干细胞后，呈浓度依靠性促进细胞的增殖，且在 apelin-13 浓度为1 mol/

9、L 时，与对照组比拟差异有显着性，在apelin-13 浓度为 10 mol / L 时促增殖作用最显着。 3 讨 论 血管紧张素受体样受体 APJ 是一种孤儿 G 蛋白偶联受体1.Apelin 是 APJ 受体当前已经知道的唯一内源性配体2.大量实验表示清楚，apelin 促进血管平滑肌细胞、视网膜血管内皮细胞、胃腺上皮细胞、脂肪细胞、成骨细胞等增殖经过。这些线索提示 ape-lin 可能介入骨髓间充质干细胞的增殖。 骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，具有快速增殖的能力，能够在体外可被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、神经细胞等。骨髓间充质干细胞已在退行性及缺损性疾病、心血管疾病、

10、肝移植、肺纤维化等疾病治疗方面获得良好效果。 骨髓间充质干细胞的植入物具有修复动物骨缺损的能力。将人骨髓间充质干细胞在体外培养，并贴附于生物材料上修复大鼠股骨干骨缺损也获得了好的效果。骨髓间充质干细胞在心梗后既能促进新血管的构成又有分化为心肌细胞的能力。 Apelin 促进细胞增殖4-5,但 apelin 与骨髓间充质干细胞关系尚不清楚，本实验采用不同方式方法初步证明apelin-13 促进骨髓间充质干细胞增殖。分别给予 ape-lin-13 0. 1 mol / L、1 mol / L、10 mol / L 处理细胞 24h 后，用流式细胞术和 MTT 比色法检测到 apelin-13 显着

11、促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖，且在 apelin-13浓度为 1 mol/L 时，与对照组比拟有显着性差异，10 mol / L时增殖最显着。以上结果表示清楚 apelin-13 呈浓度依靠性促骨髓间充质干细胞的增殖。 骨髓间充质干细胞具有易获得、易培养、低免疫原性、易于外源基因的转入和表示出等特性，且具有自我更新能力，并能迅速增殖，在组织器官移植中具有重要的应用价值6.Apelin 能促进骨髓间充质干细胞的增殖，因而，高表示出 apelin 的骨髓间充质干细胞或许能作为理想的种子细胞被广泛应用于组织工程、细胞移植、基因治疗及器官移植等领域。但 ape-lin 是怎样影响骨髓间充质干细胞增殖

12、，其分子机制还有待将来的进一步讨论。 以下为参考文献： 1 O Dowd BF,Heiber M,Chan A,et al. A human gene thatshows identity with the gene encoding the angiotensin re-ceptor is located on chromosome 11J. Gene,1993,136 1-2 :355-360. 2 Tatemoto K,Hosoya M,Habata Y,et al. Isolation andcharacterization of a novel endogenous peptide

13、ligand forthe human APJ receptorJ. Biochem Biophy Res Comm,1998,251 2 : 471-476. 3 Li F,Li L,Qin X,et al. Apelin-induced vascular smoothmuscle cell proliferation: the regulation of cyclin D1J.Front Biosc,2008,13 5 : 3786-3792. 4 Li L,Xie F. Jagged-1/Notch3 signaling transduction path-way is involved

14、 in apelin-13-induced vascular smoothmuscle cells proliferationJ. Acta Bio Biophy Sin,2020,45 10 : 875-881. 5 Yang L,Su T,Lv D,et al. ERK1/2 mediates lung adeno-carcinoma cell proliferation and autophagy induced byapelin-13 J. Acta Bio Biophy Sin,2020,46 2 :100-111. 6 Wislet-Gendebien S,Hans G,Leprince P,et al. Plasticityof cultured mesenchymal stem cells: switch from nestin-positive to excitable neuron-like phenotype J. StemCells,2005,23 3 : 392-402.