微生物实验精品资源共享.pptx

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1、微生物学实验微生物学实验实验流程土壤样品中微生物的 分离纯化细菌酵母菌霉菌放线菌形态结构观察生理生化反应nisin效价测定生长曲线测定形态观察死活细胞鉴定直接计数形态结构观察菌种保藏土壤样品中微生物的 分离纯化细菌土壤中微生物的分离、纯化土壤中微生物的分离、纯化和培养和培养相关理论知识（1）微生物的分离与纯化 从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。常用的分离、纯化方法 微生物能在固体培养基上长成菌落，通常一个菌株可以长成一个菌落。因此可通过挑取单菌落而获得一种微生物。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。相关理论知识（2）土壤生境 土壤是微生物生活的大本营

2、，土壤所含微生物无论在数量上，还是种类上都极其丰富,因此,土壤是获取微生物的重要来源，我们可以从土壤中分离、纯化得到许多有价值的微生物菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。目的要求1、了解微生物分离和纯化的原理。2、掌握常用的分离纯化微生物的方法。3、掌握倒平板的方法。4、进一步熟练和掌握微生物的无菌操作技术。5、掌握微生物的培养方法。实验原理微生物分离与纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。平板分离法 普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件（如营养成分、酸碱度、温度和氧等,或加入某种抑制剂），在平板上培养微生物，当

3、平板上长出单菌落后，挑取，得到纯种的微生物。试剂与器材1、材料 含大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、根霉、青霉和放线菌的土壤样品，牛肉膏蛋白胨培养基（斜面、液体、半固体）、马丁氏培养基、查氏培养基等2、试剂 培养基成分，水，琼脂3、器材 试管、三角瓶、涂布器、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿等。牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂 15-20g用水定容至 1000ml用于分离细菌查氏培养基 NaNO3 2gK2HPO4 1gKCl 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g蔗糖 30g琼脂 15-20g用水定容至 1000ml用于分离霉菌高氏一号培养基 可

4、溶淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g琼脂 15-20g用水定容至 1000ml用于分离放线菌马丁氏培养基 葡萄糖 10g 蛋白胨 5g K2HPO4 1g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 15-20g pH 自然 用水定容至 800ml 用于分离酵母菌实验步骤注意事项1、实验过程中关闭紫外灯2、本实验要严格地按照无菌操作进行。3、接种环要灼烧灭菌。接触菌体前要冷却。接种后要在火焰上灼烧。4、实验在洁净工作台内进行，操作时菌体不 应和火焰太过接近。5、培养时要倒置培养，防止染菌。6、取单菌落时不要碰到其

5、它的菌落。细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察相关理论知识细菌形态群体的形态 细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。个体的形态 主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类。细菌形态随培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为简单染色、鉴别染色、特殊染色三种类型。目的要求1、了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法2、初步认识细菌的形态。3、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌 操作技术

6、。4、巩固显微镜的油镜的使用方法。简单染色法原理 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色。细菌在中性、碱性或弱酸性溶液环境中通常带负电荷，碱性染料（解离时分子的染色部分带正电荷）如美兰、结晶紫等易与细菌结合使其着色。试剂与器材1、材料 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌2、试剂 吕氏碱性美蓝染液或草酸铵结晶紫染液3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内 装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。实验步骤涂片干燥：室温自然干燥固定：通过火焰23次，细胞质凝固染色：滴加染液冲洗：水洗至无色干燥：自然干燥镜检注意事项涂片时水滴不要太大，菌体最好涂成一个薄膜。要求涂布均匀。室温自然干燥。固定时,通过火焰2

7、3次，不可以加热过久。染色时,滴加染液覆盖上菌体薄膜即可。冲洗时,水洗至无色，要注意水流要有一个角度，从载片的一端自然流到另一端，但是水流要通过染色过的菌体薄膜。水流不宜过大，防止将菌体冲走。镜检时，油镜与普通的物镜要严格地按照操作规程执行。细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色相关理论知识革兰氏染色法 它是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。菌种鉴定的重要手段 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，它是细菌学上最常用的鉴别染色法。目的要求1、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法 步骤。2、掌握革兰氏染色法的原理。革兰氏染色实

8、验原理 革兰氏染色能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后变成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。试剂与器材1、材料 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。2、试剂 结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内 装香柏油及二甲苯）、擦镜纸

9、、生理盐水等。革兰氏染色实验步骤制片：取菌种培养液常规涂片，干燥，固定。初染：滴加结晶紫，染色12min，水洗；媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min,水洗；乙醇脱色：滤纸吸去残水，倾斜玻片用95乙醇 洗涤脱色至无色，立即水洗；复染：番红液复染约2min，水洗；镜检：革兰氏阳性菌（蓝紫色）；革兰氏阴性菌 （红色）实验结果（1）革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌革兰氏染色结果革兰氏染色结果 注意事项1.涂片务求均匀，切忌过厚。2在染色过程中，不可使染液干涸。火焰固定不 宜过热。3脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳 性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被 染成阳性菌

10、。4不能选用老龄菌。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应相关理论知识（1）微生物分类学它是一门按微生物的等级关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群（taxon）的科学。它具体的任务是分类（classification）、鉴定（identification）和命名（nomenclature）。相关理论知识（2）微生物的鉴定获得该微生物的纯种培养物（pureculture）；测定一系列必要的鉴定指标；查找权威性的鉴定手册。经典分类鉴定方法 形态；生理、生化反应；生态特性；生活史特点；血清学反应（免疫学鉴定）；噬菌体的敏感性等现代分类鉴定方法 微生物遗传型的鉴定 细胞化学成分的鉴定

11、目的要求1、了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的实验 原理和方法。2、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物 在鉴别细菌中的意义。3、了解糖发酵原理及在肠道细菌鉴定中的作用。实验原理（1）各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过水解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。

12、实验原理（2）有些细菌代谢过程中产酸（乳酸、醋酸、丙酸）和/或产气(H2,CH4,CO2）；酸用指示剂检测；气通过直接观察。有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。有些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP反应。实验原理（3）某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，

13、当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。实验原理（4）不同细菌利用柠檬酸盐能力不同，有的细菌可利用柠檬酸盐作为碳源，有的则不能。某些细菌将柠檬酸盐分解为二氧化碳，培养基中由于有游离钠离子存在而形成碳酸钠，使培养基碱性增加。根据培养基中指示剂变色来判断实验结果。指示剂可用溴麝香草酚蓝(pH6 呈黄色，pH 6-7.6呈绿色，pH7.6呈蓝色）。有些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，可产生黑色硫化铅或硫化铁沉淀，从

14、而可确定硫化氢的产生。多糖的水解吲哚实验 1吲哚实验 2伏普实验试剂与器材1、材料 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、固体淀粉培养基。2、试剂 甲基红试剂、40%氢氧化钾、5%-萘酚、乙醚、吲哚试剂。3、器材 德汉氏小管、试管、接种环、恒温培养箱、高压灭菌器等。淀粉的水解实验1、固体淀粉培养基灭菌后冷却至50,倒平板；2、用记号笔将平板分区，不同的区域接种不同的菌种，记录接种的菌种名；3、平板倒置在37培养24h;4、将平板打开，加入Lugols碘液，轻轻旋转，观察结果。糖发酵实验实验步骤 取半固体葡萄糖发酵培养基试管2支，分别用接种针穿刺接入大肠杆菌

15、、枯草芽孢杆菌，37 培养24h。观察记录 与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“”表示。培养液中有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”表示；如管内没有气泡为阴性反应，记录用“”表示。吲哚实验实验步骤 用接种环分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌到含有蛋白胨水培养基的2支试管中,将试管置37恒温培养箱中培养48h。向培养后的蛋白胨水培养基内加3-4滴乙醚，摇动数次，静置3min,待乙醚上升后，沿试管壁缓慢加入2滴吲哚试剂。观察记录 在乙醚与培养物之间产生红色

16、环状物的，为阳性反应，否则为阴性。V-P test 以无菌操作分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基（V-P test），置37恒温箱中培养。向培养物内加入5-10滴40%KOH,然后加入等量的5%-奈酚溶液，用力振荡，再放入37 保温15-30 min,若培养物呈红色，为V-P test 阳性。甲基红实验 分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基，置37恒温箱中培养。向培养物内加入甲基红指示剂1至2滴，阳性呈鲜红色，阴性为黄色。柠檬酸盐利用实验将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于2支柠檬酸盐斜面上，置于37培养24-48小时。观察柠檬酸盐培养基上有

17、无细菌生长和是否变色，斜面呈蓝色的是阳性反应，呈绿色的为阴性反应。硫化氢产生实验将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别穿刺接种于2支半固体培养基中，置于37培养24-48小时。观察结果，如培养基中出现黑色沉淀线者，为阳性反应。注意事项1、实验中无菌操作。2、吲哚实验中加入乙醚时要缓慢地加入。3、培养时间达到要求时间，现象明显。4、配制氢氧化钾时，要注意不要腐蚀皮肤和实验台。酵母菌的形态观察、直接计数及酵母菌的形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定死活细胞的鉴定相关理论知识酵母菌形态 酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多。酵

18、母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。单细胞的酵母菌单细胞的酵母菌 面包酵母（长有芽孢）面包酵母（长有芽孢）酵母菌的出芽生殖酵母菌的出芽生殖 真菌菌丝和酵母菌真菌菌丝和酵母菌相关理论知识酵母菌菌落特征 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。啤酒酵母的菌落啤酒酵母的菌落 红酵母的菌落红酵母的菌落 各种酵母菌的菌落各种酵母菌的菌落 显微计数法 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的

19、悬浮液。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽细菌计数板计数。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜。血球计数板 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。血球计数板特征目的要求1、观

20、察酵母菌的形态特征及出芽方式。2、学习鉴别死活细胞的方法。3、了解血球计数板构造及计数原理，掌握显微计数 的原理及方法。实验原理酵母菌观察 酵母菌是单细胞真核生物，菌体比细菌大且不运动。繁殖方式以无性为主（芽殖或裂殖），有性繁殖产生子囊和子囊孢子。直接计数法 直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。死活细胞鉴定 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型为无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。

21、因此不仅用此法可以观察酵母细胞的形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。试剂与器材1、材料 酿酒酵母2、试剂 0.05%和0.1%的吕氏碱性美蓝液、革兰氏染色用 的碘液。3、器材 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯等。实验步骤（1）死活细胞鉴定（美蓝浸片观察）在载玻片中央加一滴0.1美蓝染色液，挑菌混匀；倾斜缓慢放置盖玻片；放置3min后镜检；染色半小时后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加；实验步骤（2）计数实验镜检计数室，去污，清洗，吹干；盖上盖玻片，菌悬液于边缘滴一小滴，渗入，使充满菌液；显微镜计数 加样后静止5min，每个小格内510个菌体，取5个中格（可选4个角和中央的一个中格

22、）计数；代入公式计算结果。1ml菌液中的总菌数N/5 x 25 x 10000 x M(N为5个中方格中总菌数，M为菌液稀释倍数）清洗。注意事项1、酵母菌制片时，菌体不能过多。2、染色时间要掌握好。3、清洗血球计数板不能用手或者别的硬物擦拭。放线菌与霉菌的形态观察放线菌与霉菌的形态观察相关理论知识（1）放线菌(Actinomycetes)是一群丝状革兰氏阳性细菌，在气生菌丝末端形成孢子。细胞壁主要成分是肽聚糖，最适pH与细菌相似。主要以孢子方式进行无性繁殖。许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。已知放线菌能够产生500多种抗生素。相关理论知识（2）放线菌是单细胞的原核生物。与其它的原核生物不同

23、的是，放线菌的菌体一般由分枝状的菌丝构成，菌丝的宽度在1 um左右。放线菌的菌丝可以分为两类：伸入到培养基内部的菌丝称为基内菌丝，主要功能是吸收营养物质；伸展在空气中的菌丝称为气生菌丝，这类菌丝较粗，呈直线形或弯曲分枝形。大多数放线菌都是靠基内菌丝吸收营养物质，进行腐生生活的。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群。相关理论知识（3）The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基内菌丝）and aerial mycelium（气生菌丝）with chains of co

24、nidiospores（分生孢子）相关理论知识（4）相关理论知识（5）相关理论知识（6）真菌是微生物中的一大类群，属于真核微生物，与人类关系非常密切。真菌可以用来发酵生产抗生素（如青霉素、头孢霉素）、有机酸等。它在自然界中则扮演着有机物分解者的角色。有些真菌是病原菌，能引起人类和动植物病害。霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。相关理论知识（7）菌丝体 构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。菌丝是一种管状的细丝，把它放在显微镜下观察，很像一根透明胶管，直径一般为3-10微米，比细菌和放线菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分

25、枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。霉菌菌丝类型无隔膜菌丝 菌丝中无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多个细胞核。这是低等真菌（即鞭毛菌亚门和接合菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型。有隔膜菌丝 菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由很多个细胞组成。在隔膜上有1至多个小孔，使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通。这是高等真菌（即子囊菌亚门和半知菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型。相关理论知识（8）霉菌有着极强的繁殖能力，而且繁殖方式也是多种多样的。霉菌菌丝体上任一片段在适宜条件下都能发展成新个体，在自然界中，霉菌主要依靠产生形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。孢子有

26、点像植物的种子，不过数量特别多。霉菌的无性孢子直接由生殖菌丝的分化而形成，常见的有节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子和分生孢子。由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较大。菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。目的要求1.了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征实验原理 本实验采用的是插片法观察放线菌和霉菌。将放线菌或霉菌接种在琼脂平板上，插上灭菌的盖玻片后培养，使放线菌或霉菌的菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交

27、接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌或霉菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。试剂与器材1、材料 各种霉菌及放线菌菌种2、试剂 查氏培养基、高氏培养基、乙醇3、器材 接种环、酒精灯、脱脂棉、镊子、载玻 片、盖玻片、经灭菌的培养皿、试管、超 净工作台、培养箱、显微镜实验步骤l倒平板 将培养基熔化后，倒20毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用。l接种 无菌操作将霉菌和放线菌分别划线接种到培养基上l插片 将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为1/2或1/3。l培养 将接菌及插片结束后的培养皿放入28的培养箱倒

28、置培养l镜检 培养后菌丝体生长在培养基上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。l记录绘图 实验结果示意图关键步骤及注意事项1、倒平板要厚一些，接种时划线要密。2、插片时要有一定角度并与划线垂直。3、观察时，宜用略暗光线，先用低倍镜找到适当视 野，更换高倍镜观察。4、如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观 察，效果会更好。乳链菌肽效价的生物测定乳链菌肽效价的生物测定相关理论知识 乳酸链球菌素(Nisin)是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。Nisin本身

29、具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏，Nisin的溶解性、稳定性都与溶液的pH值密切相关，溶解度随pH值的下降而提高，pH值2.5时溶解度为12%,pH值为5.0时下降到4%，在中性及碱性条件下几乎不溶解。Nisin能抑制大部分革兰阳性菌及其芽抱的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属以及梭状芽抱杆菌属和芽抱杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显。目的要求掌握乳链菌肽效价的生物测定方法熟悉琼脂扩散法的操作了解乳链菌肽的抑菌作用实验原理 乳链菌肽的微生物测定方法有比浊法和琼脂扩散法等。本实验采用国际上最普遍应用的琼脂扩散法来测定抗菌肽效价。它是将规格一定的不锈钢小管置于带菌琼

30、脂平板上或者在琼脂平板上打孔，管中加入被测液，放入温箱培养。在菌体生长的同时，被测液扩散到琼脂平板内，抑制或杀死周围细菌的生长，从而产生不长菌的透明的抑菌圈。在一定的范围内，抗菌物质的浓度（对数值）与抑菌圈直径（数学值）呈直线关系。因此，根据抑菌圈的大小，可以求出相应的抗菌物质的效价。试剂与器材1、材料 乳酸乳球菌、枯草杆菌2、试剂 乳酸乳球菌培养基，LB液体培养基，底层琼脂、顶层琼脂培养基 注：把镊子、打孔器、枪头（1ml、100ul）、5ml的EP管等灭菌。3、器材 牛津小杯、培养皿、离心机等培养基乳酸乳球菌培养基 蔗糖 1%、蛋白胨 0.45%、酵母膏 1%、K2HPO4 2.84%、N

31、aCl 0.2%、MgSO47H20 0.02%100ml 配制100mlLB液体培养基 蛋白胨 1g、酵母粉 0.5g、NaCl 1g 底层琼脂培养基 胰蛋白胨 0.8g、酵母粉 0.5g、葡萄糖 0.5g、NaCl 0.5g、Na2HPO412H20 0.2g、琼脂 1g 100ml 顶层琼脂培养基 胰蛋白胨 0.8g、酵母粉 0.5g、葡萄糖 0.5g、NaCl 0.5g、Na2HPO412H20 0.2g、琼脂 0.5g 配制100ml实验步骤将乳酸乳球菌发酵液取出20ml于50ml离心管中，用盐酸调pH到2，离心。将配好的顶层琼脂加热熔化。把枯草杆菌发酵液的浓度稀释到OD600 值为

32、0.16。将稀释后的发酵液200微升加入100毫升顶层培养基中。在平板中先铺一层琼脂培养基。待加热熔化的顶层琼脂降温至50左右，加入确定量的枯草杆菌，混合均匀，加入已经铺好底层琼脂的平板中，每个平板加5ml。待凝固后打孔。挑出孔内琼脂，往里面加入步骤1中的乳酸乳球菌的上清，加平即可。注意事项加指示菌的琼脂培养基要冷却到50左右后，再加指示菌打孔时要注意不要打裂乳链菌肽上清液要加满平板上的孔微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏相关理论知识 菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。微生物菌种的保藏方法有斜面冰箱保存法、

33、石蜡油封藏法、沙土保藏法和冷冻干燥保存法等。其中以斜面冰箱保存法最为简便。目的要求1、了解菌种保藏的基本原理 2、掌握几种常用的菌种保藏方法。实验原理 菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。试剂与器材1、材料 各种需要保藏的菌种及相应的培养基、河砂、瘦黄土或红土。2、试剂 EDTA、NaAc、10mmol/LTris、液体石蜡、

34、甘油、五氧化二磷、95%乙醇、10%盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰。3、器材 无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿、安瓿瓶、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条、干燥器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、斜面低温保藏 这是一种常用的而且是最简便的保藏方法。首先将要保藏的菌种移接到适宜的斜面培养基上。一般采用营养丰富的半合成培养基，如PDA培养基，麦芽汁琼脂培养基等。为了减少培养基水分蒸发，延长保藏时间，可将琼脂用量加到20%。在这些培养基中，最好再加入少许0.2%的K2HP04、KH2PO4、CaCO3等缓冲剂，以中和菌种在保藏过程中产生积累的有机酸。用适宜温度培养至菌丝长满斜面，选择

35、菌丝生长健壮的试管，先用硫酸纸包扎好管口棉塞，再将若干支试管用牛皮纸包好。液体石蜡保藏 将要保藏的菌种接入前面介绍的马铃薯半合成培养基上，培养至菌丝长满斜面，选择生长健壮的备用。然后选用化学纯的液体石蜡装入三角瓶内，装至瓶体的/3处，塞上棉塞后包扎，kg/cm2灭菌小时。灭菌后，放在40恒温箱中，使水分蒸发至石蜡液透明为止。冷却后在无菌箱(室)内，以无菌操作方法，用无菌吸管分别注入待保存的各个试管菌种内，注入量以淹过斜面1cm为宜。然后塞以橡皮胶塞，用蜡封口，直立于试管架上，放入4冰箱中或常温下保藏。此法可保藏57年，但最好12年移植一次。使用时，不必倒去石蜡油，只要用接种针从斜面上挑取小块菌

36、丝即可(但要尽量少带石蜡油)。余下的母种可继续保藏。由于挑出移接的菌丝块沾有石蜡，故生长微弱，必须转接几次才能恢复正常。砂土管保藏法河砂处理 取河砂若干加入盐酸10%，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10 x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行

37、灭菌(通常采用间歇灭菌2-3次)，烘干。无菌检查 每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌后方可使用。菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18x180mm 的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。分装样品 每支砂土管(注明标记后)加入05ml菌悬液(刚刚使砂土润湿为宜)，用接种针拌匀。干燥 将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。保存 置4冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此

38、法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。注意事项1、实验操作要严格无菌。2、需保藏的菌种需是生长健壮的菌种。3、各种保藏方法的有效时间不同，时间到了以后要及时地进行菌种活化后，再进行菌种保藏。细菌生长曲线的测定细菌生长曲线的测定实验目的1、了解细菌生长的特点及测定原理，掌握其生长规 律，绘制生长曲线。2、掌握光电比浊法测量细菌数量的方法。实验原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌体量，以菌体量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细

39、胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解菌体的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。试剂和器材1.菌种：大肠杆菌2.LB液体培养基：蛋白胨 10g 酵母粉 5g NaCl 10g 葡萄糖 2g 蒸馏水 1000ml pH7.4，灭菌20分钟3.仪器及其他：752分光光度计、恒温摇床、无菌试管、无菌吸管、三角瓶、试管。方法步骤每组用5ml无菌吸管准确吸取LB培养基于1支无菌试管中，作为空白对照。量取100ml液体培养基加到250ml摇瓶中，用5ml无菌吸管准确吸取1ml大肠杆菌培养液，接入到摇瓶中，振荡。将已接种的摇瓶置摇床37恒温培养，每隔两小时取样，用分光光度计测定其光密度值，波长选用600nm画出菌体生长曲线注意事项取样时间要平行测菌体光密度要准确确保发酵液不要染菌