核酸扩增技术.pptx

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1、目目 录录大纲要求：大纲要求：n掌握掌握PCRPCR的原理和反应过程的原理和反应过程n掌握掌握PCRPCR反应体系反应体系n掌握掌握PCRPCR产物产物的检测的检测n熟悉实时荧光定量熟悉实时荧光定量PCRPCR的原理和方法的原理和方法n了解了解以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术Special第1页/共97页目目 录录二、教学内容二、教学内容第一节第一节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应第二节第二节 以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术第三节第三节 PCRPCR产物的检测产物的检测第第X X节节 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR现在位置现在位置 P169第2页/共97页

2、目目 录录基础知识基础知识遗传中心法则遗传中心法则现在位置现在位置 P169第3页/共97页目目 录录+基础知识基础知识第4页/共97页目目 录录基础知识基础知识第5页/共97页目目 录录DNADNA加热变性加热变性DNADNA冷却复性冷却复性一、一、核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理基础知识基础知识第6页/共97页目目 录录DNA变性变性(denaturation)定义：定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA分子分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构

3、的过程。团样结构的过程。基础知识基础知识第7页/共97页目目 录录基础知识基础知识第8页/共97页目目 录录融解温度融解温度（TmTm）定义：）定义：在在DNADNA热变热变性时，其性时，其A260A260的升高达最大的升高达最大值一半时的温值一半时的温度。度。基础知识基础知识melting temperature，第9页/共97页目目 录录DNA复性复性定义：变性的单链核酸分子在一定条件下定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称程，称复性或杂交复性或杂交。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此经缓慢冷却后即可复

4、性，此过程称为过程称为退火退火(annealing)。基础知识基础知识第10页/共97页目目 录录基础知识基础知识第11页/共97页目目 录录基础知识基础知识dNTPndATPndCTPndGTPndTTPdNTP第12页/共97页目目 录录PCR概念：在概念：在体外体外特异地特异地复制复制一段一段已知已知序列的序列的DNA片段片段的过程。的过程。第一节第一节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应现在位置现在位置 P169第13页/共97页目目 录录一、一、PCRPCR的原理和反应过程的原理和反应过程PCRPCR反应反应重复重复进行进行DNADNA复制复制的过程，使的过程，使DNADNA得得以以扩增扩

5、增，每一次复制包括，每一次复制包括3 3个步骤：个步骤：变性变性（denaturationdenaturation）退火退火（annealingannealing）延伸延伸（extensionextension）现在位置现在位置 P125第14页/共97页目目 录录变性（变性（denaturationdenaturation）将待复制的双链将待复制的双链 DNADNA经经加热加热至至949495 95）左右一定时间后，）左右一定时间后，DNADNA双螺旋的双螺旋的氢键断裂，使之成为单链分子，作为反氢键断裂，使之成为单链分子，作为反应的应的模板模板（template)template)，以便它与

6、引物，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；结合，为下轮反应作准备；现在位置现在位置 P170第15页/共97页目目 录录退火（退火（annealingannealing）温度降低至寡核苷酸（温度降低至寡核苷酸（oligonucleotideoligonucleotide）引物引物的的融点温度融点温度以下（以下（40407070），使），使引引物物能与能与模板模板互补结合，形成杂交链；互补结合，形成杂交链；现在位置现在位置 P125第16页/共97页目目 录录延伸（延伸（extensionextension）将温度升至将温度升至7272左右，使反应体系中的左右，使反应体系中的DNADNA聚合酶聚

7、合酶按照按照模板链的序列模板链的序列以以互补互补的方的方式依次把式依次把dNTPdNTP加至加至引物的引物的33端端，使杂交，使杂交双链不断延伸，以至形成新的双链不断延伸，以至形成新的DNA DNA 双链。双链。现在位置现在位置 P125第17页/共97页目目 录录PCR的基本反应过程的基本反应过程变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C现在位置现在位置 P170（40-70 C）第18页/共97页目目 录录PCR的扩增效率的扩增效率现在位置现在位置 P170循环次数：0123 n产物数量：2 2 2 2 20123nn每一次循环后，一分子模板被扩增为两个分子n每个循环所产生的DNA片段

8、，即为下一个循环的模板nPCR产物量以指数形式增长第19页/共97页目目 录录1.模板模板DNA2.特异性引物特异性引物3.耐热耐热DNA聚合酶聚合酶4.dNTPs5.Mg2+二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分现在位置现在位置 P170第20页/共97页目目 录录1.模板模板DNA2.特异性引物特异性引物3.耐热耐热DNA聚合酶聚合酶4.dNTPs5.缓冲液缓冲液 二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分现在位置现在位置 P170第21页/共97页目目 录录模板模板(template)(template)模板模板就是将要被复制的核酸片段，就是将要被复制的核酸片段，

9、包括基因组包括基因组DNADNA、RNARNA、质粒、质粒DNADNA和线和线粒体粒体DNADNA等。等。在用在用 RNARNA作为模板时，须先将作为模板时，须先将 RNARNA逆转录逆转录为为cDNAcDNA，再以，再以cDNAcDNA作为作为PCRPCR反应的模板进行扩增反应。反应的模板进行扩增反应。现在位置现在位置 P125第22页/共97页目目 录录耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶（Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase）是从一种）是从一种生活在热泉（生活在热泉（80809090）中的水栖噬热菌）中的水栖噬热菌

10、（Thermus aquaticusThermus aquaticus）中提取的，有很高的耐热）中提取的，有很高的耐热稳定性。稳定性。TaqDNATaqDNA聚合酶的作用是聚合酶的作用是催化催化DNADNA合成合成，即，即在模板指导下，以在模板指导下，以dNTPdNTP为原料，在为原料，在引物的引物的3-OH3-OH端端,加上加上dNTP,dNTP,在二者间生成在二者间生成3 3，5-5-磷酸二酯磷酸二酯键，使键，使DNADNA链沿链沿5353方向延伸。方向延伸。现在位置现在位置 P170第23页/共97页目目 录录dNTPsdNTPsn即即dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP

11、和和dTTPdTTP四种脱氧核苷三磷四种脱氧核苷三磷酸的混合物。酸的混合物。n反应体系中反应体系中4 4种核苷酸的浓度必须一致种核苷酸的浓度必须一致n四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNADNA聚合酶错配聚合酶错配的机率。的机率。n浓度过高会加快反应速度，但导致非特异性扩增浓度过高会加快反应速度，但导致非特异性扩增n降低在降低在dNTPdNTP浓度会提高反应的特异性浓度会提高反应的特异性n一般为一般为20200umol/L 20200umol/L 现在位置现在位置 P170第24页/共97页目目 录录镁离子浓度镁离子浓度n 镁离子浓度在扩增反应中是一个至

12、关重要的镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素，因为镁离子对于因素，因为镁离子对于反应系统本身反应系统本身、稳定核稳定核苷酸苷酸和和提高提高Taq DNATaq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性有直接的影有直接的影响。响。nMg2+Mg2+浓度过浓度过低低使使酶活力降低酶活力降低nMg2+Mg2+浓度过浓度过高高又会使酶催化又会使酶催化非特异性扩增非特异性扩增。n一般为一般为1.5mmol/L 1.5mmol/L 现在位置现在位置 P172第25页/共97页目目 录录 引物引物(Primer)n 引物是引物是化学合成化学合成的的已知序列的寡核苷酸已知序列的寡核苷酸(oligonucleoti

13、de)分子分子。n引物决定引物决定PCR扩增扩增产物的特异性产物的特异性和和长度长度。现在位置现在位置 P170第26页/共97页目目 录录引物设计时必须遵循的原则（引物设计时必须遵循的原则（6 6条）条）1.用于用于PCRPCR反应的引物需要反应的引物需要二条二条，分别设在，分别设在被扩增目标片段的被扩增目标片段的二端二端，并分别与模板正，并分别与模板正负链负链序列互补序列互补。2.2.引物的长度一般以引物的长度一般以18182525个核苷酸个核苷酸为宜为宜引物过引物过长长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹发夹状结构状结构，引物过引物过短短则会则会降低扩增的

14、特异性降低扩增的特异性；现在位置现在位置 P171第27页/共97页目目 录录引物设计时必须遵循的原则引物设计时必须遵循的原则3.3.二条引物之间（尤其在二条引物之间（尤其在33端）的序列端）的序列不可有互补不可有互补，以免形成引物二聚体；，以免形成引物二聚体；4.4.引物的引物的碱基组成应平衡碱基组成应平衡，避免出现，避免出现嘌呤、嘌呤、嘧啶碱基堆积嘧啶碱基堆积。C CG G的比例一般为的比例一般为45554555%。现在位置现在位置 P171第28页/共97页目目 录录5.5.PCRPCR扩增中的退火温度是根据引物的扩增中的退火温度是根据引物的TmTm值而决定的，值而决定的，二条引物的二条

15、引物的TmTm值不能差别值不能差别太大太大。6.6.根据需要，合成引物时根据需要，合成引物时在其在其55端可以端可以加修饰成分加修饰成分如加入如加入酶切位点酶切位点，用，用生物素、荧光素、地生物素、荧光素、地高辛等标记高辛等标记，引入，引入突变位点突变位点，引入，引入启动子启动子序列序列，引入，引入蛋白质结合蛋白质结合DNADNA序列序列等。等。现在位置现在位置 P171引物设计时必须遵循的原则引物设计时必须遵循的原则第29页/共97页目目 录录三、三、反应条件反应条件1、温度、温度变性温度：一般把变性温度定在变性温度：一般把变性温度定在95959797之之间，以使模板间，以使模板DNADNA

16、和产物和产物双链完全打开双链完全打开。退火温度：退火温度决定退火温度：退火温度决定PCRPCR反应的特异性，反应的特异性，退火温度的设定取决于引物的退火温度的设定取决于引物的TmTm，通常，通常PCRPCR的的退火温度应退火温度应低于引物低于引物TmTm55左右。左右。延伸温度：一般为延伸温度：一般为7272，在这个温度下，在这个温度下TaqDNATaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性聚合酶具有较高的酶促活性，有利于，有利于DNADNA的复制。的复制。现在位置现在位置 P172第30页/共97页目目 录录2、时间、时间 nPCRPCR循环中每个步骤所需的循环中每个步骤所需的时间时间取决于取决于所

17、扩增片段的长所扩增片段的长度度。n以长度为以长度为2002001000bp1000bp的扩增片段为例，循环中变性、的扩增片段为例，循环中变性、退火和延伸三个步骤的持续时间退火和延伸三个步骤的持续时间一般均为一般均为3030秒秒1 1分钟分钟。n在模板（尤其是基因组在模板（尤其是基因组DNADNA）进行）进行第第1 1次变性时应给予足次变性时应给予足够长的时间够长的时间（5 57 7分钟，根据变性温度高低而异）以使分钟，根据变性温度高低而异）以使模板彻底变性，然后再进入循环。模板彻底变性，然后再进入循环。n时间时间过长过长会会降低扩增的特异性降低扩增的特异性。现在位置现在位置 P173第31页/

18、共97页目目 录录3、循环次数、循环次数 n循环次数一般为循环次数一般为20204545次。次。nPCRPCR扩增效率呈扩增效率呈S S型曲线，有平台效应型曲线，有平台效应n平台效应的原因：平台效应的原因：n初始模板量初始模板量n引物二聚体和反应产物抑制扩增引物二聚体和反应产物抑制扩增n反应体系的组份被消耗反应体系的组份被消耗n引物与模板引物与模板DNADNA间竞争间竞争 现在位置现在位置 173第32页/共97页目目 录录四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制n硬件方面硬件方面n实验室规范化设置实验室规范化设置n软件方面软件方面n样本采集样本采集n核酸提取核酸提取n扩增扩增n产物分

19、析产物分析n测定结果的报送测定结果的报送现在位置现在位置 P173第33页/共97页目目 录录（一）实验室的规范化设置（一）实验室的规范化设置n 临床基因扩增检验实验室必须包括临床基因扩增检验实验室必须包括四个工作区域四个工作区域：n试剂贮存和准备区试剂贮存和准备区；n标本制备区标本制备区；n扩增反应区扩增反应区；n产物分析区产物分析区。n这四个区域必须这四个区域必须互相独立互相独立，并严格，并严格按照上述顺序设置按照上述顺序设置。n每一区域都必须每一区域都必须配置专用仪器配置专用仪器，所用物品、试剂和耗材不，所用物品、试剂和耗材不得从某一个区域移至另一个区域使用。得从某一个区域移至另一个区域

20、使用。现在位置现在位置 P174第34页/共97页目目 录录（二）（二）PCR技术的质量保证技术的质量保证 PCR PCR技术用于临床检验的质量保证主要技术用于临床检验的质量保证主要涉及涉及基因扩增检验全过程基因扩增检验全过程的质量保证、的质量保证、室内质量控制室内质量控制和和室间质量评价室间质量评价。现在位置现在位置 P129第35页/共97页目目 录录（二）（二）PCR技术的质量保证技术的质量保证n样本采集样本采集n核酸提取核酸提取n扩增扩增n产物分析产物分析n测定结果的报送测定结果的报送现在位置现在位置 P129第36页/共97页目目 录录（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基

21、因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途现在位置现在位置 P第37页/共97页目目 录录第二节以以PCR为基础的相关技术为基础的相关技术第38页/共97页目目 录录（一）逆转录PCR技术（二）巢式（三）定量PCR技术（）（四）多重PCR技术（五）PCR诱导定点突变（六）原位PCR技术（七）差异显示PCR技术（X）免疫PCR技术现在位置现在位置 P174以以PCR为基础的相关技术为基础的相关技术第39页/共97页目目 录录（一）、逆转（一）、逆转录录PC

22、RPCRn逆转录逆转录PCRPCR（reverse transcription PCR,reverse transcription PCR,RT-PCRRT-PCR）是）是以细胞内以细胞内总总RNARNA或或mRNAmRNA为材料进行体外扩增的技术。为材料进行体外扩增的技术。n由于耐热的由于耐热的DNADNA聚合酶不能以聚合酶不能以RNARNA或或mRNAmRNA作为模板，因此作为模板，因此首先必须将总首先必须将总RNARNA或或mRNAmRNA作逆转录，以生成与之互补的作逆转录，以生成与之互补的cDNAcDNA，然后，然后再以再以cDNAcDNA作为模板进行作为模板进行PCRPCR扩增扩增，

23、得到所需的，得到所需的目的基因片段。目的基因片段。nRT-PCRRT-PCR主要用于主要用于克隆克隆cDNAcDNA、合成合成cDNAcDNA探针探针、检测检测RNARNA病毒病毒和分析基因表达和分析基因表达等。等。现在位置现在位置 174第40页/共97页目目 录录（二）、巢式（二）、巢式PCRPCRn巢式巢式PCRPCR（nested PCRnested PCR）是对靶基因进行）是对靶基因进行二次扩二次扩增增。n二次扩增所用的引物不能相同，第二次扩增所用二次扩增所用的引物不能相同，第二次扩增所用的引物必须位于第一次扩增所用引物的的引物必须位于第一次扩增所用引物的内侧内侧n先用第一对引物扩增

24、出一个较大的片段，再用第先用第一对引物扩增出一个较大的片段，再用第二对引物进行第二次扩增二对引物进行第二次扩增n第二次扩增的模板是第一次扩增的产物第二次扩增的模板是第一次扩增的产物现在位置现在位置 174第41页/共97页目目 录录（二）、巢式（二）、巢式PCRPCR现在位置现在位置 174引物1引物2nest要扩增的目标基因第42页/共97页目目 录录（三）、定量（三）、定量PCRPCRn相对定量相对定量PCRPCRn定量定量PCRPCR（实时荧光（实时荧光PCRPCR）现在位置现在位置 175第43页/共97页目目 录录（四）多重PCR技术 多重多重PCRPCR（multiplex PCR

25、multiplex PCR）即在）即在同一反应同一反应体系体系中加入中加入多对引物多对引物，以，以同时扩增一份同时扩增一份DNADNA样品中多个不同序列的靶片段样品中多个不同序列的靶片段。现在位置现在位置 P179第44页/共97页目目 录录（四）多重PCR技术n多重多重PCRPCR必须满足的两个条件：必须满足的两个条件：nPCRPCR反应条件适合所有被扩增的反应条件适合所有被扩增的DNADNA片段片段n同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测时能通过电泳将各片段充分分离时能通过电泳将各片段充分分离现在位置现在位置 P179第45页/共97页目目 录

26、录（四）多重PCR技术现在位置现在位置 P179第46页/共97页目目 录录（四）多重PCR技术现在位置现在位置 P179第47页/共97页目目 录录（五）PCR诱导定点突变 DNA DNA重组技术使我们能够首先用各种方重组技术使我们能够首先用各种方法对克隆的法对克隆的DNADNA片段进行突变，在对产生片段进行突变，在对产生的突变作的突变作DNADNA序列分析以后，再对突变体序列分析以后，再对突变体的特殊功能作进一步研究。的特殊功能作进一步研究。现在位置现在位置 P180第48页/共97页目目 录录（六）原位PCR技术（in situ PCR）组织固定处理组织固定处理细胞内的细胞内的DNADN

27、A或或RNARNA，并以其作为靶，并以其作为靶序列进行序列进行PCRPCR反应的过程称为原位反应的过程称为原位PCRPCR。原位原位PCRPCR与普通与普通PCRPCR的的主要区别主要区别在于在于模板的制备模板的制备。经脱蜡处理的组织切片或滴加在载玻片上的细胞悬经脱蜡处理的组织切片或滴加在载玻片上的细胞悬液都可作为扩增样品，所有步骤均液都可作为扩增样品，所有步骤均在载玻片上在载玻片上进行。进行。现在位置现在位置 P134第49页/共97页目目 录录（六）原位PCR技术（in situ PCR）进行进行PCRPCR时，加入地高辛标记的的时，加入地高辛标记的的dUTPdUTP，使扩增产物带有地高辛

28、。使扩增产物带有地高辛。PCRPCR结束，加入酶标结束，加入酶标抗地高辛抗体，再加入底物显色。抗地高辛抗体，再加入底物显色。现在位置现在位置 P134第50页/共97页目目 录录（六）原位杂交PCRn 原位杂交原位杂交PCRPCR与与原位原位PCRPCR的唯一区别：的唯一区别：n扩增结束后，用寡核苷酸探针与扩增产物作原位扩增结束后，用寡核苷酸探针与扩增产物作原位杂交。杂交。现在位置现在位置 P134第51页/共97页目目 录录（七）差异显示PCR（defferential display PCR,DD-PCR）现在位置现在位置 P182一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。DD-P

29、CR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。第52页/共97页目目 录录第53页/共97页目目 录录（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）n结合结合PCRPCR技术和抗原抗体反应技术和抗原抗体反应n用于检测抗原（蛋白质）用于检测抗原（蛋白质）n固相载体上包被有抗体固相载体上包被有抗体1 1n抗体抗体2 2上标记有上标记有DNADNA，作为，作为PCRPCR的模板的模板现在位置现在位置 P134第54页/共97页目目 录录（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）n第一步：第一步：n载体抗体载体抗体1-1-抗原抗原-PCRDNA-PCR现在

30、位置现在位置 P134第55页/共97页目目 录录第56页/共97页目目 录录（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）nIPCRIPCR的灵敏度是的灵敏度是ELISAELISA的的100-10000100-10000倍倍现在位置现在位置 P134第57页/共97页目目 录录第三节PCR产物的检测产物的检测Detection of the PCR product第58页/共97页目目 录录第三节第三节 PCR产物的检测产物的检测nPCRPCR完成以后，必须对扩增产物进行检测完成以后，必须对扩增产物进行检测n有效性和正确性有效性和正确性：通过对：通过对PCRPCR产物进行电泳分离，产物进

31、行电泳分离，观察扩增条带的有无、扩增片段的大小等判断观察扩增条带的有无、扩增片段的大小等判断PCRPCR反应的有效性和正确性。反应的有效性和正确性。nPCRPCR产物定量产物定量：（专门章节讲：（专门章节讲）n序列是否正确序列是否正确：测序：测序现在位置现在位置 P185第59页/共97页目目 录录一、一、PCRPCR限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性n是根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点是根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的对内而设计的对PCRPCR产物产物作限制性片段长度多态性分析作限制性片段长度多态性分析的技术。的技术。n若若点突变点突变处于某一处于某一限制

32、性内切酶的酶切位点限制性内切酶的酶切位点内，可内，可在突变点二侧设计引物在突变点二侧设计引物，使，使PCRPCR产物含有该突变序列产物含有该突变序列。n一种一种检测点突变检测点突变的技术，应用十分广泛。的技术，应用十分广泛。现在位置现在位置 P185第60页/共97页目目 录录基因组中某个基因在同种生物的不同个体中，同时和经常存在的两种或两种以上的变异型，以至于用某种限制性核酸内切酶消化基因组的某段序列时，会呈现不同长度的消化片段，形成生物群体的多态性，这种多态性称为限制性核酸内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)第6

33、1页/共97页目目 录录EcoR I5-GAATTC-35-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-35-NNNNNNNG AATTCNNNNNN-3P1P2第62页/共97页目目 录录5-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-35-NNNNG AATTCNNN-35-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3EcoR I5-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3EcoR I+_+_第63页/共97页目目 录录RFLP的优缺点的优缺点RFLP用于检测点突变可以确定点突变的位置第64页/共97页目目 录录二、等位基因特异性寡核苷酸二、等位基因特异性寡核苷酸nAllele specific

34、oligonucleotide,Allele specific oligonucleotide,ASOASO是用是用寡核寡核苷酸探针苷酸探针和和PCRPCR产物产物进行进行杂交杂交以检测以检测点突变点突变的方法。的方法。n被检基因片段经被检基因片段经PCRPCR扩增并经电泳分离后转移到膜扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经上，分别与经标记标记的含有的含有正常序列和突变序列正常序列和突变序列的的寡寡核苷酸探针核苷酸探针杂交。杂交。nPCRPCR产物仅与产物仅与完全互补完全互补的探针杂交的探针杂交现在位置现在位置 P185第65页/共97页目目 录录野生型基因DNA突变型基因DNA野生型基因DN

35、A探针突变型基因DNA探针第66页/共97页目目 录录野生型基因DNA探针突变型基因DNA探针结论：不存在点突变第67页/共97页目目 录录野生型基因DNA探针突变型基因DNA探针结论：存在点突变第68页/共97页目目 录录DNA片段在琼脂片段在琼脂糖凝胶上电泳分糖凝胶上电泳分离离膜上固定膜上固定DNA片段片段在缓冲液中将在缓冲液中将标记的探针加标记的探针加到膜上到膜上DNA片段从琼脂片段从琼脂糖凝胶上转印到糖凝胶上转印到膜上膜上杂交信号的杂交信号的检测检测第69页/共97页目目 录录ASO的优缺点的优缺点n用于检测用于检测点突变点突变n由于探针的序列是已知的，可以确定由于探针的序列是已知的，

36、可以确定点突变点突变的位置的位置n缺点是缺点是成本相对较高成本相对较高，检测一个点突变即需，检测一个点突变即需要要一对引物一对引物和和一对寡核苷酸探针一对寡核苷酸探针现在位置现在位置 P185第70页/共97页目目 录录三、单链构象多态性三、单链构象多态性n单链构象多态性单链构象多态性（Single strand conformation Single strand conformation polymorphism,polymorphism,SSCPSSCP）当）当DNADNA分子以单链存在时，能分子以单链存在时，能在空间内自发地形成二级结构，这种二级结构的空在空间内自发地形成二级结构，这种

37、二级结构的空间构象取决于间构象取决于DNADNA分子本身的的碱基构成，即使一个分子本身的的碱基构成，即使一个碱基的差别也会形成不同的二级结构。碱基的差别也会形成不同的二级结构。nSSCPSSCP用于检测用于检测点突变点突变n缺点：不能确定突变的位置缺点：不能确定突变的位置现在位置现在位置 P186第71页/共97页目目 录录三、单链构象多态性三、单链构象多态性n突变突变DNADNA的的PCRPCR产物经产物经变性变性后产生与后产生与正常正常DNADNA空间构象不同的两条单链。在。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中中时，时，不同构象的单链片段不同构象的单链片段具有具有不同的电泳

38、迁移率不同的电泳迁移率，从而能从而能区别正常与突变的区别正常与突变的DNADNA。n只适合于检测只适合于检测200bp200bp以内的以内的DNADNA靶基因片段靶基因片段n实验的关键是控制各种条件以实验的关键是控制各种条件以避免在操作过程中避免在操作过程中DANDAN单链分子复性为双链单链分子复性为双链。现在位置现在位置 P186第72页/共97页目目 录录四、变性梯度凝胶电泳四、变性梯度凝胶电泳现在位置现在位置 P186n DNA DNA分子的物理特性之一是当分子的物理特性之一是当DNADNA分子被加热分子被加热至其融点温度时双链被打开。至其融点温度时双链被打开。n融点温度取决于融点温度取

39、决于DNADNA分子本身的序列分子本身的序列，不同序，不同序列的列的DNADNA分子具有不同的融点温度。分子具有不同的融点温度。第73页/共97页目目 录录n变性梯度凝胶电泳技术正是利用了变性梯度凝胶电泳技术正是利用了DNADNA分子的这一特分子的这一特性。性。n在设计引物时使在设计引物时使被扩增目的片段的二端被扩增目的片段的二端含有含有不同的不同的TmTm值值，一端较高，另一端相对较低。，一端较高，另一端相对较低。n将这一将这一PCRPCR产物产物在由在由变性剂形成梯度变性剂形成梯度的聚丙烯酰胺凝的聚丙烯酰胺凝胶上胶上电泳电泳，当其泳动至相应位置时，当其泳动至相应位置时，片段于片段于TmTm

40、值较值较低一端的双链被部分解链低一端的双链被部分解链，如此形成的构象至使该，如此形成的构象至使该片段的片段的电泳迁移率大大降低电泳迁移率大大降低。现在位置现在位置 P186第74页/共97页目目 录录变性剂浓度由低到高Tm值低Tm值高第75页/共97页目目 录录变性梯度凝胶电泳的优缺点变性梯度凝胶电泳的优缺点n变性梯度凝胶电泳技术用于检测变性梯度凝胶电泳技术用于检测点突变点突变n缺点：不能确定突变的位置缺点：不能确定突变的位置现在位置现在位置 P186第76页/共97页目目 录录nTmTm值的大小取决于值的大小取决于DNADNA分子的长度和其序列分子的长度和其序列中的中的G/CG/C含量含量n

41、双链双链DNADNA可以结合荧光染料（可以结合荧光染料（SYBR Green SYBR Green I I）nDNADNA复性时，荧光最强，随温度上升，荧光复性时，荧光最强，随温度上升，荧光变弱，形成融点曲线。变弱，形成融点曲线。n正常序列和突变序列因不同正常序列和突变序列因不同TmTm而产生不同的而产生不同的融点曲线。融点曲线。n 五、融点曲线分析五、融点曲线分析现在位置现在位置 P137第77页/共97页目目 录录温度荧光强度第78页/共97页目目 录录温度荧光强度第79页/共97页目目 录录n优点：优点：nPCRPCR产物不需要纯化，可以直接分析产物不需要纯化，可以直接分析n可以进行大批

42、量样本分析，成本低可以进行大批量样本分析，成本低n结果重复性可达结果重复性可达100%100%n 缺点：缺点：n不能确定突变的位置不能确定突变的位置五、融点曲线分析五、融点曲线分析现在位置现在位置 P137第80页/共97页目目 录录nPCRPCR产物的序列分析主要用于产物的序列分析主要用于n分子克隆分子克隆时对于时对于目的基因扩增片段的序列目的基因扩增片段的序列鉴定鉴定n对对致病基因检测致病基因检测时分析扩增片段中时分析扩增片段中点突变点突变的位置和性质的位置和性质。六六、PCRPCR产物产物的序列分析的序列分析现在位置现在位置 P137第81页/共97页目目 录录DNA自动测序自动测序采采

43、用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧光信号，并依此确定荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。第82页/共97页目目 录录DNA自动测序结果举例目

44、目 录录第83页/共97页目目 录录PCR产物序列分析的优缺点产物序列分析的优缺点优点：优点：n可以确定点突变的位置和性质可以确定点突变的位置和性质缺点：缺点：n成本贵成本贵第84页/共97页目目 录录PCR产物分析方法的比较产物分析方法的比较用于突变位置突变性质RFLP点突变能确定不能确定ASO点突变能确定能确定SSCP点突变不能确定不能确定DGGE点突变不能确定不能确定融点曲线点突变不能确定不能确定测序点突变能确定能确定第85页/共97页目目 录录拓展：拓展：PCRPCR技术技术在分子诊断中的应用在分子诊断中的应用 分子诊断分子诊断的定义就是用分子生物学技术通的定义就是用分子生物学技术通过

45、检测被检测基因的存在与否、结构变化或过检测被检测基因的存在与否、结构变化或表达异常，确定受检者有无基因水平的变化，表达异常，确定受检者有无基因水平的变化，并以此作为确认疾病的依据。分子诊断不仅并以此作为确认疾病的依据。分子诊断不仅能在疾病早期对患者作出确切的诊断，也能能在疾病早期对患者作出确切的诊断，也能判别致病基因的携带者，确定个体对疾病的判别致病基因的携带者，确定个体对疾病的易感性并对疾病的分期、分型、疗效监测和易感性并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断。因此，分子诊断已成为检验预后作出判断。因此，分子诊断已成为检验医学的一个重要组成部分。医学的一个重要组成部分。现在位置现在位置第

46、86页/共97页目目 录录目前分子诊断最常见的应用：(1)鉴定位于众多正常细胞背景下的少量癌细 胞；(2)鉴定具有发病风险的个体，以便及时采取 有效的预防措施；(3)确定对特定治疗可能敏感的患者，避免不 必要的治疗干预；(4)选择复发风险高、能从初期治疗中受益的 患者；(5)鉴定对治疗有产生严重毒性反应风险的患者。第87页/共97页目目 录录两个对照组两个对照组1、阴性对照、阴性对照 水水2、阳性对照、阳性对照 第88页/共97页目目 录录诊断策略诊断策略 1、直接诊断策略、直接诊断策略 直接诊断就是用分子生物技术检测基因的直接诊断就是用分子生物技术检测基因的缺失、重组或是点突变等遗传缺陷。进

47、行直缺失、重组或是点突变等遗传缺陷。进行直接诊断的前提必须了解被检基因的正常结构接诊断的前提必须了解被检基因的正常结构和序列。和序列。2、间接诊断策略、间接诊断策略 间接诊断实际上就是对家系进行连锁分析，间接诊断实际上就是对家系进行连锁分析，以确定被检个体的同源染色体中哪一条与致以确定被检个体的同源染色体中哪一条与致病基因连锁，从而判断被检个体患病的可能病基因连锁，从而判断被检个体患病的可能性。性。第89页/共97页目目 录录间接诊断策略的遗传标记间接诊断策略的遗传标记（1 1）限制性片段长度多态性）限制性片段长度多态性 （2 2）可变数目串联重复（）可变数目串联重复（variable tan

48、dem variable tandem repeat,VNTRrepeat,VNTR）和短串联重复（）和短串联重复（short short tandem repeat,STRtandem repeat,STR）（3 3）单核苷酸多态性（）单核苷酸多态性（single nucleotide single nucleotide polymorphism,SNPpolymorphism,SNP）：）：第90页/共97页目目 录录（1 1）限制性片段长度多态性）限制性片段长度多态性 （PCR-RFLP)PCR-RFLP)儿童型脊髓性肌萎缩症 (spinal muscularatrophy，SMA)是一

49、种常见的神经系统常染色体隐性遗传病，SMN基因为其主要致病基因，约986 的患者有SMN基因第7、第8外显子或单纯第7外显子的纯合缺失或突变。第91页/共97页目目 录录检验流程检验流程外周静脉血提取DNA设计引物PCR扩增PCR扩增产物酶切电泳检测第92页/共97页 PCRRFLP技术简单易行，只要对常发生基因缺失的第7、第8外显子设计引物进行PCR扩增、酶切即可。它是通过琼脂糖凝胶电泳后判断有无特异性酶切条带来做出诊断，因而有特异性较高，重复性好，快速，经济，需模板量少等优点。对I、型SMA患者而言，其第7、第8外显子的缺失诊断率分别达100 和917，因而可以避免因创伤性检查肌活检所带来的痛苦，对其家系的遗传咨询及产前诊断都具有重要意义。第93页/共97页目目 录录2 2）可变数目串联重复和短串联重）可变数目串联重复和短串联重复（复（STRSTR）亲子鉴定亲子鉴定第94页/共97页目目 录录第95页/共97页目目 录录作业作业1.运用分子检验技术如何确诊被检者是否运用分子检验技术如何确诊被检者是否患病，其检验流程如何？图示之患病，其检验流程如何？图示之2.PCR引物的设计原则是什么？如何设计引物的设计原则是什么？如何设计引物？引物？第96页/共97页目目 录录感谢您的观看。感谢您的观看。第97页/共97页