急性毒性试验设计精.ppt

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1、急性毒性试验设计第1页，本讲稿共36页一、急性毒性一、急性毒性 急急性性毒毒性性指指人人或或动动物物一一次次或或24 h之之内内多多次次接接触触外外源源化化学学物物后后，在在短短期期内内所所发生的毒性效应，包括致死效应。发生的毒性效应，包括致死效应。第2页，本讲稿共36页一一次次：指指瞬瞬间间给给实实验验动动物物染染毒毒，如如经经口口、经静脉注射染毒。经静脉注射染毒。24 h之之内内多多次次：指指外外源源化化学学物物毒毒性性过过低低，需给予动物较大剂量。需给予动物较大剂量。第3页，本讲稿共36页 急急性性毒毒性性效效应应出出现现的的快快慢慢和和毒毒性性反反应应的的强强度度与与外外源源化化学学物

2、物的的性性质质和和染染毒毒剂剂量量的的大大小小有关。有关。如：丙烯腈，过氧化二碳酸二环己酯如：丙烯腈，过氧化二碳酸二环己酯第4页，本讲稿共36页丙烯腈经口急性毒性试验设计丙烯腈经口急性毒性试验设计第5页，本讲稿共36页实验目的n评评价价丙丙烯烯腈腈的的毒毒性性作作用用，求求出出半半数数致致死死量量LD50，并根据并根据LD50进行急性毒性分级进行急性毒性分级，n掌掌握握实实验验动动物物随随机机分分组组的的方方法法和和经经口口灌灌胃的技术。胃的技术。n观观察察丙丙烯烯腈腈急急性性中中毒毒症症状状；为为后后续续试试验验提供依据；为毒理学机制研究提供线索。提供依据；为毒理学机制研究提供线索。第6页，

3、本讲稿共36页器材与试剂器材与试剂n1、实验动物 ICR小鼠（健康成年小鼠）n2、实验器材 灌胃针、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、电子天平、动物体重秤、外科剪刀、镊子 n3、实验试剂 丙烯腈、苦味酸酒精饱和液、伊红染液第7页，本讲稿共36页实验方法实验方法n1、实验动物的选择n2、剂量设计及随机化分组n3、受试物的配制n4、染毒途径的选择n5、毒性反应的观察与LD50的计算n6、急性毒性的评价第8页，本讲稿共36页 1、物种和品系、物种和品系 对外源化学物毒性反应与人近似易于饲养管理对外源化学物毒性反应与人近似易于饲养管理 方便实验方便实验 操作易于获得操作易于获得 繁殖生育力强繁殖生育力

4、强 数量较大能够保障数量较大能够保障 品系纯化，价格低廉。品系纯化，价格低廉。一、实验动物选择实验动物选择第9页，本讲稿共36页2、实验动物的年龄与体重实验动物的年龄与体重 动动 物物 大鼠大鼠 小鼠小鼠 豚鼠豚鼠 兔兔 犬犬 猫猫成年年龄（周）成年年龄（周）3 2 2 34 34 34 体重（克）体重（克）150 15 250 1.5kg 715kg 1kg寿命（年）寿命（年）23 23 68 49 1520 1012第10页，本讲稿共36页n动物数量动物数量：动物动物6组，组，1-5组为实验组为实验组，组，6组为蒸馏水组为蒸馏水对照组对照组n性别性别：雌雄各半雌雄各半n年龄年龄：成年动物：

5、成年动物n生理与健康状况：生理与健康状况：未产未孕者、健康未产未孕者、健康动物动物n实验动物的预检实验动物的预检n实验动物的给药前实验动物的给药前禁食处理禁食处理。3、实验动物的一般要求、实验动物的一般要求第11页，本讲稿共36页健康动物标志健康动物标志发育正常、体态丰满、外观无畸形；发育正常、体态丰满、外观无畸形；被毛浓密、贴顺有光泽、不蓬乱；被毛浓密、贴顺有光泽、不蓬乱；胸阔宽阔、脊柱不弓不弯；胸阔宽阔、脊柱不弓不弯；眼睛明亮；眼睛明亮；表皮无溃疡、无结痂（注意尾巴）；表皮无溃疡、无结痂（注意尾巴）；各天然孔干净、无分泌物；各天然孔干净、无分泌物；行动灵活、反应敏捷行动灵活、反应敏捷。第1

6、2页，本讲稿共36页实验实验动物的标记动物的标记染色法染色法 编号方法：小鼠头部为编号方法：小鼠头部为1 1号，顺时号，顺时针编号，用苦味酸编个位数，用伊针编号，用苦味酸编个位数，用伊红编十位数红编十位数。第13页，本讲稿共36页第14页，本讲稿共36页染色法染色法优点：优点：简单方便，不痛苦，无损伤。简单方便，不痛苦，无损伤。缺点：缺点：时间较长时，染色剂易褪色；时间较长时，染色剂易褪色；标记容易模糊不清。标记容易模糊不清。第15页，本讲稿共36页 剂量选择及分组n剂量选择剂量选择 广泛查阅文献资料，估计毒性中值广泛查阅文献资料，估计毒性中值预试，求出待测化学物预试，求出待测化学物0%100

7、%或或 10%90%的大致致死剂量范围的大致致死剂量范围设计正式试验的剂量和分组设计正式试验的剂量和分组 第16页，本讲稿共36页预实验：预实验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（确定受试动物全部致死的最小剂量（b）和全部不致死的最大剂量（和全部不致死的最大剂量（a），即求出），即求出待测化学物待测化学物0%100%的大致致死剂量的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计的间距设计57个剂量组，组间剂

8、量呈等个剂量组，组间剂量呈等比级数（比级数（r），其比值为），其比值为1.21.5。进行正。进行正式实验。式实验。第17页，本讲稿共36页通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。按下式设计剂量组：按下式设计剂量组：式中：式中：rr相邻两组剂量的比值，一般为相邻两组剂量的比值，一般为1.21.21.51.5，bb最低全致死剂量量，最低全致死剂量量，aa最高不致死剂量，最高不致死剂量，nn设计的组数。设计的组数。分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为分组

9、恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出LD50。第18页，本讲稿共36页根据公比根据公比(r)计算各组剂量计算各组剂量各组剂量分别为各组剂量分别为 第一组：第一组：a 第二组：第二组：a r 第三组：第三组：a r2 第四组：第四组：a r3 第五组：第五组：a r4 第六组：第六组：a r5 第19页，本讲稿共36页随机化分组随机化分组 将实验动物编号，从随机数字表上任意横将实验动物编号，

10、从随机数字表上任意横行或纵行的任意数字开始，顺序取下数字，行或纵行的任意数字开始，顺序取下数字，标于每个动物号下，然后用计划组数去除标于每个动物号下，然后用计划组数去除随机数字，所得余数即为所属组别。随机数字，所得余数即为所属组别。第20页，本讲稿共36页以20只动物的完全随机分配为例只动物的完全随机分配为例动物编号动物编号1234567891011121314151617181920随即数字随即数字5483805390755378934772095466954468676786除除4后余数后余数23012312130122300332所属组别所属组别二二三三四四一一二二三三一一二二 一一三三

11、四四一一二二二二三三四四四四三三三三二二第21页，本讲稿共36页完全随机分配后各组所属动物号完全随机分配后各组所属动物号 组别组别动物编号动物编号一一47912二二1581320 14三三26101518 19四四3111617第22页，本讲稿共36页20只动物完全随机分配的结果 组别组别动物编号动物编号一一4791219 二二1581314 三三2 6101518 四四311161720第23页，本讲稿共36页受试物的配制方法受试物的配制方法（1）受试化学物的量取）受试化学物的量取：n固体受试物用称量法，液体受试物用称量法或吸量法。固体受试物用称量法，液体受试物用称量法或吸量法。n称量法称量

12、法：取一定量的受试物放入已知重量的容器内，称重，定容，取一定量的受试物放入已知重量的容器内，称重，定容，计算浓度计算浓度mg/ml，备用。，备用。n吸量法吸量法：依设计剂量计算出应吸取液态受试物的容积，加入容量依设计剂量计算出应吸取液态受试物的容积，加入容量瓶中，用溶剂加至刻度。瓶中，用溶剂加至刻度。第24页，本讲稿共36页吸量法吸量法，计算公式为：X式中：X应吸取受试物的容积；A设计要求的受试物浓度（mg/ml）；V容量瓶容积（ml）；d受试化学物比重；A Vd1000第25页，本讲稿共36页受试物的配制方法（2）受试化学物的稀释）受试化学物的稀释n等浓度稀释法：n等容量稀释法：第26页，本

13、讲稿共36页等浓度稀释法等浓度稀释法 将受试物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位将受试物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。比如某受试物的越大；剂量越低，所用的体积越小。比如某受试物的试验剂量分别为试验剂量分别为100、200、400和和800mg/kg，受，受试物配制成试物配制成10 mg/ml，每组动物每，每组动物每10g体重分别给体重分别给与与0.1、0.2、0.4和和0.8 ml。第27页，本讲稿共36页等容量稀释法等容量稀释法 将受试物配制成不同浓度，不同

14、剂量组实验动物单位体将受试物配制成不同浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制重所给受试物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。上例中，若实验动物按的浓度越高。上例中，若实验动物按0.2ml/10g b.w容容量灌胃量灌胃,则应配制成则应配制成4个不同浓度个不同浓度,即即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和和40mg/ml。第28页，本讲稿共36页染毒途径的选择染毒途径的选择n经消化道染毒：经口灌胃法经消化道染毒：经口灌胃法 采用专用小鼠灌胃针。采用专用小鼠灌胃针。左手抓住动物双耳后至背部的皮肤，将动物固定成垂直体位，左手抓住动物双耳后

15、至背部的皮肤，将动物固定成垂直体位，腹部面向操作。腹部面向操作。右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避牙齿，沿咽右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感后壁缓缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即深人至胃部。觉阻力消失，即深人至胃部。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免穿破食，甚至误入气管，导致动物以免穿破食，甚至误入气管，导致动物 立即死亡。立即死亡。第29页，本讲稿共36页观察指标观察指标n中毒症状：确定靶器官中毒症状：确定靶

16、器官 行动：不安定、多动、发声；行动：不安定、多动、发声；神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常；异常；自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流泪、排尿、自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸。下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸。n死亡和死亡时间死亡和死亡时间 n病理学检查及其他指标病理学检查及其他指标 第30页，本讲稿共36页LD50的计算（改良寇氏法）的计算（改良寇氏法）n当急性毒性试验的最大剂量死亡率为当急性毒性试验的最大剂量死亡率为100%，最小剂量的死亡，最小剂量的死亡率为率为0%；各组动物数相等；各剂量

17、组的组距等比或剂量对数；各组动物数相等；各剂量组的组距等比或剂量对数等差时，用下述基本公式计算等差时，用下述基本公式计算LD50：第31页，本讲稿共36页当不含当不含0%和和100%死亡率时，用下式计算死亡率时，用下式计算LD50：Xm最大剂量对数最大剂量对数P各剂量组死亡率各剂量组死亡率Pm最高死亡率最高死亡率q各组剂量存活率，各组剂量存活率，q=1-p以上各式中：以上各式中：i组距，即相邻两组剂量对数剂量之差组距，即相邻两组剂量对数剂量之差Pn最低死亡率最低死亡率p各剂量组死亡率之和各剂量组死亡率之和n各组动物数各组动物数第32页，本讲稿共36页LD50的局限性的局限性n消耗动物量大消耗动

18、物量大n获得的信息有限获得的信息有限n动物死亡和观察的症状不足以反应生理学、动物死亡和观察的症状不足以反应生理学、血液学和其它化验检查所提供的毒性信息血液学和其它化验检查所提供的毒性信息n有许多因素影响有许多因素影响LD50值的测定，实际上测得值的测定，实际上测得的的LD50是近似值是近似值 第33页，本讲稿共36页n急性毒性试验不等于急性毒性试验不等于LD50测定测定n可用少量动物测定可用少量动物测定ALD，并进行临床观察、，并进行临床观察、化验检查和病理学检查化验检查和病理学检查n当口服剂量大于当口服剂量大于5g/kg或注射剂量大于或注射剂量大于2g/kg时，不产生急性毒性或死亡，则不必准确时，不产生急性毒性或死亡，则不必准确的测定的测定LD50注意注意第34页，本讲稿共36页急性毒性评价 外源化学物相对毒性分级标准外源化学物相对毒性分级标准 第35页，本讲稿共36页急性毒性分级（急性毒性分级（WHO）第36页，本讲稿共36页