2023年实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告.docx

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1、实验名称碱性磷酸酹的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2023年1 0月25号 实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师署名批改日期碱性磷酸酶(AKP或ALP)是一种底物特异性较低,在碱性条件下能水解多重磷酸单脂 化合物的酶，需要镁和钵离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸 基团转移到另一个具有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AK P最适PH范围为8.610,动物中AKP重要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等 组织的细胞膜上。血清AKP重要来自肝，小部分来自骨骼。AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得:将碱性磷酸酶基因

2、克隆到 重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、 色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才干得到高纯度的 酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋 白变性，过滤除去杂蛋白即为具有A KP的滤液,AKP能溶于终浓度为3 3 %的丙酮或30%的 乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或6 0 %的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AK Po2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定,酶的

3、比活性用每亳克蛋白质具有的酶活性来表达，单位 (U/mgpr)来表达。因此，测定样品的比活性必须测定：a每亳升样品中的蛋白质亳克数； b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二 钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比 作用，经铁氟化钾氧化，生成红色的醍衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于5 10nm处比 色,即可求出反映过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为:在37摄氏度保温 1 5 min每产生1 mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Fol i n-酚法测定。3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的

4、影响在环境的温度、PH和酶的浓度一定期，酶促反映速度与底物浓度之间的关系表现为反 映开始时。酶促反映的速度（V）随底物浓度（S）的增长而迅速增长。若继续增长底物浓度, 反映速度的增长率将减少。当底物浓度增长到某种限度时，反映速度就会达成一个极限值，即 最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反映速度的这种关系可用米氏方程式表达:VM-x SV= Km + S式中:Vma x为最大反映速度：S为底物浓度；Km为米氏常数;V代表反映的起始速度。当v=Vmax/2时，Km = So因此，Km等于酶促反映速度达最大值一半时的 底物浓度。Km是陶的最重要的特性性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要

5、的方法,大多数 酶的 Km 值在 0.01- 1 00mmo 1 /L。Km和Vma x的测定:重要采用Lin e weave r - Bur k双倒数作图法。此式为直线 方程，以不同的底物浓度1 / S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵 轴方向延长,此线与横轴相交的负截距为-l/Km,由此可以对的球的该酶的Km值。方程式与图如下:本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性,再根据Li n e weaver-Bu r k法 作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸能催化水解，生成游离 酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁锐化钾氧化，生成红

6、色 的醍衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值得大小可以计算出能的活性, 也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。二、实验材料（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定1、样品兔肝2、试剂0. 5mol/L乙酸镁溶液0.1 mol/L乙酸钠溶液0. 0 Imol/ L乙酸镁一0.01mol/L乙酸钠溶液 O.OlmoI/L 丁一一0.01101人乙酸镁18.8缓冲液丙酮（分析纯）95%乙静（分析纯）正丁醇（分析纯） 0.0 4 mol/L底物液分标准液 0. 5mol/LNaOH0.3% 4 -氨基安替比林0. 5%铁鼠化钾0 .Img/mL蛋白标准液碱性铜试剂酚试剂3、仪器与

7、器材研钵刻度离心管刻度吸管电动离心机玻璃漏斗和玻璃棒托盘天平恒温水浴可见分光光度计(二)底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、样品兔肝匀浆液2、试剂0. 0 4moi/L底物液0. 1 mol/L碳酸盐缓冲液PH10 (37C)碱性溶液0. 5%铁化钾0.3% 4-氨基安替比林酚标准液（0.1m g / ml）3、仪器与器材恒温水浴锅可见光分光光度计三、实验环节（一）AKP的提取AKP提取实验环节环节操作（1）匀浆2 g新鲜兔肝剪碎，加入0.0 1 mol/ L乙酸镁一0. 0 lin o 1/L乙酸钠溶液6.0ml, 研磨成匀浆。匀浆倒入刻度离心管中,记录其体积，此为A液吸取A液0. 1ml于另

8、一试管中JjPH8.8Tris缓冲液4.9ml稀释，此为稀释A 液（1 :50）,供此比活性用（2）除杂蛋白在A液中加入正丁醇2.0m 1 ,用玻璃棒充足搅拌2min,室温放置20min,用滤 纸过滤（3）丙酮沉淀AKP漉液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀离心（2023r/min）5min(4)AKP溶解沉淀加入0.5m。1/L乙酸镁4.0ml,用玻璃棒充足搅拌使其溶解，记录其体积，此 为B液。取B液0.1ml于另一试管中，加入PH8. 8Tris缓冲液4. 9 ml,此为稀 释B液（1： 5 0）,供动力实验用（二）AKP的比活性测定1、A KP的活性测定AKP活性测定实验环节

9、环节(1)加缓冲液取试管3支，按表操作试剂(ml)测定管标准管空白管PH8.8Tris 缓冲液 -1.00.04mol / L 底物 1.0I. 01 . 0液(2)温浴370c水浴预温5min(3)加酶和底物0 . 1 m o 1 /ni 1-,1.0-准酚应用液待测1.0-一一-液(4)酶促反映3 7c准保证温15min(5)加显色液0.5 m ol/LNaOH1.01.01.00 .3% 4-氨基安1.01.01.0替比林0.5 % 铁氨化钾2.02.02.0(6)显色反映混匀,室温放置1 Omi n(7)测吸光度51 Onm处测吸光度2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定实验环节环节操作(1

10、)反映体系设 工.取3支试管，按表操作试剂测定管标准管空白管PH8.8Tris 缓冲-1. 0液 待测酶液1.0一蛋白标准液(0.1m-1. 0-g / m 1 )碱式铜试剂5.05.05.0(2)反映混匀后室温放置lOmin(3)加酚试剂酚试齐IJ 0. 5 ml(4)显色反映混匀后室温放置30min(5 )比色反映在510nm处比色(三)底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、底物浓度对酶促反映速度的影响将新鲜兔肝用PHI 0.00. 1 mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可酶曲线绘制环节环节操作(1)反映体系设立取6支试管标号，按表操作试剂（ml）1234560.0 1mol/l 底物

11、0.010.2 00.3 00.501.00液PH 1 00 .10. 07 0.7 00.700.7 00.700.70mol / L碳酸盐 缓冲液 蒸饰水1.101.0 00.900. 7 0 0.201 .20(2)保温37c水浴中保温5m i n(3)加酹各管分别加入兔肝稀释匀浆液0.10ml(4)酶促反映混匀，立即记录时间，将各管准保证温1 5 min(5 )终止反映各管分别加入碱性溶液1(6)加显色剂各管分别加入0. 3%4一氨基安替比林1 . 0ml各管分别加入0. 5 %铁新化钾2 . 0ml(7)显色充足混匀，放置15m i n(8)比色测定以6号空白管作对照，于510 nm

12、波长处比色测定(9)反映速度计算根据酚标准曲线计算出每样品酚的含量,算出反映速度(10)曲线绘制以各管底物浓度的倒数(1/US)为横坐标，以各管反映速度的倒数(1 /V) 为纵坐标，作图求出Km值2、酚标准曲线的绘制的绘制酚标准曲线的绘制的绘制环节环节操作(1)反映体系设立取洁净干燥试管6支,依次加入试剂试剂（ml）1234560.1 mol/ m 1 酚 -一一 0.0 50.100.200.3 00. 40标准溶液蒸储水2.01.951. 91.801. 701.600(2)预加热3 7 C水浴中保温5 min(3)加显色剂碱性溶液1.01.01.01 .01.01. 00.3% 4 氨基

13、1.01.01. 01. 01 . 01. 0安替比林0.5% 铁轨化钾2.02.02.02.02.02.0(4)显色反映混匀后，室温放置1 5m i n(5)比色测定510nm波长处比色（6 ）曲线绘制|以酚含量（微克）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制酚标准曲线注意事项（一）碱性磷酸前的分解纯化和比活性测定1、在纯化过程中，各步加入的有机试剂要计算精确。2、加入有机试剂混匀后应立即离心，不宜放置过久。3、在测定酹活性时，每加入一种试剂须立即混匀，避免浑浊。（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、血清取量要准确。2、标准曲线必须是过原点的一条直线。3、在酶促反映中，每管加入后立即计时，保证各管反映时间一致。