《生化实验》PPT课件.ppt

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1、2012生化实验生化实验实验安排1第一天第一天粗胰酶提取、卵清蛋白提取粗胰酶提取、卵清蛋白提取第二天第二天粗胰酶提取卵清蛋白提取粗胰酶提取卵清蛋白提取第三第三-四天四天PPO提取、纯化PPO活性、蛋白浓度活性、蛋白浓度测定测定第五第五-七天七天亲和层析柱材制备、染色体、质粒亲和层析柱材制备、染色体、质粒DNA提取提取酶切、亲和层析酶切、亲和层析酶切、感受态细胞制备酶切、感受态细胞制备连接、感受态细胞制备连接、感受态细胞制备连接、亲和层析连接、亲和层析转化、转化、SDS-PAGE、电转、电转Western胰酶提取 第一天第一天新鲜猪胰脏新鲜猪胰脏1 1个个 冰浴下剥除脂肪和结缔组织冰浴下剥除脂肪

2、和结缔组织粉碎胰脏粉碎胰脏 加加100ml100ml巳预冷却的巳预冷却的乙酸酸化水溶液提取乙酸酸化水溶液提取 检查提取液中检查提取液中PHPH，若高于若高于pH3.0pH3.0时应及时用时应及时用1010乙酸调节，使提取液维持在乙酸调节，使提取液维持在之间之间 在冷室在冷室5 5左右搅拌提取左右搅拌提取181824h24h 第第2天天4层纱布过滤，取滤液层纱布过滤，取滤液50m1pH2.5乙酸酸化水抽提残渣一次乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为时间约为1一一2h)合并滤液，用乙酸溶液调正合并滤液，用乙酸溶液调正pH至至 放置放置35h后，取上清，量其总体积后，取上清，量其总体积盐析：加固体粉状硫

3、酸铵，至盐析：加固体粉状硫酸铵，至4040饱和度饱和度 盐析盐析1hr1hr 12 12000rpm 000rpm 离心离心 10min 10min 上清液加硫酸铵，至上清液加硫酸铵，至7575饱和度饱和度 盐析盐析1hr1hr 12 12000rpm 000rpm 离心离心 10min 10min 沉淀沉淀 溶于溶于10ml 10ml pH7.5,0.1 MTris 透析过夜，透析过夜，4 4 保存保存卵清蛋白分离提取卵清蛋白分离提取v第一天第一天v新鲜鸡蛋两只新鲜鸡蛋两只v取蛋清取蛋清50 ml50 mlv温水浴温水浴25253030v加入等体积的三加入等体积的三氯乙酸丙酮氯乙酸丙酮（1:

4、2V/V1:2V/V）v最终最终pHpH约约3.53.5v再继续搅拌再继续搅拌30 30 minminv4 4放置过夜放置过夜 第二天第二天布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿色清液布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿色清液加入加入44预冷的丙酮预冷的丙酮200 ml200 ml在在44放置放置2 h2 h之后，之后，弃上部丙酮液，下部沉淀部分于弃上部丙酮液，下部沉淀部分于10000 rpm10000 rpm离心离心5 min5 min收集沉淀收集沉淀沉淀溶于沉淀溶于10 ml10 ml无离子水中，对无离子水（无离子水中，对无离子水（5050倍）透析倍）透析4 h4 h，换水两次，换水两次再对碳酸钠缓冲溶

5、液透析过夜再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜第三天第三天10000 rpm10000 rpm离心离心10 min,10 min,取上取上清液清液再对碳酸钠缓冲溶液透析过再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜夜第三天第三天10000 rpm10000 rpm离心离心10 min,10 min,取上取上清液清液亲和层析柱材制备亲和层析柱材制备Sephadex-G75Sephadex-G75的活化及偶联的活化及偶联 2.5g 2.5g干重的葡聚糖凝胶干重的葡聚糖凝胶Sephadex GSephadex G一一7575，溶胀洗涤数次，溶胀洗涤数次 加入加入0.05M Nal040.05M Nal04溶液溶液50ml50m

6、l，30Min30Min，蒸馏水洗涤数次，抽干备用蒸馏水洗涤数次，抽干备用 纯化的鸡卵粘蛋白纯化的鸡卵粘蛋白35ml35ml，加入活化葡聚糖凝胶，加入活化葡聚糖凝胶 5 5K2C03K2C03、调、调pH7.59.0pH7.59.0，缓慢搅拌，缓慢搅拌3h3h，随时用随时用5 5K2CO3K2CO3保持保持pHpH的稳定的稳定 0.27gKBH40.27gKBH4溶溶于于20ml20ml水水，缓缓慢慢搅搅拌拌加加入入上上述述体体系系，反反应应5h5h，pHpH维持在维持在6.57.56.57.5 洗涤洗涤基因组基因组DNA提取提取高高温温裂裂解解（抑抑制制DNase，促促 进进 其其它它分分子

7、子变变性性，促促溶溶）；试试 剂剂：NaCl,SDS,EDTA,Tris-HCl pH7.5；试试验验材材料料：微微生生物菌体；物菌体；检测：检测：电电 泳泳 0.50.6ARGAROSE；比比 色色 50ug/ml DNA;OD260/OD280=1.8，40 ug/ml RNA;OD260/OD2801.8培养好的菌液培养好的菌液1.5 mL，离心收集菌体离心收集菌体600ul 65 预热的预热的细胞裂解液，悬浮菌细胞裂解液，悬浮菌体体加入加入60ul 酚滚动混酚滚动混匀，匀，65，30min加入加入600ul氯仿混氯仿混匀，静置匀，静置45min，离心离心取上清取上清等体积氯仿抽提一次等

8、体积氯仿抽提一次0.1V 3M NaAc（Ph5.2）、）、2V乙醇，乙醇，7020 min沉淀沉淀DNA70酒精洗涤沉淀酒精洗涤沉淀DNA，真空，真空干燥干燥沉淀溶于沉淀溶于40-100L无菌水无菌水质粒DNA提取细菌质粒的提取细菌质粒的提取细菌培养物的生长：细菌培养物的生长：选择压力选择压力LB培养基中培养基中生长到对数晚期生长到对数晚期细菌的收获和裂解：细菌的收获和裂解：碱变性抽提的原理是碱变性抽提的原理是利用染色体利用染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的差的变性与复性的差异而达到分离的目的。异而达到分离的目的。pH高达高达12.6的碱性的碱性条件下染色体条件下染色体DNA氢键氢

9、键断裂，双螺旋结构解开断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒而变性。质粒DNA的大的大部分氢键也断裂，但超部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分的两条互补链不完全分离离 pH4.8的的AC高盐缓冲液复高盐缓冲液复性，变性的质粒性，变性的质粒DNA又恢复又恢复到原来的构型。而染色体到原来的构型。而染色体DNA不能复性而形成缠连的不能复性而形成缠连的网状结构。网状结构。试剂试剂：Solution 50mM Solution 50mM 葡萄糖葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0)25mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM EDTA(pH 8.0

10、),10mM EDTA(pH 8.0),高压灭菌，高压灭菌，4 4保存保存：Solution II 0.2M NaOH,1%SDS,Solution II 0.2M NaOH,1%SDS,现配现用现配现用：Solution III 5M KAC 60ml,11.5Solution III 5M KAC 60ml,11.5冰乙酸，冰乙酸，28.5 28.5水，水，4 4保存保存：3M NaAC pH 5.2 3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，高压灭菌，44保存保存,：氨苄青霉素：氨苄青霉素 50mg/ml,50mg/ml,：溶菌酶：溶菌酶：酚：酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(25/24/1)(

11、25/24/1)：异丙醇：异丙醇 ：LBLB培养基培养基10:TE10:TE缓缓冲液冲液 11:11:电泳试剂电泳试剂含氨卞（含氨卞（100ug/ml100ug/ml）的）的LBLB培养基培养基 培养菌体培养菌体 37 200rpm 37 200rpm 过夜过夜吸取吸取1.5ml,5000rpm,11.5ml,5000rpm,12min2min离心，取沉淀离心，取沉淀预冷的预冷的100ul Solution,100ul Solution,充分振荡悬浮充分振荡悬浮加入加入200ulSolutionII,200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中颠倒徭匀后冰浴中3-5min,3-5min,1

12、50ul150ul预冷预冷Solution IIISolution III混匀混匀,冰浴冰浴5min5min离心离心,12000rpm,5min,12000rpm,5min取上清加等体积氯仿，静置取上清加等体积氯仿，静置2-4min2-4min，12000g 12000g 离心离心2-2-4min4min取上清加取上清加2 2体积的乙醇体积的乙醇,1/10,1/10体积乙酸钠，体积乙酸钠，-80-80,5-10min 12000g,5-10min 12000g 离心离心10min10min取沉淀取沉淀 冷冻干燥冷冻干燥悬于悬于30ldd30ldd水水1.2%Argose1.2%Argose胶电

13、泳鉴定胶电泳鉴定PPO提取、纯化材料材料 马铃薯（大约每小组马铃薯（大约每小组100-200g）试剂：试剂：磷酸缓冲液磷酸缓冲液A（0.03M,pH6.0,含含0.02M巯基乙醇，巯基乙醇，0.001M EDTA，5甘油，甘油，1的聚乙烯吡咯烷酮）的聚乙烯吡咯烷酮）固体硫酸铵固体硫酸铵磷酸缓冲液磷酸缓冲液B(0.03M,pH6.0,含含0.02M巯基乙醇，巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）粗酶提取 土豆按土豆按1:11:1（W/VW/V）比例与磷酸缓冲液匀浆）比例与磷酸缓冲液匀浆2 2层纱布过滤层纱布过滤滤液以滤液以6000rpm6000rpm离心离心10min10m

14、in弃除沉淀获得酶提取液。弃除沉淀获得酶提取液。纯化纯化I-盐析分级沉淀盐析分级沉淀 酶粗提液中加固体硫酸铵到酶粗提液中加固体硫酸铵到4040饱和度饱和度6000rpm6000rpm离心离心20min20min弃除沉淀弃除沉淀上清液再加入固体硫酸铵达到上清液再加入固体硫酸铵达到7070饱和度饱和度6000rpm6000rpm离心离心20min20min，弃除上清液，得粗酶沉淀，弃除上清液，得粗酶沉淀沉淀用沉淀用10ml10ml磷酸缓冲液磷酸缓冲液B B复溶复溶装入透析袋装入透析袋用用0.02M 0.02M KClKCl溶溶液液透透析至无硫酸铵根离子析至无硫酸铵根离子得初步纯化得初步纯化PPOP

15、PO液液纯化纯化II-分子筛凝胶层析分子筛凝胶层析柱材处理柱材处理 Sephadex G100干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀 24-48h，去掉悬浮的细微颗粒，去掉悬浮的细微颗粒 凝胶液脱气体除凝胶液脱气体除平衡平衡0.02M Tris-HCl缓缓冲冲液液pH7.4（内内含含0.001M EDTA）平平衡衡，保持液面比胶面高保持液面比胶面高1-2cm装柱装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加层析架上，加1/3体积的无离体积的无离子水，打开下出液口，水流畅子水，打开下出液口，水流畅通通 将小烧杯中装有适宜浓度的凝将小烧杯中装有适宜

16、浓度的凝胶液倒入层析柱中，凝胶自然胶液倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部慢慢沉降在层析柱底部 凝胶沉积直到离层析柱上端凝胶沉积直到离层析柱上端1.52 cm处，处，保持液面比胶保持液面比胶面高面高1-2cm，停止装柱，剪，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上于凝胶上纯化纯化II-分子筛凝胶层析分子筛凝胶层析样品处理：样品处理：初步纯化初步纯化PPO液留液留1ml，4 保存；余下样品反渗至保存；余下样品反渗至2ml测定测定考考马马斯斯亮亮蓝蓝G G250250法法测测定定蛋蛋白白质质浓度浓度 邻苯二酚测定邻苯二酚测定PPOPPO活性活性将有活性管合并得

17、将有活性管合并得PPOPPO纯化液纯化液IIIIPPOPPO纯纯化化液液IIII留留1/5-1/101/5-1/10体体积积，4 4 保保存存；余余下下样样品品留留待待上上第第二二个柱个柱上柱上柱 打开层析柱下端液体出口打开层析柱下端液体出口关闭下端液面出口关闭下端液面出口 将将2ml左右浓缩左右浓缩PPO初步纯化初步纯化液缓慢加到胶面液缓慢加到胶面层析层析 打开下出液口，打开下出液口，待液面比胶面高待液面比胶面高0.2cm左右，左右，快速加洗涤液（平衡液），使快速加洗涤液（平衡液），使液面比胶面约高液面比胶面约高1-2cm 调节流速，使进液速度与出液调节流速，使进液速度与出液速度一致速度一致

18、 每每0.5ml收集收集1管，收集管，收集30ml 纯化纯化III-离子交换层析离子交换层析柱材处理柱材处理 DEAE52干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡过夜，去掉悬浮的细干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡过夜，去掉悬浮的细微颗粒微颗粒 0.5 N0.5 N的的HCLHCL溶液中浸泡溶液中浸泡1-2 h1-2 h，无离子水或蒸馏水洗至，无离子水或蒸馏水洗至pHpH值中性或值中性或pH 4pH 4以上以上 0.5 N 0.5 N的的NaOHNaOH溶液中浸泡溶液中浸泡1 12 h2 h，无离子水或蒸馏水将其洗至中性。，无离子水或蒸馏水将其洗至中性。平衡平衡0.02M 0.02M Tris-HClTris-

19、HCl缓缓 冲冲 液液 pH7.4pH7.4（内内 含含0.001M 0.001M EDTAEDTA）平平衡衡，保保持持液液面面比比胶胶面高面高1-2cm1-2cm装柱装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加层析架上，加1/3体积的无离体积的无离子水，打开下出液口，水流畅子水，打开下出液口，水流畅通通 将小烧杯中装有适宜浓度的凝将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液倒入层析柱中，凝胶自然胶液倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部慢慢沉降在层析柱底部 凝胶沉积直到离层析柱上端凝胶沉积直到离层析柱上端1.52 cm处，处，保持液面比胶保持液面比胶面高面高1-2cm，停止装

20、柱，停止装柱纯化纯化III-离子交换层析离子交换层析测定测定考考马马斯斯亮亮蓝蓝G G250250法法测测定定蛋蛋白白质质浓度浓度 邻苯二酚测定邻苯二酚测定PPOPPO活性活性将有活性管合并得将有活性管合并得PPOPPO纯化液纯化液IIIIIIPPOPPO纯化液纯化液III4 III4 保存保存上柱上柱 打开层析柱下端液体出口打开层析柱下端液体出口关闭下端液面出口关闭下端液面出口 将将2ml左右浓缩左右浓缩PPO纯化液纯化液II缓慢加到胶面缓慢加到胶面层析层析 打开下出液口，打开下出液口，待液面比胶面高待液面比胶面高0.2cm左右，左右，加洗脱液进行梯度洗脱，加洗脱液进行梯度洗脱，调调节流速，

21、使进液速度与出液速节流速，使进液速度与出液速度一致度一致 每每0.5ml收集收集1管，收集管，收集30ml洗脱液洗脱液C C1 1：50ml 0.02M Tris-50ml 0.02M Tris-HClHCl缓冲液缓冲液pH7.4pH7.4（内含（内含0.001M 0.001M EDTAEDTA）洗脱液洗脱液C C2 2:50ml 1M NaCL:50ml 1M NaCL 蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定（酶标板）100ul100ul考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250蛋白试剂蛋白试剂 20-100ul20-100ul样品液样品液枪吸打，枪吸打，595nm595nm测定测定 PPO活性测定（活性

22、测定（酶标板）200ulpH5.8200ulpH5.8的的0.2M0.2M磷酸二氢钠磷酸二氢钠 0.1M 0.1M柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 2.5ul2.5ul 0.05M0.05M邻苯二酚溶液邻苯二酚溶液枪吸打枪吸打30 30 预热预热3-5min3-5min2.5-50ul 2.5-50ul 样品样品枪吸打枪吸打410nm410nm测定测定 0min,2min 0min,2min值值感受态细胞制备感受态，就是细菌吸收转化因子（周围环境中的DNA分子）的生理状态 制备高效转化的感受态细胞的方法是：在冰浴中，用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚砜、

23、二硫苏糖醇（DTT）或用氯化已胺钴处理制备感受态细胞。感受态机理假说：局部原生质体化假说细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。酶受体假说感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。实验证据发芽的芽孢杆菌容易转化；E.coli 的原生质体不能被噬菌感染，却能受噬菌体DNA转化；dg不能转化，但完整的DNA可以转化，这可能是DNA能产生溶解细胞壁的酶；适量的溶菌酶能提高转化效率。蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；在细胞分裂过程中，一直都有原生质化产生，但感受态只在生长对数期的后期出现；现已分离到感受态因

24、子，能使非感受态细胞转变为感受态细胞。转化细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一个细菌菌株的个细菌菌株的DNADNA，而导致外观形态特征和某些行为，而导致外观形态特征和某些行为特征发生遗传性改变的生命过程。特征发生遗传性改变的生命过程。热激后，受体菌温浴目的，使其表达足够蛋白，以热激后，受体菌温浴目的，使其表达足够蛋白，以便能在含抗菌素的琼脂培养板上生长菌落。便能在含抗菌素的琼脂培养板上生长菌落。重组质粒重组质粒DNA转化不同的受体菌，有着不同的转转化不同的受体菌，有着不同的转化效率。化效率。重组分子越大，转化效率越低。如果应重组分子越大，转化效率

25、越低。如果应用较大的基因片段制备基因文库，困难较多，成功率用较大的基因片段制备基因文库，困难较多，成功率较低。较低。在在100ng/100l以下的以下的DNA浓度范围内，转化效浓度范围内，转化效率与率与DNA分子数成正比关系。分子数成正比关系。重组重组DNA分子没有甲基化选用限制系统即酶缺分子没有甲基化选用限制系统即酶缺陷型菌株。防止重组陷型菌株。防止重组DNA被菌体内酶降解被菌体内酶降解 转化的是双链转化的是双链DNA，l吸附在细胞表面的是双链吸附在细胞表面的是双链DNA，但以单链但以单链DNA进入进入细胞。细胞。l只有闭环只有闭环DNA（CC）与开环与开环DNA（OC）的转化，的转化，才能

26、获得转化子，用线性质粒才能获得转化子，用线性质粒DNA（L）进行转化不能进行转化不能得到转化子得到转化子lDNA分子转化的复杂过程如下：分子转化的复杂过程如下：吸附吸附完整的双完整的双链链DNA分子吸附在受体菌的表面。分子吸附在受体菌的表面。转入转入双链双链DNA分子解链。单链分子解链。单链DNA进入受体菌，另一链降解。进入受体菌，另一链降解。自稳自稳外源质粒外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链分子在细胞内又复制成双链环状环状DNA。表达表达供体基因随同复制子同时复制，供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。并被转录、翻译。l。：大肠杆菌在LB平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于L

27、B培养基中摇瓶培养大肠杆菌到对数期(37 200RPM 3-4小时，如从冰箱中保存平板中挑取的菌落，则到对数期时间可能要到6-7小时)：取1ml培养物7000rpm,离心1min.收集菌体，冰浴放置 ：用预冷的氯化钙悬浮菌体，7000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置（可不离心，直接倒掉）：用预冷的氯化钙1ml悬浮菌体，冰浴，7000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置 ：加入200l预冷氯化钙，放置于冰浴，即得感受态细胞,此细胞可现用,也可在4保存1周，或分装于无菌离心管中,投入液氮,快速冷冻然后储于-70保存注意：在本操作流程的前几步中，每次离心后，应尽量将上清液去除干净，以防L

28、B培养基的污染现制感受态细胞可直接使用现制感受态细胞可直接使用;b:;b:冻存感受态冻存感受态细胞在手心缓慢融化细胞在手心缓慢融化.2:2:加入待转化外源加入待转化外源DNA(40ngDNA(40ng左右左右)，冰浴，冰浴30min30min。3:423:42热冲击热冲击1 1分分3030秒秒4 4：冰浴：冰浴5min5min5 5：加入：加入1mlLB1mlLB液体培养基，液体培养基，3737保温保温4545分钟分钟1 1小时。小时。6 6：取：取2020200ul200ul菌悬浮液，涂布于有选择压菌悬浮液，涂布于有选择压力的力的LBLB培养基上（本实验中为培养基上（本实验中为100ug/m

29、l100ug/ml的安的安卞青霉素培养基），卞青霉素培养基），保温过夜。保温过夜。温浴后加菌液到培养基上同时加入温浴后加菌液到培养基上同时加入4ulIPTG,20ulX-gal(4ulIPTG,20ulX-gal(如用兰白斑筛选）如用兰白斑筛选）转化效率每转化效率每ugDNAugDNA经遗传转化所能形成菌落的总数。经遗传转化所能形成菌落的总数。将将1ug/ul1ug/ul质粒质粒1:1001:100稀释稀释,1ul,1ul用于用于100ul100ul感受态细胞转化。用感受态细胞转化。用LBLB稀释到稀释到1000ul1000ul后，用后，用100ul100ul铺板。培养过夜，产生铺板。培养过夜

30、，产生10001000个菌落。个菌落。转化率为：转化率为：产生菌落的总数产生菌落的总数/铺板铺板DNADNA的总量。的总量。10001000克隆克隆X10ng/1 ng DNAX10ng/1 ng DNA（转化用）（转化用）/ug=10/ug=106 6cfu/ugcfu/ug氨苄青霉素抗性的转化体可将氨苄青霉素抗性的转化体可将内酰胺酶分泌到培养基中，内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生迅速灭活菌落周围区域中的抗生 Ehrlich(1979)Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于曾表明细胞可以于在在CaClCaCl2 2溶液中保存溶液中保存24-4824-48小时，在贮存的最初小时，在贮存的最初12-2412-24小时内，转化效率增加倍，然小时内，转化效率增加倍，然后降低到初始水平后降低到初始水平 转化效率影响因素转化效率影响因素待转化待转化DNADNA的浓度、纯度、构型的浓度、纯度、构型感受态细胞感受态细胞 活细胞数不应超过活细胞数不应超过10108 8细胞细胞ml ml 转化条件转化条件