SDSPAGE蛋白凝胶电泳.pptx

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1、实验流程配胶配胶样品制备样品制备电泳（电泳（1.52h）染色（染色（20min）脱色（脱色（30min2h）分析分析配分离胶配分离胶(下胶下胶)配浓缩胶配浓缩胶(上胶上胶)第2页/共51页实 验 过 程1.1.装配装置装配装置BG-verMINI型迷你垂直电泳槽(北京百晶)第3页/共51页2.2.凝胶配制凝胶配制 实 验 过 程*Acr*Acr有神经毒有神经毒 性性下胶下胶下胶下胶(分离胶分离胶分离胶分离胶)10%)10%上胶上胶上胶上胶(浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶)5%)5%HH2 2OO3.9ml3.9ml3.4ml3.4ml30%Acr-Bis30%Acr-Bis3.3ml3.3ml0.8

2、3ml0.83mlBufferBuffer(含含含含SDS)SDS)(1.5M Tris-Cl pH8.8)(1.5M Tris-Cl pH8.8)2.6ml2.6ml(1M Tris-Cl pH6.8)(1M Tris-Cl pH6.8)0.68ml0.68ml10%APS10%APS200200m m m ml l l l100100m m m ml l l lTEMEDTEMED1010m m m ml l l l1010m m m ml l l lTOTALTOTAL10ml10ml5ml5ml第4页/共51页加入分离胶溶加入分离胶溶加入分离胶溶加入分离胶溶液液液液 pH 8.8pH

3、8.8pH 8.8pH 8.8封水或饱和封水或饱和封水或饱和封水或饱和正丁醇溶液正丁醇溶液正丁醇溶液正丁醇溶液出现明显界面时，出现明显界面时，分离胶凝聚完成（分离胶凝聚完成（1020min）倒出水或正丁醇，倒出水或正丁醇，并用加样枪并用加样枪/滤纸滤纸吸干吸干v制备分离胶制备分离胶(下胶下胶)封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。第6页/共51页分离胶分离胶分离胶分离胶pH 8.8pH 8.8pH 8.8pH 8.8加入浓缩胶溶加入浓缩胶溶液液 pH 6.8pH 6.8v制备浓缩胶制备浓缩胶(浓缩胶浓缩胶)样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入

4、,梳梳口处不得有气泡口处不得有气泡,梳底需梳底需水平。水平。插入样品梳插入样品梳第7页/共51页1.1.SDS2.2.-mercaptoethanol 3.3.bromophenol blue4.4.GlycerolSample buffer样品处理样品处理ssSHSH金属金属浴浴(100)中中15minSample buffer第8页/共51页加入电极缓冲加入电极缓冲液液pH 8.3pH 8.3浓缩胶浓缩胶pH 6.8pH 6.8通电通电通电通电分离胶分离胶pH 8.8pH 8.8加入样品加入样品v上样及电泳上样及电泳开始电压恒定在开始电压恒定在开始电压恒定在开始电压恒定在80V80V80V

5、80V，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为120V120V120V120V，溴酚，溴酚，溴酚，溴酚蓝距凝胶边缘约蓝距凝胶边缘约蓝距凝胶边缘约蓝距凝胶边缘约5mm5mm5mm5mm时，停止电泳。时，停止电泳。时，停止电泳。时，停止电泳。第10页/共51页Staking gelSeparating gel第11页/共51页电 流 路 径负极负极正极正极内槽内槽外槽外槽凝胶凝胶外槽外槽第12页/共51页实 验 过 程5.5.5.5.染色、脱色染色、脱色A.染色染色20分钟分钟B.脱色30分钟至2小时考马斯亮兰考马斯亮兰R250第13页/共51页蛋白质的染色

6、方法氨基黑 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳考马斯亮兰R-250，G250 G250测定蛋白含量银染 敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳第14页/共51页聚聚 合合 原原 理理()n()n()n()n()n+*Acr*Acr有神经毒有神经毒 性性n决定了交联度与浓度一起决定孔径的大小过硫酸铵是催化剂TEMED是加速剂蛋白质是29：1核酸是19：1第15页/共51页实 验 原 理1 1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。电荷电荷电荷电荷 分子大小分子大小分子大小分子大小 分子形状分子形状分子形状分子形状第16页/共51

7、页实 验 原 理浓缩效应浓缩效应Cl-Gly-Cl-Gly-Cl-Gly-PH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-主要离子主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Gly-Gly-Pr-Pr-Pr-PH8.8第17页/共51页Pr为什么带负电加加 样样 缓缓 冲冲 液液二硫键二硫键盐键盐键疏水作用疏水作用氢键氢键巯基乙醇巯基乙醇断二硫键断二硫键SDS断化学键断化学键带负电荷带负电荷甘油甘油SDS：Pr=1.4:1NC氨基酸侧链氨基酸侧链SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-促沉促沉溴酚兰溴酚兰Tris?第18页/共51页实 验 原 理浓缩效应

8、浓缩效应Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Pr-Pr-Pr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.8快慢离子的产生高的电压梯度Pr-运动加速第19页/共51页实 验 原 理浓缩效应浓缩效应Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子主要离子氯离子甘氨酸离子(pI 5.97)蛋白质离子Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.85%10%快慢离子的产生高的电压梯度Pr-运动加速浓缩效应第20页/共51页第21页/共51页实 验 原 理分子筛效应分子筛

9、效应pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加无快慢离子Pr-根据分子量运动分子筛效应Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-第22页/共51页实 验 原 理分子筛效应分子筛效应pH6.8主要离子主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加无快慢离子Pr-根据分子量运动分子筛效应Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-Gly-Gly-

10、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-第23页/共51页实 验 原 理分子筛效应分子筛效应pH6.8pH8.85%10%lgMw电泳迁移率lgMw=-bx+KPr Mw在11.7-165Kd第24页/共51页实 验 原 理分子筛效应分子筛效应pH6.8pH8.85%10%迁移率迁移率=蛋白质移动的距离蛋白质移动的距离脱色后的胶长脱色后的胶长染色前胶长染色前胶长指示剂移动的距离指示剂移动的距离第25页/共51页实 验 原 理迁移率迁移率=“蛋白质移动的距离蛋白质移动的距离”指示剂移动的距离指示剂移动的距离染色前染色前染色后染色后蛋白质的带在哪呢？蛋白质的带在哪呢？L1L2L3L4LxL1 X

11、L3L2 X L4第26页/共51页PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.第27页/共51页976644292014MarkerMarker第30页/共51页Tanon-1600Tanon-1600数码凝胶图像分析系统数码凝胶图像分析系统GIS 1D GIS 1D 图像分析软件图像分析软件(Ver.4.00)(Ver.4.00)第31页/共51页诱导前后蛋白表达差异IPTG诱导表达Hi

12、s-GFP融和蛋白（31.9kD）。1为诱导前，26分别为诱导0.5,1,1.5,2,2.5hrs。第32页/共51页电泳过程中的不正常现象电泳过程中的不正常现象1“微笑”现象指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。第33页/共51页2 皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。第34页/共51页3“拖尾”现象样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大 解决办法：加样前离心选择合适的样品缓冲液和

13、凝胶缓冲液加增溶试剂降低凝胶浓度第35页/共51页4“纹理”现象样品中的不溶性颗粒引起的解决办法：增加溶解度离心除去不溶性颗粒第36页/共51页5 偏斜现象电极放置不平行或加样位置偏斜引起第37页/共51页6-2 整块胶分离的条带太宽 主要是未浓缩好的原因 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确（6.7）；适当降低电压；6-1 某一条泳道条带太宽加样量太多或者加样孔泄露引起第38页/共51页7.“鬼带”“鬼带”就是在跑大分子、构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致

14、使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。第39页/共51页谢谢!第40页/共51页附：蛋白质的提取与定量方法蛋白质提取不同来源，不同的方法第41页/共51页提 取 原 则细胞的破碎合适的裂解液一般在冰上进行加入适当的蛋白酶抑制剂第42页/共51页哺乳类细胞的裂解液-RIPA50 mM Tris-HCl(pH 7.4

15、),150 mM NaCl,1%NP-40（乙基苯基聚乙二醇，常用非离子性去垢剂）,0.1%SDS第43页/共51页蛋白酶抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂靶蛋白酶靶蛋白酶靶蛋白酶靶蛋白酶PMSF PMSF 苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶EDTAEDTA金属蛋白酶金属蛋白酶金属蛋白酶金属蛋白酶Leupeptin Leupeptin 亮肽素亮肽素亮肽素亮肽素丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶Aprotinin Aprotinin 抑肽酶抑肽酶抑肽酶抑肽酶胰蛋白酶及糜蛋白酶胰蛋白酶及

16、糜蛋白酶胰蛋白酶及糜蛋白酶胰蛋白酶及糜蛋白酶Pepstatin Pepstatin 抑肽素抑肽素抑肽素抑肽素天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶第44页/共51页定量方法紫外吸收法BCA法Lowry法Bradford法第45页/共51页以双缩脲为基础的方法1.BCA法bicinchoninic acid二奎啉甲酸法第46页/共51页以双缩脲为基础的方法2.lowry法 folin酚法 磷钨酸和磷钼酸 钨蓝、钼蓝BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍 0.005-0.10 mg/ml 第47页/共51页Bradford法考马斯亮蓝G250染色法此法根据蛋白质与染料相结合的

17、原理设计的。与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在595nm处有最大光吸收值灵敏度25 g/ml200 g/ml第48页/共51页SDSSDSTritonTriton-X100-X100TweenTween20,60,8020,60,80EDTAEDTADTTDTT -巯基巯基巯基巯基乙醇乙醇乙醇乙醇BCABCA5%5%5%5%5%5%10mM10mM1mM1mM 1mM1mMBradfBradfordord0.1%0.1%0.1%0.1%0.06%0.06%5mM5mM 1M 1M 注意各方法适用条件范围第49页/共51页选择蛋白质定量方法时应考虑实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所花费的时间等。第50页/共51页感谢您的观看。第51页/共51页