酶法测定血清甘油三酯能否消除游离甘油的影响..pdf

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1、酶法测定血清甘油三酯能否消除游离甘酶法测定血清甘油三酯能否消除游离甘油的影响油的影响冯仁丰黄晓岚摘要现有酶法测定试剂不能去除血清中的游离甘油，使甘油三酯值偏高。尽管反应系统中不存在脂蛋白脂酶，但随着样品和反应系统预孵育时间的延长，再加入脂蛋白脂酶后，甘油三酯的测定值逐渐下降。说明现有酶法测定系统不能扣除血清中游离甘油对甘油三酯测定的影响。关键词甘油三酯游离甘油酶法Can the free glycerol interference be eliminated in engymaticdetermination of serum triglyceridesFeng Renfeng,Huang X

2、iaolan（Shanghai Centre for Clinical Laboratory,Shanghai.200052.）It is demonstrated that the free glycerol interference cannot beeliminated accurately in current enzymatic analysis of serumtriglycerides.In our experiments,the time for incubating serum andthe first reagent which was short of lipoprote

3、in lipase was extended.The content of triglycerides determinated after the second reagent(lipoprotein lipase)was added decreased with the time for incubationextended.Key wordsTriglyceridesFree glycerolmethod with enzyme目前国内外普遍采用系列工具酶试剂作血清甘油三酯测定。常见反应步骤如下1：除了样品中因溶血、黄疸等对本法检测甘油三酯(TG)有影响外，普遍认为血清中游离甘油(FG)

4、是结果偏高的原因。国内于 1995 年提出了中华医学检验学会推荐方法2。方法将反应试剂分为双试剂。其中脂蛋白脂酶和 4-氨基安替比林组成第二试剂，其余部分为第一试剂。血清先和第一试剂作用，由于没有脂蛋白脂酶，血清中甘油三酯不会水解为游离甘油，仅血清中游离甘油被氧化，产生过氧化氢。又因反应体系中没有 4-氨基安替比林，过氧化氢不能作用呈色，被内耗。经一段反应时间后，加入第二试剂，催化甘油三酯水解，并经系列酶作用，比色测定，由此消除游离甘油对测定的影响。但是本实验报告说明，推荐的二步酶法反应中，在脂蛋白脂酶缺如情况下，甘油三酯也会自发解离，造成以后甘油三酯测定结果偏低。材料和方法一、材料1.标准液

5、上海长征康仁医学科学有限公司生产的含甘油 2.5 mmol/L 的标准液。2.血清血清 1：新鲜病人血清。血清 1 中加入不等量鸡蛋黄，调匀，使内含甘油三酯量有中度增高，为血清 2；或使内含甘油三酯量有较大增高，为血清 3。3.试剂(1)试剂 A本试剂按中华医学会推荐法配制：Tris-HCl 缓冲液每升内含 Tris 0.15 mmol(pH7.6)、2，4-二氯苯酚 2.5mmol、MgSO4 10 mmol、胆酸钠 3.5 mmol、Triton X-100 0.1 g、ATP 1.0mmol。酶溶液 I将 GK 500 U、GPO 3000 U、POD 1000 U 配制于 Tris-H

6、Cl 缓冲液 50 ml 中。酶溶液 II将 LPL 3000 U、4-氨基安替比林 1 mmol 配制于 Tris-HCl 缓冲液 50 ml 中。应用试剂 R1酶溶液 I 5 ml 加 Tris-HCl 缓冲液 45 ml，混匀而成。应用试剂 R2酶溶液 II 5 ml 加 Tris-HCl 缓冲液 45 ml，混匀而成。(2)试剂 B除 4-氨基安替比林 1 mmol 溶解于酶溶液 I 中，而不是酶溶液 II 中，其他均同试剂 A 配制法。4.仪器日本津岛 UV-2201 紫外分光光度计二、方法1.各试剂均保温于 37 水浴中，恒温使用。2.分光光度计预热，并使比色杯恒温至 37。3.用

7、试剂 A 的测定法试剂空白测定：在洁净比色杯内加入试剂 R1 2 ml,试剂 R2 2ml，混匀，于 500 nm 处对水读取吸光度 AB。试剂标准(S)测定：在洁净比色杯内加入试剂 R1 2 ml，试剂 R2 2ml，甘油标准液 40 l，混匀，37 反应 10 min 后，于 500 nm 处对水读取吸光度，减去 AB 为标准吸光度 As。各血清测定：每份血清作 5 次测定。每次在比色杯中加入试剂 R1 2ml、血清 40 l，立即混匀，计时，分别于 37 预孵育 0、5、15、30、60min 后加入试剂 R2 2 ml，混匀，37 反应 10 min 后，于 500 nm 处对水比色读

8、取吸光度，各减去 AB，分别为 AU0、AU5、AUI5、AU30、AU60。4.用试剂 B 的测定法试剂空白测定(AB)同试剂 A。标准测定(AS)同试剂 A。各血清测定：每份血清作 5 次测定。每次先在比色杯内加入试剂 R1 2ml、血清 40 l，立即混匀，计时，分别于 37 预孵育 0、5、15、30 和 60后，加试剂 R2 2ml，立即混匀，计时，并于 500 nm 处对水读取吸光度，减去AB 即为加 R2 的即刻吸光度 A。加入 R2 后，在 37 条件下反应 10 min，再对水读取吸光度，减去 AB，即为加 R2 10 min 后的吸光度 A。观察每份血清和试剂 R1 反应的

9、吸光度变化：在比色杯内加入试剂 R12 ml、血清 40 l，混匀，37 反应 60 min，于 500 nm 处每隔 5 min 对水读取吸光度，作吸光度光度动态变化观察，共反应 60 min。实验结果测定管 TG 含量按下式计算：(测定管 A/标准管 A)标准管含量一、使用试剂 A空白吸光度 AB：0.008 A，标准管吸光度 AS：0.451 A测定血清的结果(见表 1)：表 1随试剂 A 中 R1 与血清预孵育时间的延长，测得 TG 含量下降情况 R1 与血清预孵育时间(min)0 5 15 30 60血清1 吸光度(A)0.247 0.237 0.197 0.143 0.107TG

10、含量(mmol/l)1.52 1.31 1.09 0.79 0.59占 0 min 值的百分数(%)100 86 72 52 39血清2 吸光度(A)0.584 0.482 0.367 0.240 0.176TG 含量(mmol/l)3.24 2.67 2.03 1.33 0.98占 0 min 值的百分数(%)100 83 63 41 30血清3 吸光度(A)0.868 0.773 0.645 0.552 0.337TG 含量(mmol/l)4.81 4.28 3.58 3.06 1.86占 0 min 值的百分数(%)100 89 74 64 39二、使用试剂 B空白吸光度 AB：0.00

11、4 A 标准管吸光度 AS：0.453 A。测定血清的结果见表 2，延长孵育时间的 A 值，见表 3。表 2随试剂 B 中 R1 与血清预孵育时间的延长，测得加 R2 时剩余 TG 含量下降情况 R1 与血清预孵育时间(min)0 5 15 30 60血清1 加 R2 即刻的吸光度(A)0.010 0.044 0.081 0.116 0.202加 R210 min 后的吸光度(A)0.297 0.292 0.286 0.278 0.253即刻与 10 min 时的吸光度差值 A(A)0.287 0.248 0.205 0.162 0.051 A 换算成 TG 含量(mmol/l)1.58 1.

12、37 1.13 0.89 0.28血清2 加 R2 即刻的吸光度(A)0.029 0.073 0.158 0.238 0.306加 R2 后 10 min 时的吸光度(A)0.585 0.543 0.556 0.537 0.498即刻与 10 min 时的吸光度差值 A(A)0.556 0.470 0.398 0.299 0.192 A 换算成 TG 含量(mmol/l)3.07 2.59 2.20 1.65 1.06血清3 加入 R2 即刻的吸光度(A)0.041 0.081 0.263 0.323 0.494加入 R2 后 10 min 时的吸光度(A)0.879 0.831 0.840

13、0.809 0.751即刻与 10 min 时的吸光度差值 A(A)0.838 0.750 0.577 0.486 0.257 A 换算成 TG 含量(mmol/l)4.62 4.14 3.18 2.68 1.42表 3试剂 B 中 R1 与血清预孵育 60 min 内吸光度(A)变化情况时间(min)血清 1(A)血清 2(A)血清 3(A)0 0.030 0.060 0.0925 0.074 0.061 0.09810 0.167 0.135 0.22915 0.229 0.209 0.35020 0.275 0.286 0.46425 0.310 0.345 0.56530 0.335

14、0.397 0.64935 0.356 0.444 0.72740 0.371 0.486 0.79545 0.383 0.522 0.85550 0.392 0.554 0.90555 0.399 0.582 0.94960 0.403 0.606 0.987讨论一、使用试剂 A 的实验中，在加试剂 R2 之前，各血清和试剂 R1 不论反应时间多长，因反应体系中没有 4-氨基安替比林，确实没有呈色。加入试剂 R2后，出现呈色。但是从实验数据中清楚反映出，随着血清和试剂 R1 的反应时间的延长，剩余甘油三酯逐渐减少。反应 5 min 时，平均还有 0 min 时的 86%，到反应了 60 mi

15、n 时，平均只剩下约 36%。曾经用相同的方法测试过含甘油三酯1.13 mmol/l 的标准液，测得结果大致与病人血清的情况相同。二、为了证实甘油三酯的损失是不断解离成游离甘油所致，实验设计了将 4-氨基安替比林加于试剂 R1 中。若甘油三酯在脂蛋白酯酶不存在情况下，仍能不断解离成游离甘油，则随着试剂 R1 和血清预孵育时间的延长，解离的甘油不断被氧化呈色，显色吸光度会不断上升。实验结果说明确实如此。再加入脂酶后检测得到剩余甘油三酯含量逐渐减少。而且 A 和 B 试剂检测的三份血清结果，随试剂 R1 和血清预孵育时间的延长，再加脂酶检测甘油三酯量，下降比例大致相同。由实验结果推测，正常血液内含

16、有的游离甘油也许是体内甘油三酯解离平衡量。在测定时，有意地去除甘油，会促使甘油三酯自行加快解离，产生新的甘油。因此，国内现有推荐方法建议去除游离甘油对测定甘油三酯影响的做法，不仅克服不了游离甘油的影响，还会使原甘油三酯结果偏低。这也可能是国外为何不对扣除游离甘油列为甘油三酯测定的推荐意见。若真的要去除游离甘油的影响，看来还得使用经典的抽提法作为第一步，然后检测抽提去除甘油三酯后的血清内甘油量，从血清甘油三酯总量中减去这部分结果，方可获得可靠的真甘油三酯量，这还须由实验予以验证。(本文得到上海长征康仁医学科学有限公司陈雄教授等的指导和帮助，特此感谢。)黄晓岚，上海大学生物化学工程专业实习生冯仁丰

17、（上海市临床检验中心200052）黄晓岚（上海市临床检验中心200052）参考文献1Fossati P,et al,Serum triglycerides determinedcolorimetrically with an enzyme that produces hydrogen peroxide.ClinChem,1982;2820772杨昌国，李清华，许叶，等中华医学会检验学会血脂测定推荐方法三血清甘油三酯测定二步酶法(草案).中华医学检验杂志，1995；18(4)2493李健斋.血浆(清)甘油三酯测定方法综述.中华医学检验杂志，1987；10(2)1194Cole TG,Glycerol blanking in triglyceride assays:Is Itnecessary?Clin Chem,1990;3612675临床分析方法大全，第 10261037 页6杨昌国，李清华，许叶酶法测定甘油三酯的若干问题.上海医学检验杂志，1992；7(3)173