铁过载对原代神经元发生衰老的改变,人体生理学论文.docx

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1、铁过载对原代神经元发生衰老的改变,人体生理学论文摘 要： 目的 研究铁过载对原代神经元发生衰老的影响。方式方法 取大鼠原代中脑腹侧神经元进行体外培养，随机分为对照组和实验组，实验组给予100mol/L枸橼酸铁铵(FAC)处理24 h,对照组用不含FAC的培养液进行处理，通过检测细胞衰老相关-半乳糖苷酶活性评估细胞衰老状况。结果 与对照组相比，在100mol/L FAC作用24 h时，实验组原代神经元衰老相关-半乳糖苷酶活性增加(t=18,P 0.05)。结论 铁过载可诱导原代神经元发生衰老。 本文关键词语 : 神经元;铁;细胞衰老; Abstract： Objective To investi

2、gate the effect of iron overload on the senescence of primary neurons. Methods Primary ventral midbrain neurons of rats were cultured in vitro and were randomly divided into control group and experimental group. The experimental group was treated with ferric ammonium citrate(FAC)(100 mol/L) for 24 h

3、, and the control group were treated with the medium without FAC. Cell senescence was evaluated based on the activity of -galactosidase associated with cell senescence. Results Compared with the control group, the experimental group had a significant increase in the activity of -galactosidase associ

4、ated with cell senescence after being treated by 100 mol/L FAC for 24 h(t=18,P 0.05). Conclusion Iron overload can induce the senescence of primary neurons. Keyword： neurons; iron; cell senescence; 帕金森病是世界第二大神经退行性疾病，典型病理特征是黑质致密带多巴胺能神经元进行性丢失，-突触核蛋白的聚集和铁沉积1,2,3。越来越多的证据表示清楚铁沉积会导致多巴胺能神经元死亡，铁过载是神经元死亡的诱因此

5、非结果4,5。除了能够通过氧化损伤途径促进多巴胺能神经元死亡，大量的铁能够促进-突触核蛋白的表示出6,可以从蛋白翻译后水平影响其磷酸化7,8,促进蛋白聚积，进而损伤神经元9,10。随着年龄增加，多种器官发生铁聚积，脑内铁沉积随之不断加剧11,过量铁导致的氧化水平升高又会进一步引发铁蛋白释放12。细胞衰老是细胞无法进入细胞周期而处于停滞状态，是防止细胞不受调控持续增殖的机制，主要表现为炎性因子的分泌、-半乳糖苷酶活性增加以及衰老相关分泌表型13。随着年龄的增加，衰老细胞在体内逐步累积，衰老的细胞部分丧失生理活性，影响机体正常生理功能。在主要的神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病以及亨廷顿症病人

6、脑内均发现了衰老的神经元和胶质细胞14,15。在疾病状态下的神经元也会出现衰老现象，据文献报道，在射线诱导的小鼠胚胎成纤维细胞衰老模型中，衰老细胞的铁水平是正常细胞的30倍之多16。另有研究发现，神经毒素百草枯可诱发与帕金森病相关的细胞衰老和神经病理特征17。近期有研究表示清楚，诱导胚胎干细胞分化的多巴胺能神经元也观察到衰老表型18。已有实验证实，衰老细胞内铁含量明显升高，衰老导致的铁摄取和储存异常会影响铁介导的细胞死亡经过11,16,衰老的细胞若不及时去除，会进一步损伤周围细胞19。为了讨论铁过载能否引发神经元衰老进而引发死亡丢失，本研究用枸橼酸铁铵(FAC)对原代神经元进行处理，检测其衰老

7、发生情况。 1 、材料和方式方法 1.1、 实验材料 FAC(Sigma),胎牛血清(依科赛(澳洲源),SA-Gal染色试剂盒(CST,9860S),DMEM高糖培养液(Gibco, 1210038)以及DMEM/F12培养液(Hyclone, SH30023.01),D-多聚赖氨酸、B27(Gibco),-阿糖胞苷、青链霉素混合液、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(索莱宝)和倒置显微镜(OLYMPUS,IX73)。 1.2、 实验方式方法 1.2.1、 中脑腹侧原代神经元培养 将深度麻醉的孕1214 d的Wistar大鼠用医用乙醇喷洒消毒后，用手术剪沿大鼠的腹中线剪开至腹腔完全暴露

8、，用镊子取出串珠样胚胎，放在预冷的DMEM培养液中，迅速转移至超净工作台上。用尖镊将胎鼠剥离出来，先在解剖显微镜下将中脑组织块取出转移至新鲜的DMEM培养液中，再在镜下修剪掉多余组织块和血管膜，保存蝴蝶状腹侧，参加适量胰蛋白酶，置37 培养箱中孵育消化，5 min后参加终止液终止消化。用1 mL移液枪轻柔地吹打尽量使组织块分散，静置片刻后汲取上清至50 mL离心管中，重新参加新鲜的DMEM培养液5 mL,重复上述步骤3次。将上清以1 000 r/min离心5 min后弃上清，参加含有B27的DMEM/F12完全培养液，轻轻吹打成均匀的单细胞悬液，接种到12孔板上，每孔1105个细胞，放入细胞培

9、养箱中培养，1 d后更换一半培养液，此后每隔2 d更换新鲜培养液，7 d后成熟的神经元可用于后续实验。经-阿糖胞苷处理，神经元纯度达90%以上，符合实验要求。 1.2.2 、实验分组及处理 将细胞随机分为对照组和实验组。实验组细胞参加100 mol/L的FAC作用24 h, 对照组细胞用不含FAC的低血清培养液进行处理。 1.2.3、 细胞衰老相关-半乳糖苷酶活性检测 应用SA-Gal染色试剂盒检测细胞衰老相关-半乳糖苷酶活性。FAC处理24 h后，用0.01 mol/L PBS润洗细胞2次，每次30 s, 每孔细胞参加1 mL固定液，室温固定15 min, 用0.01 mol/L PBS冲洗

10、细胞2次，每次30 s, 弃掉洗液，每孔参加1.5 mL染色液，用封口膜密封细胞培养板防止染液蒸发，置37 恒温箱中孵育过夜。用0.01 mol/L PBS润洗细胞2次，每次30 s, 在奥林巴斯倒置显微镜明场下观察并获取图像，阳性细胞显示为亮蓝色。 1.3、 统计学分析 应用GraphPad Prism软件进行统计学分析。计量资料结果以x?s表示，两独立样本比拟采用t检验。以P 0.05表示差异有统计学意义。 2、 结 果 与对照组相比拟，实验组细胞衰老相关-半乳糖苷酶阳性染色明显加强(图1),对照组着色细胞比例为(2.0770.440)%,实验组着色细胞比例为(25.2001.164)%,

11、两组比拟差异具有统计学意义(n=3,t=18,P 0.05)。提示100 mol/L FAC作用于原代神经元24 h,细胞衰老相关-半乳糖苷酶活性增加，表示清楚100 mol/L FAC能够诱导原代神经元发生衰老。 3 、讨 论 铁是维持生命活动的关键微量金属元素之一，在中枢神经系统中发挥重要作用，介入脑内线粒体呼吸、轴突髓鞘化以及神经递质的构成12。铁作为活泼金属，可以以催化多种生化反响，增加氧化应激，过量的活性氧损伤细胞膜、核酸及蛋白构造，引发细胞毒性20。枸橼酸是铁的天然螯合剂，枸橼酸铁为枸橼酸与铁离子构成的铁盐，是美国食品和药物管理局(FDA)批准的补铁药剂21。本实验所用的FAC是枸

12、橼酸铁更具溶解性的形式，添加FAC可模拟高铁环境，以讨论铁过载对神经元细胞衰老的影响。 对于体外培养细胞的衰老研究，衰老相关的-半乳糖苷酶的活化是常用的生物学特征22,23。-半乳糖苷酶是溶酶体水解酶，通常在pH值为4时表现出活性；而在衰老的细胞中，pH值为6时有活性，利用-半乳糖苷酶底物进行染色，就能从正常细胞中区分出衰老细胞24。本实验采用100 mol/L FAC处理原代神经元24 h,观察到-半乳糖苷酶的阳性染色明显加强，提示细胞衰老的发生。 越来越多的证据表示清楚，铁稳态失衡促进神经退行性疾病的发展25,26,27,28,铁沉积是帕金森病一个主要的病理特征，也是人们普遍以为的发病诱因

13、。有研究证实，细胞内铁过载会增加氧化复原水平29,30,促进-突触核蛋白的聚积，进而发挥细胞毒性作用，如二价铁能够通过与-突触核蛋白mRNA的C端ASP-121、Asn-122、Glu-123位结合，在转录水平促进-突触核蛋白表示出，可以以在转录后水平介入蛋白磷酸化等修饰经过，促进蛋白聚集发挥细胞毒性作用31,32,并且-突触核蛋白寡聚经过产生活性氧是铁依靠性的33。铁过载增加细胞内氧化应激水平可能是诱导衰老的重要机制。本实验结果表示清楚，铁过载会诱发神经元衰老，这为后续进行神经元变性死亡研究提供了新的思路。但处于衰老状态的神经元细胞是通过何种通路逐步死亡丢失，神经元衰老与当前已经知道凋亡、坏

14、死和铁死亡之间能否存在因果或先后关系，衰老在神经元变性死亡经过中的详细机制还有待进一步的研究讨论。 图1 光学显微镜下衰老相关-半乳糖苷酶染色检查 A:对照组(20倍);B:实验组(20倍);C:对照组(40倍);D:实验组(40倍)。 以下为参考文献 1HE N Y,LANGLEY J,HUDDLESTON D E,et al.Increased iron-deposition in lateral-ventral substantia nigra pars compacta: apromising neuroimaging marker for Parkinson s diseaseJ.N

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