乳酸脱氢酶活力测定.ppt

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1、乳酸脱氢酶活力测定目的要求n（1）学习LDH活力测定原理；n（2）测定动物肌肉组织提取液LDH活力及比活力。原理n乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）广泛存在于动物、植物及微生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化如下反应：n LDH n乳酸 +NAD+丙酮酸+NADH+H+n pH7.4-7.8nLDH可溶于水或稀盐溶液，可制备组织匀浆，经浸泡、离心，得上清为组织提取液。LDH测定方法很多，紫外分光光度法最为简便快速。鉴于NADH和NAD+在340nm和260nm处有各自最大吸收峰值，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，

2、定量测定酶的含量。n本实验反应液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340nm处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义为：在25 ，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位，定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。试剂与器材n材料：n动物的肌肉、肝、心、肾等组织。n匀浆缓冲液：n10m mol/L pH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。n酶活力测定试剂：n（1）0.1mol/L pH7.5 磷酸缓冲液(PB)100ml；n（2）NADH溶液：3.5mg纯NADH以0.1m

3、ol/L pH7.5 PB 1ml稀释。n（3）丙酮酸溶液：2.5mg丙酮酸钠，以以0.1mol/L pH7.5 PB 29ml稀释。n试剂（2）（3）最好在临用前配制。操作方法n（一）制备肌肉匀浆n（二）LDH活力测定n（三）蛋白质含量测定n（四）数据处理（一）制备肌肉匀浆n取瘦猪肉（或兔肉）一块除去脂肪及筋膜等，称取20g，按W/V=1/4比例加入4预冷的10m mol/L pH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒至烧杯中，置4冰箱提取过夜，过滤后的红色液体为组织提取液，量总体积。（二）LDH活力测定n实验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放

4、在25 水浴中预热。取2只光径为1cm的石英比色皿，在一只比色皿中加入0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液3ml，置紫外分光光度计中，于340nm处调A值为0；另一只比色皿用于测定LDH活力，依次加入2.9ml丙酮酸溶液、0.1ml NADH溶液，加盖摇匀后测定A340nm，然后加入经稀释（20倍）的酶液10l，立即计时，每隔0.5min测A340nm，连续测定3min。以A对时间作图，取最初线性部分，计算 A340nm/min减少值。（三）蛋白质含量测定n将组织提取液稀释适当倍数（约1：20），取0.1ml按Folin-酚法测定蛋白质含量。（四）数据处理n每毫升组织提取液中LDH活力单位

5、：nLDH比活力n 总LDH活力（U）n比活力（U/mg）=n 总蛋白含量（mg）n A340nm/min 稀释倍数nLDH活力单位（U）/ml提取液=n 酶液加入量（10l）10-3n提取液中LDH总活力单位=LDH活力（U）/ml 总体积注意事项1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，应贮存在-20 低温冰箱中。2、酶液的稀释度及加入量应控制A340/nm下降在0.1-0.2之间，以减少实验误差，加入酶液后应立即计时，准确记录每隔0.5min A340下降值。3、NADH溶液应在临用前配制，如其纯度为75%，则应折合到100%，增加试剂的称量。加酶液前NADH A340控制在0.8左右。思考题n简述用紫外分光光度计测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。