DNA重组技术的基本工具定稿.ppt

《DNA重组技术的基本工具定稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA重组技术的基本工具定稿.ppt（38页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题一专题一 基因工程基因工程（分子水平操作）（分子水平操作）识别双链识别双链识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种分子的某种分子的某种分子的某种特定的核苷酸特定的核苷酸特定的核苷酸特定的核苷酸序列序列序列序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中，并且使每一条链中，并且使每一条链中特定切点特定切点特定切点特定切点的两的两的两的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。断开。断开。主要主要主要主要是从是从是从是从原核生物中原核

2、生物中原核生物中原核生物中分离纯化出来的一分离纯化出来的一分离纯化出来的一分离纯化出来的一种酶。种酶。种酶。种酶。能将外源的能将外源的能将外源的能将外源的DNADNA切断，使之失效，切断，使之失效，切断，使之失效，切断，使之失效，达到保护自身的目的达到保护自身的目的达到保护自身的目的达到保护自身的目的。由于这种切割作。由于这种切割作。由于这种切割作。由于这种切割作用是在用是在用是在用是在DNADNA分子分子分子分子内部内部内部内部进行的，故名进行的，故名进行的，故名进行的，故名限制限制限制限制性核酸内切酶。性核酸内切酶。性核酸内切酶。性核酸内切酶。4000种。种。1、来源：、来源：2、种类：、

3、种类：3、作用：、作用：4、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端形成两种末端形成两种末端一、一、“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶黏性末端黏性末端平末端平末端二、基因的针线二、基因的针线DNADNA连接酶连接酶DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶有何连接酶有何相同点和不同点？相同点和不同点？连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为到的，称之为Ecoli连接酶连接酶。另一种是从。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为噬菌体中分离得到，称为T4连接酶连接酶。DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶连接连接DNA链链双链双链单链单链连接

4、部位连接部位在两在两DNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3末端的末端的羟基上，形成磷羟基上，形成磷酸二酯键酸二酯键三、基因的载体“分子运输车”载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。、具有某些标记基因，便于进行筛选。4、对受体细胞无害、对受体细胞无害载体的作用：载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。、将外源基因转移

5、到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。制。常用的载体有：常用的载体有：质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等噬菌体的衍生物，动植物病毒等能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制是切割和插入是切割和插入位点位点有标记基因的存有标记基因的存在，将来可用含在，将来可用含青霉素的培养基青霉素的培养基鉴别。鉴别。质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够菌中，是细菌染色体外能够自主复制自主复制的很小的的很小的环状环状DNA分分

6、子子，大小只有普通细菌拟核，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。的百分之一。实际操作的质粒实际操作的质粒一般都是人工改一般都是人工改造过的造过的基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）从基因文库中获取

7、）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_、_ _、_._.原理原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万

8、倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNA

9、DNA双链双链DNADNA链链二、基因表达载体的组成：二、基因表达载体的组成：a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因三、三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染

10、色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交2、蛋白质工程的基本途径、蛋白质工程的基本途径预期的蛋白质功能预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）（基因）

11、注意：注意：基因决定基因决定蛋白质，蛋白质，蛋白质工蛋白质工程最终要程最终要改造改造基因基因来完成来完成细胞工程的概念 细胞工程是指应用细胞生物细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，学和分子生物学的原理和方法，通过通过细胞水平细胞水平或或细胞器水平细胞器水平上的上的操作，按照人们的意愿来改变细操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。的一门综合科学技术。细胞工程细胞工程植物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程专题二专题二 细胞工程细胞工程植物细胞工程的理论基础是：植物细胞工程的理论基础是：植物细胞的全能性植物细

12、胞的全能性植物细胞工程常用的技术是植物细胞工程常用的技术是 植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交概念：概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成代细胞形成完整个体完整个体的潜能。的潜能。原因：原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种全部是生物体的每一个细胞都含有该物种全部遗传信息。遗传信息。植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞脱分化脱分化（又叫去分化）（又叫去分化）愈伤组织愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化再分

13、化幼根或芽等器官（胚状体）幼根或芽等器官（胚状体）植物体植物体植物组织培养的条件：植物组织培养的条件：适宜的养料和激素适宜的养料和激素(生长素和细胞生长素和细胞分裂素），分裂素），适宜的温度和无菌条件适宜的温度和无菌条件植物体细胞杂交过程植物细胞植物细胞A植物细胞植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体原生质体A原生质体原生质体B原生质体融合原生质体融合杂合的原生质体杂合的原生质体再生出细胞壁再生出细胞壁杂种细胞杂种细胞脱分化脱分化再分化再分化愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株（杂交成功的标志）（杂交成功的标志）植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比

14、较比较比较项目项目细细胞融胞融合的原合的原理理细细胞融胞融合的方合的方法法诱导诱导手段手段用用 途途杂交后杂交后细胞的细胞的名称名称植物植物体体细细胞胞杂杂交交动动物物细细胞胞融合融合细细胞胞膜膜的的流动流动性、细性、细胞全能胞全能性性去除去除细细胞壁胞壁后后诱导诱导原原生生质质体体融合融合细细胞膜胞膜的的流流动动性性使使细细胞胞分散后分散后诱导细诱导细胞融合胞融合离心、离心、电电激、振激、振动动、聚乙二醇聚乙二醇等等诱导剂诱导剂同上，再同上，再加加灭灭活的活的病毒病毒诱导诱导克服克服远远源源杂杂交交不不亲亲和，和，获获得得杂杂种植株种植株制制备单备单克隆抗克隆抗体的技体的技术术之一之一杂杂种

15、种细细胞胞形成形成杂杂种种植株植株杂交细杂交细胞胞形成形成细细胞胞群群 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射特定抗原注射特定抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交细胞杂交细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体特定抗体的细胞群的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔大量单克隆抗体大量单克隆抗体v单克隆抗体制备需要的条件：单克隆抗体制备需要的条件：v杂交瘤细胞的特点：杂交瘤细胞的特点：v一是能产生专一抗体的一是能产生专一抗体的B淋巴细胞淋巴细胞。v二是能迅速大量繁殖的骨髓瘤细胞二是能迅速大量

16、繁殖的骨髓瘤细胞。v既能迅速大量繁殖，又能产生专一的既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体抗体一一.精子和卵子的发生精子和卵子的发生n（1 1）发生场所：睾丸）发生场所：睾丸n（2 2）时间：）时间：n初情期初情期生殖机能衰老生殖机能衰老1.1.精子的发生精子的发生专题三专题三 胚胎工程胚胎工程精原细胞精原细胞有丝分裂有丝分裂初级精母细胞初级精母细胞次级精母细胞次级精母细胞精子细胞精子细胞精子精子M第一阶段第一阶段第二阶段第二阶段第三阶段第三阶段M精精子子发发生生的的过过程程多个精原细胞多个精原细胞染色体复制染色体复制变形变形精子细胞变形中的主要变化：精子细胞变形中的主要变化：1.1.细胞核细胞

17、核2.2.高尔基体高尔基体3.3.中心体中心体4.4.线粒体线粒体5.5.细胞内其他物质细胞内其他物质精子头的主要部分精子头的主要部分头部的顶体头部的顶体精子的尾精子的尾线粒体鞘膜线粒体鞘膜(尾的基部尾的基部)原生质滴原生质滴(球状球状,最最后脱落后脱落)初情期初情期后后形成形成需要需要变形变形不需不需变形变形睾睾 丸丸 内完成内完成卵子和精子的发生主要不同点：卵子和精子的发生主要不同点：1 1个卵子个卵子和和3 3个极个极体体4 4个精子个精子卵巢卵巢输卵管输卵管内完成内完成胎儿期胎儿期(先天的先天的,出生前出生前)变形变形子细胞的子细胞的数目数目卵卵子子精精子子场所场所发生时发生时间间过程

18、过程连续连续不连不连续续卵子受精的标志：卵子受精的标志：当在当在卵黄膜和透明带卵黄膜和透明带的间隙可以的间隙可以观察到观察到两个极体两个极体时，说明卵子已经完时，说明卵子已经完成了受精。成了受精。受精卵受精卵卵裂期卵裂期桑椹胚桑椹胚囊胚（内含囊胚腔）囊胚（内含囊胚腔）原肠胚（内含原肠腔）原肠胚（内含原肠腔）胎儿形成胎儿形成：在：在透明带内透明带内进行有丝分裂，细胞数量不断进行有丝分裂，细胞数量不断增加，增加，但胚胎总体积并不增加，或略有减少。但胚胎总体积并不增加，或略有减少。：由具有全能性细胞构成，细胞数在由具有全能性细胞构成，细胞数在3232个左右，个左右，排列紧密，形似桑椹排列紧密，形似桑

19、椹内细胞团：发育成胎儿各组织内细胞团：发育成胎儿各组织滋养层细胞：发育成胎膜和胎盘滋养层细胞：发育成胎膜和胎盘：最初发育在输卵管进行有丝分裂最初发育在输卵管进行有丝分裂三、胚胎发育三、胚胎发育外胚层外胚层中胚层中胚层内胚层内胚层 主要包括主要包括 、和和 等几个主要步骤等几个主要步骤 。概念：采取雌性动物的概念：采取雌性动物的 和雄性和雄性动物的动物的 ，使其在，使其在 中受精。中受精。四、体外受精四、体外受精卵细胞卵细胞精子精子试管试管卵细胞的采集卵细胞的采集精子的获取精子的获取受精受精 在体外受精前，要对精子进行获能处理。通常在体外受精前，要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有采用

20、的体外获能方法有 和和 两种。两种。对于对于 、和和 的精子，一般采的精子，一般采用用培养法培养法；对于；对于 、等家畜的精子常用等家畜的精子常用化学法化学法。培养法培养法：精子在：精子在获能液获能液中获能。中获能。化学诱导法化学诱导法：精子一定浓度的：精子一定浓度的肝素肝素或或钙离子载体钙离子载体A23187溶液溶液中，用化学药物中，用化学药物诱导诱导获能。获能。培养法培养法化学诱导法化学诱导法啮齿动物啮齿动物家兔家兔猪猪牛牛羊羊受精受精 获能的精子成熟的卵子（获能的精子成熟的卵子（MII）获能液获能液 受精卵受精卵或或受受精精液液胚胎发育培养液发育培养液六六.胚胎移植胚胎移植供体：供体：提

21、供提供胚胎的个体胚胎的个体。受体：受体：接受接受胚胎的个体。胚胎的个体。（一）概念（一）概念:将雌性动物的早期胚胎将雌性动物的早期胚胎,或者通过或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎体外受精及其他方式得到的胚胎,移植到移植到同种同种的、的、生理状态相同生理状态相同的其他雌性动物的体内的其他雌性动物的体内,使使之继续发育为新个体的技术。之继续发育为新个体的技术。胚胎移植胚胎移植实际上是实际上是生产胚胎的生产胚胎的供体和供体和孕育孕育胚胎的胚胎的受体共同繁殖后代的过程受体共同繁殖后代的过程，是胚胎工，是胚胎工程的程的最后一道最后一道“工序工序”。（二）胚胎移植的生理学基础（二）胚胎移植的生理学基础胚

22、胎移植能否成功，与供体和受体的生理状况有关。胚胎移植能否成功，与供体和受体的生理状况有关。1)1)供体和受体相同的生理环境供体和受体相同的生理环境2)2)早期胚胎处于游离状态早期胚胎处于游离状态,为胚胎的收集提供了可能为胚胎的收集提供了可能3)3)受体对移入子宫的胚胎基本上不发生免疫排斥受体对移入子宫的胚胎基本上不发生免疫排斥4)4)胚胎与受体建立正常的联系胚胎与受体建立正常的联系,但遗传物质没有改变但遗传物质没有改变选择选择供体母牛供体母牛受体母牛受体母牛同期发情处理同期发情处理超数排卵超数排卵供体公牛供体公牛配种配种冲卵冲卵质量检查、培养质量检查、培养胚胎移植胚胎移植妊娠检查妊娠检查分娩（

23、胚胎移植的犊牛）分娩（胚胎移植的犊牛）胚胚胎胎移移植植的的基基本本程程序序七七.胚胎分割胚胎分割1.1.概念概念:采用机械方法将早期胚胎切割成采用机械方法将早期胚胎切割成2 2等份等份,4,4等份或等份或8 8等份等等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的经移植获得同卵双胎或多胎的技术技术.2.2.特点特点:后代具有相同的遗传物质后代具有相同的遗传物质.可看做克隆可看做克隆.3.3.选择的胚胎选择的胚胎:发育良好的发育良好的,形态正常的桑椹胚或形态正常的桑椹胚或囊胚囊胚.4.4.注意点：注意点：对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割内细胞团均等分割。例例1：

24、人体受病毒刺激后，可以产生干扰素，干扰素分为：人体受病毒刺激后，可以产生干扰素，干扰素分为三类，三类，1980年，生物学家成功破译了年，生物学家成功破译了a干扰素的全部遗传干扰素的全部遗传信息，并运用插入质粒的方法，用大肠杆菌生产得到干扰信息，并运用插入质粒的方法，用大肠杆菌生产得到干扰素可以用于治疗肝炎和肿瘤，回答下列问题：素可以用于治疗肝炎和肿瘤，回答下列问题：(1)上述材料中涉及的现代生物技术有上述材料中涉及的现代生物技术有。(2)在利用大肠杆菌生产干扰过程中，目的基因是在利用大肠杆菌生产干扰过程中，目的基因是，所用载体是，所用载体是。表达载体的结。表达载体的结构组成包括构组成包括_ _

25、 。(3)目的基因在大肠杆菌中表达时，必须经过目的基因在大肠杆菌中表达时，必须经过和和过程。过程。基因工程基因工程 干扰素基因干扰素基因 质粒 目的基因 启动子 终止子 标记基因 转录转录翻译翻译n例例2、下图是植物细胞杂交过程示意图，请据图回答：、下图是植物细胞杂交过程示意图，请据图回答：n（1）植物体细胞杂交的第）植物体细胞杂交的第步是去掉细胞壁步是去掉细胞壁,分离出有活力的原分离出有活力的原生质体。目前此步聚最常用的方法是酶解法，也就是在温和的生质体。目前此步聚最常用的方法是酶解法，也就是在温和的条件下用条件下用 等分解植物的细胞壁。等分解植物的细胞壁。（2）过程的发生，必须进行人工诱导

26、。人工诱导原生质体融合过程的发生，必须进行人工诱导。人工诱导原生质体融合的物理方法是：利用的物理方法是：利用 等（至少写出两种）促使等（至少写出两种）促使原质体融合；化学方法是：用原质体融合；化学方法是：用 等试剂作为诱导剂等试剂作为诱导剂诱导融合。诱导融合。（3）表示融合后的原生质体再产生样的细胞壁，新细胞壁的产表示融合后的原生质体再产生样的细胞壁，新细胞壁的产生与细胞内生与细胞内_ _(细胞器细胞器)有密切关系。有密切关系。4）在）在过程中过程中,细胞分裂的主要方式是有丝分裂细胞分裂的主要方式是有丝分裂,此种分裂方式此种分裂方式的重要意义的重要意义(或称特征或称特征)是是_ _。5）植物体

27、细胞杂交在育种工作中具有广泛的应用价值，其突出的）植物体细胞杂交在育种工作中具有广泛的应用价值，其突出的优点是可以优点是可以 。纤维素酶纤维素酶离心、振动离心、振动聚乙二醇聚乙二醇高尔基体高尔基体保持亲子代遗传物质的稳定性保持亲子代遗传物质的稳定性克服远源杂交不亲和障碍克服远源杂交不亲和障碍例3为了加快优良种牛的繁殖速度，科学家采用了以下两种方法。请根据图示信息回答：1）试管牛和克隆牛的培育过程中均用到的细胞工程技术有_。2）用来促进B牛多排卵的激素可能是 分泌的促性腺激素。E牛的性别可能是 。从B牛体内获得的卵细胞需要培养到减数分裂 （时期）才能与获能的精子结合，完成受精作用；卵子受精的标志

28、是在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到 。动物细胞培养和胚胎移植动物细胞培养和胚胎移植 垂体 雌性或雄性 第二次分裂中期第二次分裂中期 两个极体两个极体 3 3）胚胎移植中，需用）胚胎移植中，需用_激素处理接受胚胎植入的母牛。激素处理接受胚胎植入的母牛。胚胎移植的时期最常用的是胚胎移植的时期最常用的是 期和期和 期。若希望期。若希望同时获得多个性状相同的家畜个体，那么可以采取同时获得多个性状相同的家畜个体，那么可以采取 技术。胚胎干细胞通常从胚胎发育过程的技术。胚胎干细胞通常从胚胎发育过程的 期细期细胞分离出来，该细胞的最大特点是胞分离出来，该细胞的最大特点是 。4 4）产生）产生F F牛的理论依据是牛的理论依据是_ _ _，其生殖，其生殖方式属于方式属于_ _ _ _ _。5 5）要培育高产奶率的转基因牛，则目的基因的受体细胞一般是）要培育高产奶率的转基因牛，则目的基因的受体细胞一般是_ _ _ _ _，转基因牛乳腺细胞中含有较多的参与分，转基因牛乳腺细胞中含有较多的参与分泌物加工的泌物加工的_ _ _等细胞器。等细胞器。孕孕 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 胚胎分割胚胎分割 囊胚囊胚 具有全能性具有全能性动物细胞的细胞核具有全能性动物细胞的细胞核具有全能性 无性生殖无性生殖 受精卵受精卵内质网、高尔基体内质网、高尔基体