核酸的凝胶电泳.ppt

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1、第四节第四节 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳Nucleic Acid Gel ElectrophoresisContent of Table 前前 言言一、一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳三、三、脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳前前 言言 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化用于分离、鉴定和纯化DNADNA或或RNARNA片段；片段；优点：优点：（1 1）便于分离）便于分离;（2 2）便于检测）便于检测;（3 3）便于回收：）便于回收：核酸凝胶电泳的基本原理核酸凝胶电泳的基本原理1 1）核酸分子之糖核

2、酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化负离子化状状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；电极方向迁移；2 2）由于在电泳中往往使用由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相

3、同分子量但构型有差异的上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。核酸分子。Home一、一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis（一）凝胶的制备及电泳（一）凝胶的制备及电泳（二）（二）DNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素 1 DNA1 DNA分子的大小分子的大小 双链双链DNADNA分子迁移的速率与其碱基对分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；数的常用对数近似成反比；2 2 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3 DNA3 DNA的构象的构象 一般同一分子：超螺旋环状线

4、状一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状。切口环状。4 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）插入双链）插入双链DNADNA造成其造成其负电荷减少、刚性和长度增加。负电荷减少、刚性和长度增加。5 5 所用的电压所用的电压 低电压时低电压时DNADNA片段迁移率与所用的片段迁移率与所用的电压成正比。电压成正比。6 6 琼脂糖种类琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；熔点琼脂糖；不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/标准琼脂糖标准琼脂糖35389

5、095不同厂家不同厂家生产的不生产的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差异差异40428590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595 修饰的低熔点修饰的低熔点/凝点琼脂糖凝点琼脂糖253563653565 超低熔点超低熔点8154045 低黏性低熔点琼低黏性低熔点琼脂糖脂糖25307038853075不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围片段的范围浓浓 度度（%）标标 准准(kb)高强度高强度(kb)低熔点低熔点(kb)低黏度低低黏度低溶点溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.

6、481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1 7 7 电泳缓冲液电泳缓冲液 常用的有常用的有TAETAE、TPETPE及及TBETBETAE、TPE及及TBE电泳缓冲液比较电泳缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。三者相比：都是常用电泳缓冲液。三者相比：1 1）TAETAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；胶的阳极一侧将发生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；

7、花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3 3）双链线状双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中迁移快中迁移快10%10%；4 4）对于高分子质量的对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或TPETPE，对于低分子质量的，对于低分子质量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的电泳分辨率要好于中的电泳分辨率要好于TBETBE。（二）（二）凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液载样缓冲液：载样缓冲液：临上样到临上样到凝胶加样孔凝胶加样孔之前与待之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液

8、。电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用：1 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；2 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程；3 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。率向阳极迁移。6凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15%Ficoll(Type40

9、0)水溶液水溶液III0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝溴酚蓝440%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液（三）琼脂糖凝胶中（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测的检测 通过染色通过染色,紫外灯下检测。紫外灯下检测。主要有溴化乙锭（主要有溴化乙锭（ethidium bromide,EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。1 凝胶的凝胶的EB染色染色使用使用EB染色注意事项染色注意事项（1）EB被认为是一种被认为是一种强致癌物质强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸 （3 3）EBEB使用时的配制

10、、贮存及使用使用时的配制、贮存及使用 EBEB常用水配制成常用水配制成10 mg/ml10 mg/ml的贮存液，的贮存液，于室温保存在于室温保存在棕色瓶棕色瓶或用铝箔包裹的瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为中，使用终浓度为0.5 0.5 gg/ml/ml 。（4）当要知道当要知道DNA片段准确大小时，片段准确大小时，凝胶应在无凝胶应在无EB情况下电泳，电泳情况下电泳，电泳结束后再用结束后再用EB染色。染色。2 凝胶凝胶SYBR Gold的染色的染色 SYBR GoldSYBR Gold是一种新型极敏感染料的商是一种新型极敏感染料的商品名称。其与品名称。其与DNADNA结合的亲和力高，并结合的亲

11、和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。且结合后，能够极大增强荧光信号。（四）（四）凝胶中凝胶中DNA的成像的成像 可以用透射或入射紫外光对可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝胶成染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。像，图像可以直接输出到计算机观察。（五）（五）凝胶中凝胶中DNA的回收的回收现一般采用试剂盒回收：现一般采用试剂盒回收：存在的主要问题：存在的主要问题：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNA DNA Home二、二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel ele

12、ctrophoresisPAGE 在在TEMEDTEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺)催化催化过硫酸铵过硫酸铵还原还原产生的自由基的存在下，产生的自由基的存在下，丙烯酰胺丙烯酰胺单体的乙烯单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。在双功能交联剂如在双功能交联剂如N N，N-N-亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺的的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。三维带状网格结构。网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。能交联剂的浓度。（一）（一）聚丙烯酰胺凝胶的本质聚

13、丙烯酰胺凝胶的本质CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺）CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺）（二）（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳种类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 1 变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链用于单链DNADNA片段的分离或纯化。片段的分离或纯化。变性的变性的DNADNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。碱基组成及序列完全无关。用途：放射性用途：放射性DNADNA探针的分离、探针的分离、DNADNA测序反应等。测序反应等。2 非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链用于双

14、链DNADNA片段的分离和纯化。片段的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途：制备高纯度的用途：制备高纯度的DNADNA片段。片段。（三）（三）DNADNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的亚甲双丙烯酰胺的浓度为

15、丙烯酰胺的1/301/30;Home三、三、脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE为何选为何选PFGE？超过一定大小的线状双链超过一定大小的线状双链DNADNA分子在分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（极限长度（40kb40kb）后）后DNADNA的迁移速率几的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但强度。但 PEGEPEGE 解决了这一问题。解决了这一问题。（一）（一）PFGE 工作的基本原理工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电

16、场周期性交这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。替进行的。DNADNA分子在交替变换方向的电场中作分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至该法可分离长至5Mb5Mb的的DNADNA分子。严格说来，应分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。叫交替电场凝胶电泳。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图（二）（二）PEGE类型类型垂直脉冲场电泳系统垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field)场翻转系统场翻转系统(field inversion)旋转胶系统旋转胶系统(rotating gel)箝位

17、匀强电场系统箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field)A-+AB-+B垂直交变电场系统垂直交变电场系统场翻转系统场翻转系统箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统旋转胶系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+（三）（三）影响分辨率的因素影响分辨率的因素1 1 脉冲时间脉冲时间（0.1s-1000s)0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2 2 电压：电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。致较小片段泳动的紊乱。3 3 电场夹角：电场夹角：电场方向的夹角常为电场方向的夹角常为1101100 0-120-1200 0，研究证实，研究证实90900 0夹角也非常有效的。夹角也非常有效的。4 4 温度：温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGEPFGE一般应在一般应在4 4 进行。较高的温度进行。较高的温度DNADNA泳泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。的泳动截留和明显的条带变宽。Home