动物细胞培养和核移植技术.ppt

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1、复习回顾：植物细胞工程采用的技术复习回顾：植物细胞工程采用的技术手段有哪些？其理论基础是什么？手段有哪些？其理论基础是什么？所采用技术所采用技术的理论基础的理论基础 植植物物细细胞胞工工程程通通常常采采用用的的技技 术术 手手 段段 植物组织培养植物组织培养 植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞全能性植物细胞全能性历史上的历史上的7878年年7 7月月2626日：第一个试管婴儿诞生日：第一个试管婴儿诞生动动物物细细胞胞工工程程通通常常采采用用的的技技 术术 手手 段段 动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆单克隆抗体抗体核核移植移植是其他动物细胞工程技术的基础。是其他动物细胞工

2、程技术的基础。幼龄动物幼龄动物剪碎组织剪碎组织胰胰蛋蛋白白酶酶处处理理细胞培养细胞培养一、动物细胞培养一、动物细胞培养（一）概念（一）概念就是从动物机体中取出就是从动物机体中取出相关的组织，将它相关的组织，将它分散分散成单个细胞成单个细胞，然后，放，然后，放在适宜的培养基中，让在适宜的培养基中，让这些这些细胞生长和增殖细胞生长和增殖从从年龄看，材年龄看，材料动物有何特料动物有何特点，为什么？点，为什么？要将组织分散要将组织分散成单个细胞，成单个细胞，可怎样处理？可怎样处理？此处细胞在此处细胞在该生活环境中该生活环境中能无限生长和能无限生长和增殖吗？增殖吗？一般为一般为幼龄幼龄动动物或物或胚胎，

3、易胚胎，易于培养于培养，分裂，分裂能力强。能力强。可用可用胰蛋白酶胰蛋白酶处理使之分散处理使之分散成单个细胞。成单个细胞。不能不能。需要定。需要定期转移、分装期转移、分装培养。培养。细胞体外生长的两大特点：细胞体外生长的两大特点：贴壁生长贴壁生长 接触抑制接触抑制细胞贴壁：细胞贴壁：培养液中分散的动物细胞，置于适宜的条件培养液中分散的动物细胞，置于适宜的条件下，会贴附在培养瓶壁上，称为细胞贴壁。下，会贴附在培养瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。附。细胞的接触抑制细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时

4、，细胞当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。制。胶原蛋白酶胶原蛋白酶动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶1010代细胞代细胞原代培养原代培养40-5040-50代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加加培养液培养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质改变改变（二）培养过程（二）培养过程原代培养原代培养 (primary culture(primary culture)定义：把对经胰蛋白酶初次消

5、化得来的细胞定义：把对经胰蛋白酶初次消化得来的细胞的培养称为原代培养。的培养称为原代培养。过程：过程：从动物机体中取出组织从动物机体中取出组织 剪碎剪碎 加胰蛋白加胰蛋白酶酶 细胞游离细胞游离 加培养液加培养液 将细胞将细胞接种到培养瓶接种到培养瓶内内 培养（培养（1212天换一次培养液）天换一次培养液）细胞贴壁生长细胞贴壁生长 长成单层细胞长成单层细胞传代培养传代培养 (subculture(subculture对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再

6、分瓶继续培养，让细胞继续增殖。养，让细胞继续增殖。养，让细胞继续增殖。养，让细胞继续增殖。原理：原理：细胞增殖细胞增殖细胞贴壁过程细胞贴壁过程有关概念有关概念细胞株：细胞株：传代培养的细胞一般传至传代培养的细胞一般传至10代左代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至50代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这改变，使其在培养条

7、件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。思考：思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？细胞培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动

8、物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：独特之处有：1、液体培养基、液体培养基 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新

9、的动物个体新的动物个体 无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、适无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、适宜温度、宜温度、PHPH、气体环境。、气体环境。（三）体外培养动物细胞需要物质和环境条件（三）体外培养动物细胞需要物质和环境条件无菌、无毒的环境无菌、无毒的环境充充足足的营养的营养 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、微量元素、血浆或血清（血浆或血清（保证细胞顺利的生长增殖保证细胞顺利的生长增殖保证细胞顺利的生长增殖保证细胞顺利的生长增殖）对培养液、培养用具进行无菌处理；对培养液、培养用具进行无菌处理；在培养液中加抗生素在培养液中加抗生素；定期更

10、换培养液。定期更换培养液。温度和温度和PHPH 36.50.5 36.50.5；PH=7.27.4PH=7.27.4气体环境气体环境OO2 2和和COCO2 2 含含 95%95%空气空气+5%CO2+5%CO2 混合气体混合气体C02C02的主要作用是维持培养液的的主要作用是维持培养液的PHPH。O2O2的作用使细胞进行有氧呼吸。的作用使细胞进行有氧呼吸。所用装置：所用装置：CO2CO2培养箱培养箱与植物培养基相比其特点是：与植物培养基相比其特点是：（1 1）液体培养基）液体培养基（2 2）含有动物血清）含有动物血清动物体细胞大都生动物体细胞大都生活在活在液体液体的环境的环境 血清中含有蛋白

11、质、氨基酸、葡萄糖、激素等血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附，多种物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附，是动物细胞最理想的天然培养基。因此，动物是动物细胞最理想的天然培养基。因此，动物细胞培养时，通常要添加动物血清。细胞培养时，通常要添加动物血清。（三）动物细胞培养技术的应用（三）动物细胞培养技术的应用大规模的生产有重要价值的生物制品大规模的生产有重要价值的生物制品 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体为基因工程技术提供受体细胞为基因工程技术提供受体细胞 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植有毒物质的

12、检测有毒物质的检测细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供依据症及其他疾病提供依据植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理

13、原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目分化潜能变窄分化潜能变窄：随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。潜能变窄，这是指整体细胞而言。动物细胞特点？动物细胞特点？细胞核仍具有全能性细胞核仍具有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性细胞核，它含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的度分化细胞的细胞核细胞核仍具有全能性仍具有全能性 根据动物细胞核仍具有全能性的特点根据动物细胞核仍具有全能性的特点,怎样

14、将动物细胞的全能性表达怎样将动物细胞的全能性表达?利用动物体细胞核移植技术利用动物体细胞核移植技术二二 动物体细胞动物体细胞 核移植技术核移植技术 克隆技术克隆技术1，动物核移植：，动物核移植：将动物的一个体细胞的细胞核，移入一个已经将动物的一个体细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物最终发育为动物个体。个体。2，克隆动物：，克隆动物：用核移植的方法得到的动物。用核移植的方法得到的动物。3 3，核移植，核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（体细胞核移植

15、（难度高难度高）受体细胞：受体细胞：M中期的卵母细胞中期的卵母细胞细胞分化程度低，细胞分化程度低，恢复全能性容易恢复全能性容易卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。的物质。多多莉莉与与“母母亲亲”多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程卵细卵细胞胞C母绵羊子宫母绵羊子宫母绵母绵羊羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移细胞核移植植胚胎移植胚胎移植早期胚胎早期胚胎多莉羊多莉羊分娩分娩卵裂卵裂融合后的卵融合后的卵细胞细胞细胞

16、拆合技术细胞拆合技术妊娠妊娠1 1、谁谁是是“多多莉莉”的的母母亲亲？2 2、“多多莉莉羊羊”是是雄雄还还是是雌雌？3 3、是是否否符符合合孟孟德德尔尔遗遗传传？问问题题供体细胞供体细胞（供核）（供核）细胞培养细胞培养体细胞体细胞注入注入无核卵母细胞无核卵母细胞去核去核卵巢卵母细胞卵巢卵母细胞（M中期：供质）中期：供质）融合融合重组细胞重组细胞构建重构建重组胚胎组胚胎代孕母体代孕母体生出与供体奶牛遗生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛传基础相同的犊牛4，核移植过程，核移植过程手段诱手段诱导激活导激活胚胎移植胚胎移植对比对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操

17、作过程的不同点？作过程的不同点？多莉克隆过程的受体细胞是多莉克隆过程的受体细胞是去核去核卵卵细胞细胞，而高产，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是奶牛的克隆过程的受体细胞是去核去核卵母卵母细胞细胞；多；多莉克隆过程是将供体莉克隆过程是将供体细胞核细胞核注入受体细胞，而高注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体产奶牛的克隆过程是将供体细胞细胞注入受体细胞。注入受体细胞。讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功将供体细胞注入

18、受体细胞，使克隆动物更像将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便供体动物，操作也方便、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。动物提供的细胞。、用于核移植的供体细胞一般都选用传代、用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以内代以内的细胞，为什么？的细胞，为什么？1010代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突

19、变思考题思考题3 3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了动物进行了100%100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNADNA来自供体细胞核，但核来自供体细胞核，但核外还有少部分外还有少部分DNADNA（如线粒体（如线粒体DNADNA）来自受体卵母细胞）来自受体卵母细胞另外，其生活习性还受自身生活环境的影响另外，其生活习性还受自身生活环境的影响体细胞核移植技术的应用前景：体细胞核移植技术的应用前景：1、在畜牧业中可以加、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程速家畜遗传改良的进程2、保

20、护濒危物种、保护濒危物种3、医药卫生领域生产、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官医用蛋白质及组织器官的移植的移植4、了解胚胎发育和衰老过程；追、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病踪研究疾病的发展过程和治疗疾病 1、成功率比较低2、大多存在健康问题3、克隆动物食品安全问题2.4体细胞核移植技术存在的问题：体细胞核移植技术存在的问题：1 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是变的细胞是 -（）A A细胞系细胞系 B B细胞株细胞株 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞2 2、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的

21、基础是 -（）（）A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养AD3 3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞是这样的组织细胞 （）A.A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B B具有更强的全能性具有更强的全能性 C.C.取材十分方便取材十分方便 D D分裂增殖的能力强分裂增殖的能力强D 4.4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（）A.A.培养基不同；培养基不同；B.B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。养成植株。A