双向电泳的.ppt

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1、双向电泳的双向电泳的技术流程和样品制备技术流程和样品制备史须史须北京大学人类疾病基因研究中心北京大学人类疾病基因研究中心基因组学与蛋白质组学l基因组学：l蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。l上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究了细胞的分子架构，又都在各自的水平上提供了增强对方效应的信息，因此二者存在有很强的且带有系统性相互关系。Applications of proteomicsl Protein identification/characterization l Protein-pro

2、tein interaction l Post-translational modifications l Subcellular location l Elucidation of pathway l Target validation and toxicology l Drug discovery蛋白质组分析的首要要求l将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。l2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白

3、样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新新蛋白质的发现蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋

4、白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽肽指纹图指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定双向电泳分析中的样品制备制备原则制备原则：l应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。l防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。l防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。l完全

5、去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。l尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。待研究蛋白的可检测性。可溶性样品可溶性样品 固体组织样品固体组织样品 细胞细胞不同样品的基本处理方法不同样品的基本处理方法样品的分级处理样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。样品的溶解l是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。l溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白

6、质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂：变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂T

7、riton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。起载体作用的两性电解质：起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w

8、/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。样品液的准备标准液：ReagentAmount8M urea47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O50mM DTT or2mM TBP385mg or 500ul of 200mM TBP stock4%CHAPS2g0.2%carrier ampholytesSee next table0.0002%bromophenol blue100ul of 0.1%stockddH2OTo 50mlIPG pH Range

9、Bio-Lyte Ampholyte(stock)rangeBio-Lyte Ampholyte(stock)Conc.(w/v)Sample Solution VolumePer 5mlSample Solution VolumePer 50ml3-103/1040%25l250 l4-74/640%12.5 l125 l5/740%12.5 l125 l3-63/540%25 l250 l4/640%12.l125 l5-85/840%25 l250 l7-107/940%12.5 l125 l8/1020%25 l250 l Suggested Bio-lyte ampholyte co

10、mposition for IPG useReagentAmount7M urea4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O2M Thiourea760mg2mM TBP50ul of 200mM TBP stock4%CHAPS200mg0.2%carrier ampholytesSee table0.0002%bromophenol blue10ul of 0.1%stockddH2OTo 5mlMultiple chaotropic agent solution preparationReagentAmount5M urea2.9ml of 8.

11、5 stock or 1.5g urea in 3ml H2O2M Thiourea760mg2mM TBP50ul of 200mM TBP stock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrier ampholytesSee table40mM Tris24.2mg0.0002%bromophenol blue10ul of 0.1%stockddH2OTo 5mlMultiple surfactant solution preparation样品中核酸的去除样品中核酸的去除l对电泳的影响：对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。l解

12、决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。亚蛋白质组样品的制备亚蛋白质组样品的制备l用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。l顺序抽提法：顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含

13、复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。特殊样品的制备特殊样品的制备 低低丰丰度度蛋蛋白白的的分分离离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。l强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑

14、战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。l极端分子量的蛋白质：极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。一维固一维固相相pH梯度等电聚焦梯度

15、等电聚焦（IEF with IPG）：）：lIPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。IPG胶条的重泡胀胶条的重泡胀l泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。l不同的加样方法和加样量会导致最终结果

16、的差异：lProtean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用：l 20mmol/L DTT 垫片的使用：l温度的选择：蛋白载样量蛋白载样量影响影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：胶条对蛋白载样量的因素包括：l待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。l电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。l待研究蛋白的丰度：l样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。lIPG胶条的pH范围：IPG胶条的蛋白质大约载样量胶条的蛋白质大约载样量IPG Strip lengthAnalytical

17、 Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g/125 l200500ug/125 l11cm50200 g/185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 lIPG IEF 中中pH梯度的选择梯度的选择 l常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。预分步预分步收集收集细胞浆细胞浆细胞核细胞核 细胞膜细胞膜核糖体及其他核糖体及其他特定细胞成份特定细胞成份细胞分细胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6

18、pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范围阵列分离范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白低丰度或交叉覆盖蛋白阵列那些亚细胞定位位阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质置的功能蛋白质亚蛋白质组阵列策略的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图3倍3倍聚焦时间的优化聚焦时间的优化 l理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。l聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。l过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造

19、成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。l最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。IEF的基本条件的基本条件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5h

20、r20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid两维间的平衡两维间的平衡 l一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。l但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE是电泳能顺利进行。l建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。如果用TB

21、P代替DTT则只需一步平衡。二维二维SDS-PAGEl同普通SDS-PAGE类似。l但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测的蛋白质的检测理想显色剂的理想显色剂的7Sl安全（safety）：l灵敏（sensitivity）：l简单（simplicity）：l特异性（specificity）：l快速（speed）：l稳定（stability）：l兼容性（synergy）：有机染料和银染有机染料和银染l考染灵敏度为30100ng，线性范围是2

22、0倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。l胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。l胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。l银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。l这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。负负 染染l能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。l结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。l速度快（515min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金

23、属离子就可进行提取来转移蛋白质。l它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。l该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。胶体扩散染料胶体扩散染料l主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。l最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。l这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。有机荧光团染料有机荧光团染料l包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。l这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为2

24、10ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。l这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。l在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。金属螯合染料金属螯合染料l这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。l其中SYPRO Rub

25、y也是一种基于钌的金属发光染料。凝胶的图像处理分析和凝胶的图像处理分析和典型流程典型流程l凝胶图像的扫描：l图像加工：l斑点检测和定量：l凝胶配比：l数据分析：l数据呈递和解释：l2-DE数据库的建立：蛋白质的胶内酶切 包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程 样品制备样品制备 与与IPG胶条水化胶条水化 IPG电泳电泳 与上样缓冲液浸润与上样缓冲液浸润 SDS-PAGE 转转PVDF膜膜 胶内直接染色胶内直接染色 染色染色 取出蛋白点取出蛋白点 胰酶等消化胰酶等消化 浓缩于多孔吸附柱上浓缩于多孔吸附柱上

26、 MALDI-MS肽指纹图肽指纹图 数据库查询数据库查询 蛋白质鉴定蛋白质鉴定 已知已知 反向反向HPLC分离分离 MALDI-MS，PSD片段分片段分析析示知示知 ESI-MS-MS、微测序微测序 实验方法实验方法完整蛋白质（如凝胶分离或完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）色谱纯化蛋白质）肽肽混合物混合物质谱测定肽质量质谱测定肽质量（MALDI-MS,ESI-MS)选择肽段裂解选择肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)计算方法计算方法蛋白质序列数据库（核酸序列翻译数据库）蛋白质序列数据库（核酸序列翻译数据库）肽肽质量质量检索检索：片片1.ppt 未未解析碎片离子检索：解析

27、碎片离子检索：片片2.ppt酶切酶切质谱鉴定蛋白质谱鉴定蛋白质的策略质的策略体外体外 pmol32P蛋白质标记蛋白质标记蛋白质分离蛋白质分离蛋白酶切蛋白酶切2D磷酸化做图磷酸化做图 LC-ESI-MS或或MALDI-MS LC-ESI-MS HPLCIMAC磷酸化氨磷酸化氨基酸分析基酸分析体内体内32P细胞标记细胞标记蛋白酶切蛋白酶切2D磷酸化做图磷酸化做图相关分析相关分析磷酸化位点磷酸化位点分析策略分析策略l非非变变性性2D-PAGE：两两向向均均在在非非变变性性条条件件下下进进行行，这这样样分分离离的的蛋蛋白白质质点点的的等等电电点点和和表表观观分分子子量量同同生生理理条条件件下下获获得得

28、的的这这些些蛋蛋白白的的值值是是一样的；一样的；l非非变变性性/SDS-2D-PAGE：第第一一向向采采用用非非变变性性IEF，之之后后在在2%SDS溶溶液液中中平平衡衡；第第二二向向也也在在SDS存存在在的的条条件件下下进进行行。适适于于分分析析非非共共价键连接的蛋白蛋白间的相互作用。价键连接的蛋白蛋白间的相互作用。l非非变变性性/还还原原/SDS-2D-PAGE：非非变变性性条条件件下下IEF聚聚焦焦，之之后后用用8M尿尿素素5%-ME2%SDS进进行行平平衡衡，再再进进行行第第二二向向SDS-PAG电电泳泳。此此时时分分离离的的蛋蛋白白质质点点可可进进行行点点的的切切取取、蛋蛋白白酶酶消

29、消化化、MALDI-TOF-MS分分析析鉴鉴定定，提提供供关关于于断断裂裂二二硫硫键键连连接接的的多多肽肽的的信息。信息。l变变性性2D-PAGE：样样品品先先用用2%SDS5%-ME95变变性性5min，IEF在在8M尿尿素素1%NP-40条条件件下下进进行行，之之后后胶胶条条用用2%SDS5%-ME平平衡衡，然然后后进进行行SDS-PAGE。该该技技术术适适于于DNA序序列列和和多多肽肽结结构构的的分分析析，或或分分析析被被碳碳氢氢键键连连接接和和其其它它翻翻译译后后修修饰饰所所引引起起的的多多肽肽结结构构微微异异质质性性，但但此此方方式式显显示示的的大大于于100Kd的的蛋蛋白白质质点点少少于于第三种方式第三种方式双向电泳的分类双向电泳的分类